Summary
एक वायरस प्रेरित जीन अभिव्यक्ति की दस्तक नीचे में जीन मुंह बंद विधि (VIGS) का विवरण
Protocol
भाग 1: संयंत्र सामग्री
एन benthamiana मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल पौधों लगभग 2 आधा पुराने सप्ताह जो समय है जब cotyledons और पहले 2 है चाहिए - 4 सच पत्तियों में उभरा है . 8 दिनों के बाद उद्भव, जब सच पत्ते अभी तक नहीं दिखाई है - टमाटर के पौधों (Solanum lycopersicum) 7 इस्तेमाल किया जाता है.
भाग 2: VIGS
1 दिन
- प्रत्येक प्रयोग के लिए, Agrobacterium pTRV1 शरण tumefaciens, pTRV2, pTRV2 - पीडीएस और pTRV2 मेजबान लक्ष्य जीन लेग अगर kanamycin के 50 μg / एमएल और 100 रिफैम्पिसिन के μg / एमएल के साथ पूरक प्लेटों पर उगाए जाते हैं . kanamycin pTRV प्लाज्मिड के लिए चयन जबकि रिफैम्पिसिन Agrobacterium के लिए ऐसा करता है . 30 ° C पर 2 दिनों के लिए थाली को सेते हैं.
पीडीएस के पौधों photobleach मुंह बंद करने का कारण है और एक मुंह बंद दक्षता नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. इसके अलावा, एक pTRV2 सदिश में downregulated जा जीन क्लोन किया जाना चाहिए. वहाँ एक गेटवे संगत pTRV2 वेक्टर जो क्लोनिंग सुविधा हो सकती है और लियू एट अल द्वारा वर्णित है. (2002).
3 दिन
- प्रत्येक उपभेदों के लिए उपर्युक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 3 एमएल लेग के तरल संस्कृति एक 2 टीका लगाना. 18 घंटे और 200 rpm - 16 के लिए 30 ° C पर झटकों से सेते
4 दिन
- एक माध्यमिक तरल प्रेरण (आईएम) kanamycin, रिफैम्पिसिन और 200 सुक्ष्ममापी acetosyringone (1 टेबल्स, 2 और 3) के साथ IM संस्कृति मीडिया में 25 प्राथमिक संस्कृति के कमजोर पड़ने: एक 1 का टीका लगाना. acetosyringone Agrobacterium के वीर जीन जो 9 संयंत्र में स्थानांतरण टी डीएनए के लिए आवश्यक हैं जबकि आईएम पर्यावरण mimics मेजबान apoplast में इस रोगज़नक़ मुठभेड़ों के एक inducer के रूप में प्रयोग किया जाता है. 20 के लिए 30 ° C पर झटकों से सेते हैं - 24 घंटे और 200 rpm
5 दिन
- 3000 x जी में 10 मिनट के लिए centrifugating कोशिकाओं हार्वेस्ट उसी मात्रा है कि मूल संस्कृति के साथ 10 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी एमईएस 5.5 पीएच था में Resuspend है. कक्ष धीरे उन्हें resuspend vortexed सकता है.
- 3000 x जी में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को फिर से Centrifugue 10 MgCl2 मिमी, 10 मिमी एमईएस 5.5 पीएच के साथ मूल संस्कृति की आधी मात्रा में Resuspend.
- प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के लिए एक 600 0.3 के आयुध डिपो के साथ एक जीवाणु निलंबन की तैयारी. PTRV1 संस्कृति से 400 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता acetosyringone जोड़ें.
- PTRV1 और pTRV2 (या ब्याज की जीन युक्त pTRV2) के एक 1 से 1 के अनुपात में युक्त संस्कृतियों मिक्स. इसके अलावा नियंत्रण pTRV2 - पीडीएस शामिल हैं. कृपया ध्यान दें कि अंतिम acetosyringone एकाग्रता अब 200 सुक्ष्ममापी और 0.15 की एक 600 आयुध डिपो में प्रत्येक संस्कृति है कि कृपया.
- जीन खामोश हो और प्रयोग की तारीख के साथ घुसपैठ seedlings लेबल.
