Biology

Muis bijnier Chromaffinecellen Cell Isolatie

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Bijniermerg chromaffin celkweek systemen zijn uiterst nuttig voor de studie van de excitatie-secretie koppeling in een in vitro setting. Dit protocol geeft de methode die wordt gebruikt om de bijnieren ontleden en vervolgens de medullaire regio te isoleren door het strippen van weg de bijnierschors. De vertering van de medulla in enkele chroomaffiene cellen wordt dan aangetoond.

Abstract

Protocol

Afkortingen:
ACC - bijnier Chromaffinecellen cellen, E. Soln - Enzyme Solution, E. DMEM - Verrijkt Dulbecco's Modified Eagle Medium

Voorbereiding
1. Voeg papaïne om de gewenste hoeveelheid van E. Soln (40 eenheden papaïne / 1ml E. Soln.).
2. Activeer papaïne met carbogen voor ongeveer 15 minuten op ijs. Zuurstof Lockes buffer op ijs ook.
Ontleding
1. Gebruik 8-10 weken muis.
2. Voorafgaand aan de spijsvertering te verwijderen zuurstofrijk Locke's buffer en leg ze op ijs.
3. Raadpleeg de video voor dissectie procedure.
4. Eenmaal uitgesneden, plaats klieren in zuurstofrijk Locke's buffer.
De voorbereiding van Gland
1. Verwijder vet uit klier.
2. Strip cortex van de klier.
Enzymatische vertering
1. Steriel filter zuurstof papaïne.
2. Maak vier zwembaden van zuurstofrijk papaïne op een petrischaal.
  1. 3 zwembaden moet ongeveer 100uls.
  2. Een van de zwembaden moet ongeveer 400uls.
3. Was medullae via zwembaden
  1. 1e door de 3 100ul zwembaden.
  2. Vervolgens door de 400ul pool
  3. Pippette 300ul E. Soln en merg stukken uit 400ul zwembad in microfugebuis.
  4. Qrap parafilm op microfugebuis en plaats het in 37 ° C waterbad gedurende 20min.
  5. Vergeet niet door te gaan met zuurstof resterende E. Soln met papaïne.
  6. Na 20 minuten steriel filter meer E. Soln.
  7. Vervang de oude E. Soln baden medullae met nieuw gefilterd E. Soln.
Verwrijvingen
1. Zuig en gooi E. Soln.
2. Was medullae in 1 ml E. DMEM.
3. Zuig en gooi E. DMEM.
4. Voeg 300ul E. DMEM en vermaal 20X met 1 ml tip.
5. Gesneden 200ul tip met een steriele scheermesje.
6. Vermaal 5-10X met cut 200ul tip.
7. Gooi E. DMEM baden medullae stukken. Medium zal bevatten puin.
8. Voeg 300uls verse E. DMEM aan stukken medullae.
9. Vermaal met 200ul tip 20x
10. Pippette E. DMEM tot buis withough medullae stukken microfuge. Medium bevat gratis Accs.
11. Voeg 300uls verse E. DMEM aan stukken medullae.
12. Vermaal medullae met een 23,5 meter injectienaald 20x.
13. Combineer E. DMEM van beide verwrijvingen. Medullae stukken moeten niet aanwezig zijn en moet nu een featherlike uiterlijk.
Plating
1. Microfuge E. DMEM van de laatste twee tritureren stappen voor 2,5 minuten bij 3,7 g s.
2. Resuspendeer pellet in 50uls-200 E. DMEM, afhankelijk van de volgende experimenten.
3. Plaat 10-30uls op een glazen dekglaasje aan.
4. Wacht 15 minuten voor de cellen om zich te houden.
5. Voeg 750uls van E. DMEM.