病毒诱导的基因沉默（VIGS）烟草benthamiana和番茄

Summary

病毒诱导的基因沉默（VIGS）的基因表达击倒在方法的说明

Abstract

RNA干扰（RNAi）是一个非常具体的的由双链^RNA 1引发的基因沉默的现象。这沉默机制使用RNA的监管的两大类：小分子RNA，这是从非蛋白质编码基因和短干扰RNAs（siRNAs）。植物利用RNAi技术来控制转座子和发挥对发育过程中，如花器官的形成和叶的^发展 2,3,4的严格控制。植物也利用RNA干扰抵御感染病毒本身。因此，许多病毒已经进化的基因抑制基因沉默，让他们成功定植其主机^5。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种方法，它利用植物RNAi介导的抗病毒防御机制。在未修改病毒感染的植物的机制是专门针对病毒的基因组。然而，与病毒载体携带来自宿主基因的序列，这个过程可以额外针对相应的主机的mRNA。 VIGS已适应高通量功能基因组学在植物使用的植物病原农杆菌提供，通过其Ti质粒，重组病毒携带整个或部分沉默针对性的基因序列。全身病毒的传播和内源性植物RNAi的机械，其余的照顾。相应的靶基因的dsRNAs生产，然后到21至24个核苷酸的siRNA的核糖核酸酶Dicer的切割。这些siRNAs最终指导的RNA诱导的沉默复合体（RISC）降解目标成绩单^2。

在VIGS已采用不同载体和最常用的是基于对烟草脆裂病毒（TRV）。 TRV是一个双边的病毒，正因为如此，两个不同的答农杆菌株用于VIGS。其中一个进行pTRV1，而另一方面，pTRV2，港口的外壳蛋白和用于^VIGS 6,7序列编码的病毒复制和运动功能。接种benthamiana烟草和番茄幼苗混合两种菌株在基因沉默的结果。内源性的八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的基因，这将导致漂白，沉默是用来作为VIGS的效率控制。但是，应该指出，在番茄的沉默通常小于 N中的有效benthamiana。应始终感兴趣的基因的RNA转录本丰度测量，以确保有效地被下调的靶基因。然而，从北外源基因序列benthamiana可以用他们各自的同源基因沉默番茄，反之亦然^8。

Protocol

第1部分：植物材料

本生烟沉默使用的植物应约2个半周龄时，子叶和第2 - 4片真叶出现。番茄（ 白毛lycopersicum）植物7 - 8天的出现，片真叶时尚未出现。

第2部分：VIGS

第1天

1. 对于每一个实验中，农杆菌窝藏pTRV1，pTRV2，pTRV2 PDS和pTRV2主机靶基因是生长在LB琼脂板与卡那霉素50微克/毫升和100微克/毫升利福平补充。卡那霉素的选择，而利福平这样做的农杆菌pTRV质粒。 2天，在30 ° C孵育板。
   PDS的沉默会导致植物的光漂白和作为一个沉默的效率控制使用。此外，必须克隆到一个pTRV2载体的基因被下调。有网关兼容pTRV2可能有助于克隆的载体，是由刘等人的描述。 （2002年）。

第3天

1. 接种2 - 3毫升与上述每一株抗生素的LB液体培养。晃动在30 ° C孵育16 - 18小时和200 RPM

第4天

1. 接种1：到次要的液体诱导培养基（IM），与卡那霉素，利福平和200微米的乙酰丁香酮（表1，2和3）IM文化，小学文化25稀释。乙酰丁香酮是用来作为一种必需的，而在IM模拟的环境，这种病菌遇到主机质外体的T - DNA ^转移 到植物9农杆菌vir区基因的诱导。孵育，在30 ° C震动20 - 24小时和200 RPM