- प्रत्येक के लिए एक सुई के साथ घुसपैठ पत्ती में एक छेद प्रहार. 1 एमएल अनावश्यक सिरिंज का उपयोग करने के लिए seedlings में जीवाणु निलंबन घुसपैठ. टमाटर के लिए, दोनों cotyledons घुसपैठ जबकि एन के लिए benthamiana, सबसे बड़ी दो सच पत्तियों घुसपैठ. प्रत्येक जीवाणु मिश्रण के पांच एमएल 15 एन घुसपैठ के लिए पर्याप्त होना चाहिए benthamiana और 25 टमाटर seedlings. घुसपैठ और टीका के बाद अगले दिन तक नहीं पौधों को पानी के बीच दस्ताने बदलने से पार संदूषण से बचें.
- पौधों को 20 में रखा जाता है - 22 ° C एक 16 घंटे के दिन की लंबाई और 50% कम से कम 3 साढ़े सप्ताह के लिए आरएच इससे पहले कि वे assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ एक विकास कक्ष में.
भाग 3: प्रतिनिधि के परिणाम
चित्रा 1 एन के साथ एक प्रतिनिधि के प्रयोग से पता चलता है benthamiana और टमाटर पौधों पीडीएस के लिए चुप हो गए. संयंत्रों विशेषता photobleaching carotenoids के कम मात्रा के साथ पौधों में मनाया phenotype दिखा. पीडीएस - खामोश नियंत्रण पौधों के लिए, 1 के रूप में जल्द से देखा जा शुरू होता है photobleaching साढ़े सप्ताह घुसपैठ के बाद .
चित्रा 1 पीडीएस नियंत्रण जीन का मुंह बंद है. एन benthamiana (ए) और टमाटर (बी) पौधों में photobleaching का कारण बनता है . फोटो 3 साढ़े सप्ताह के मुंह बंद करने के बाद ले जाया गया.
तालिका 1 प्रेरण मध्यम (आईएम) की तैयारी.
| 400 एमएल | आसुत एच 2 हे |
| 4.88 छ | एमईएस (2 - (4 morpholino) एटैन सल्फोनिक एसिड) |
| 2.5 छ | ग्लूकोज़ |
| 0.12 छ | नाह 4 पीओ 2 |
DH 2 हे के साथ एक 475 एमएल के अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ और 5.6 पीएच को समायोजित. आटोक्लेव. बाद मध्यम नीचे ठंडा है, 20X अटल बिहारी लवण की 25 एमएल जोड़ें.
तालिका 2 अटल बिहारी लवण की तैयारी.
| 20 ग्राम | 4 सीएल राष्ट्रीय राजमार्ग |
| 6 छ | MgSO 4 · 7 2 हे |
| 3 जी | KCl |
| 0.2 छ | 2 CaCl |
| 0.05 छ | FeSO 4 · 7 2 हे |
आसुत जल के साथ 1 लीटर के एक अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ. आटोक्लेव. ध्यान रखें कि अटल बिहारी लवण एक नारंगी रंग के पाउडर के रूप में वेग. बस उन्हें मिश्रण अच्छी तरह से उनके उपयोग से पहले घूमता.
तालिका 3 200 मिमी Acetosyringone की तैयारी. कृपया ध्यान दें कि acetosyringone दिन यह प्रयोग किया जाएगा तैयार किया जाना चाहिए.
| 19.6 मिलीग्राम | Acetosyringone (3 ', 5'-Dimethoxy - 4'hydroxyacetophenone) |
| 500 μL | DMSO (डाइमिथाइल sulfoxide) |
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Discussion
वायरस प्रेरित जीन मुंह बंद एक तरीका है कि तेजी से रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन की अनुमति देता है. यह टी डीएनए या transposon मध्यस्थता जीन दस्तक बहिष्कार, जो केवल Arabidopsis और मक्का जैसे कुछ पौधों में उपलब्ध हैं की पीढ़ी से बचा जाता है. यह भी संयंत्र परिवर्तन का समय लेने वाली प्रक्रिया circumvents और एक ही समय में एकाधिक जीन का लक्ष्य बशर्ते कि वे पर्याप्त अनुरूपता 10 या अलग मेजबान लक्ष्य दृश्यों अग्रानुक्रम में मुंह बंद वेक्टर 6, 11 में व्यवस्था कर रहे हैं कि है, की अनुमति देता है है .
हालांकि, मुंह बंद कभी नहीं 100% कुशल है और इसलिए, देखभाल लिया जाना चाहिए जब परिणामों की व्याख्या है. एक नकारात्मक परिणाम केवल संकेत मिलता है कि अवशिष्ट प्रोटीन एकाग्रता स्पष्ट प्ररूपी परिणामों के बिना अपने कार्य के लिए बाहर ले जाने के लिए पर्याप्त था सकता है. इसके अलावा, कुछ constructs दूसरों की तुलना में मुंह बंद करने पर में बेहतर कर रहे हैं तो यह हमेशा उचित है कम से कम दो अलग अलग mRNA क्षेत्रों का उपयोग करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए मुंह बंद constructs उत्पन्न. इसके अलावा, वहाँ हमेशा बंद लक्ष्य मुंह बंद करने की संभावना है अगर वहाँ अपने मुंह बंद के निर्माण के साथ या यदि माध्यमिक siRNAs, जो सकर्मक मुंह बंद करने का कारण हो सकता है एक जीन की पर्याप्त अनुरूपता है, 12 का उत्पादन. यह जीन परिवारों के लिए विशेष रूप से सच धारण. यह अत्यंत महत्व का है इसलिए अपने लक्ष्य और लक्ष्य जीन का मुंह बंद दक्षता यों, या तो RT-पीसीआर या उत्तरी धब्बा विश्लेषण द्वारा. यदि RT-पीसीआर VIGS दक्षता का अनुमान करने के लिए विधि के रूप में चुना है, प्राइमरों की इतनी मुंह बंद है कि वायरस के द्वारा उत्पादित किया जा रहा प्रतिलेख भी नहीं प्रवर्धित परिणाम सचमुच की dowregulation को प्रतिबिंबित करने के लिए लक्षित क्षेत्र के बाहर जीन के लिए पानी रखना चाहिए एक विशेष अंतर्जात जीन.
VIGS दक्षता हमेशा एन में अधिक से अधिक benthamiana से यह टमाटर में है. इसलिए, सावधानी जब टमाटर seedlings मुंह बंद लिया जाना चाहिए. टमाटर में, यह करने के लिए सही संयंत्र विकास मंच का चयन करने के लिए और वायरल प्रसार के लिए उचित पर्यावरण की स्थिति को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, जीन प्रतिलेख बहुतायत के अध्ययन के तहत प्रत्येक संयंत्र के लिए किया जाना चाहिए. इसके अलावा, आम तौर पर टमाटर VIGS में, ए. tumefaciens तनाव एन में GV3101 जबकि benthamiana या तो GV3101 या GV2260 6,13 उपयोग किया जाता है. यह संभव है कि अन्य प्रजातियों से एक heterologous अनुक्रम रोजगार जीन, बशर्ते दोनों के बीच पर्याप्त अनुरूपता है मौन. इसके अलावा, जब एक जीन pTRV2 लक्ष्य वेक्टर निर्माण डालने लंबाई 200 से 1000 बीपी के रेंज में हो सकता है और वे homopolymeric (जैसे पाली एक पूंछ) क्षेत्रों के 14 शामिल नहीं होना चाहिए चाहिए.
यदि pTRV2 हित के जीन के साथ ले जाने संस्कृतियों पीडीएस के साथ दूषित हो जाते हैं, कभी कभी कोई photobleaching मनाया जाएगा . इसके बजाय, पौधों को एक छोटे कद होगा. इसलिए, यह प्रयोग के दौरान पार संदूषण के किसी भी स्रोत को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है जो संभवतः अपने परिणाम पूर्वाग्रह.
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Acknowledgments
हम पांडुलिपि पर उसे बहुमूल्य अंतर्दृष्टि के लिए धन्यवाद डा. पेट्रीसिया Manosalva. अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्लांट जीनोम कार्यक्रम, पुरस्कार संख्या DBI 0605059 द्वारा प्रदान की गई थी.
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