第5天

1. 收获的细胞，离心10分钟，3000 × G.悬浮在相同体积与10毫米MgCl _2的 10毫米MES的pH值5.5，原有的文化。细胞可能是轻轻振荡，以重悬。
2. 再次为10分钟3000 × G. Centrifugue细胞重悬在半原始文化的音量氯化镁10毫米，10毫米的MES pH值5.5。
3. 每个细菌培养一种细菌悬浮液，准备与外径_为 0.3 600。添加乙酰丁香酮的终浓度为400微米pTRV1文化。
4. 包含pTRV1 pTRV2在1比1的比例（或含有目的基因的pTRV2）混合的文化。还包括一个pTRV2 - PDS控制。请注意，最后的乙酰丁香酮的浓度是现在的200微米，每一种文化是一个外径₆₀₀ 0.15。
5. 标签要保持沉默的基因和实验日期渗透苗。
6. 到每个渗入叶用针戳一个孔。使用1毫升不必要的注射器，渗透到幼苗的菌悬液。番茄，渗透子叶同时为N。 benthamiana，最大的两个片真叶渗透。五毫升每个细菌混合，应足以渗透到15 N 。 benthamiana和25个番茄幼苗。改变，不浇水，直到接种后的第二天植物之间的渗透和手套，以避免交叉污染。
7. 植物都保持在20 - 22 ° C的增长与一个每天16小时的长度和50％RH至少3个半星期之前，他们可能会使用检测室。

第3部分：代表结果

图1显示了一个代表性的实验与 N benthamiana和番茄植株适用于PDS沉默。植物漂白表型特征，观察植物的减少数量的类胡萝卜素。对于PDS沉默的对照植株，漂白开始被看作是尽快为1 ½周后渗透。

图1。PDS控制基因沉默的原因在本生烟（A）和番茄（二）植物漂白。照片是3个半星期后的沉默。

表1。诱导培养基（IM）的制备。

400毫升	蒸馏水2 O
4.88摹	MES（2 - （4啉）乙烷磺酸）
2.5摹	血糖
0.12摹	的NaH 2 PO 4

带上一个DH _{2 O的}最终体积475毫升，并调整pH值至5.6 。高压灭菌器。介质冷却下来后，添加25毫升20X AB盐。

表2。AB盐的制备。

20克	NH 4 CL
6摹	硫酸镁4 · 7H 2 O
3摹	氯化钾
0.2克	氯化钙
0.05摹	FESO 4 · 7H 2 O

带至终体积为1升蒸馏水。高压灭菌。要知道，AB盐作为一个橘黄色粉末沉淀。只要将它们混合以及通过其使用前旋转。

表3。乙酰丁香酮的制备的200毫米。请注意，乙酰丁香酮，应准备的一天，它将被用来。

19.6毫克	乙酰丁香酮（3'，5' -二甲氧基-4' - 羟基苯乙酮）
500μL，	DMSO（二甲基亚砜）

Discussion

病毒诱导的基因沉默是一种方法，允许快速反向遗传筛选。它避免了新一代的T - DNA或转座子介导的基因敲除，这是只有在某些植物如拟南芥和玉米。它也避开了厂房改造耗时的过程，并允许针对多个基因在同一时间，只要他们有足够的同源性¹⁰或不同的主机上的靶序列，同时安排在沉默^载体6，11 。

然而，沉默是没有100％有效，因此，必须小心解释结果时。一个消极的结果可能只是表明剩余的蛋白浓度足以开展其功能无明显的表型后果。此外，一些构造是在沉默比别人更好，所以它始终是最好至少使用两个不同的mRNA区域，每个基因产生的沉默的构造。此外，总有脱靶沉默的可能性，如果有足够的同源性是一个与你的沉默兴建或次级siRNAs，这可能会导致传递的^沉默的基因，制作了12套。这尤其是拥有真正的基因家族。因此，这是非常重要的量化你的目标和脱靶基因的沉默效率，通过RT - PCR或Northern杂交分析。如果选择的方法来估计VIGS的效率，RT - PCR检测引物退火的基因沉默，所以由病毒产生的成绩单也没有放大，结果真正反映了dowregulation针对本地区以外一个特定的内源性基因。

VIGS的效率始终是在 N benthamiana比它在番茄。因此，必须采取谨慎沉默番茄幼苗时。在番茄，关键是选择合适的植物发育阶段，并保持适当的环境条件下，病毒的传播。此外，必须执行每下研究植物基因转录本丰度。此外，通常在番茄VIGS，A.农杆菌菌株GV3101中，而在N。 benthamiana要么GV3101中或GV2260用于^6,13。它可以雇用从另一个物种的异源序列的一个基因，只要有足够的同源性，两者之间的沉默。此外，当构建一个pTRV2靶基因的载体，插入长度应在200到1000 bp的范围内，他们不应该包括homopolymeric地区（如聚一个^尾巴 ） 14。

如果感兴趣的基因携带pTRV2文化成为污染带PDS，时有时无漂白将待观察。相反，植物将有一个较短的身材。因此，关键是尽量减少在实验过程中交叉污染来源，可能你的结果的偏差。