Summary
Описание вирус-индуцированного генов (VIGS) метод нокдауна экспрессии генов в
Abstract
РНК-интерференция (RNAi) является весьма специфический ген глушителей явление вызвано дсРНК 1. Это глушителей механизм использует два основных класса регуляторов РНК: микроРНК, которые производятся из не-гены белков и короткий вмешательства РНК (siRNAs). Растения используют РНК-интерференции для контроля транспозонов и оказывать жесткий контроль за развитием процессов, таких как образование цветка и листьев орган развития 2,3,4. Растения также используют РНК-интерференции, чтобы защитить себя от заражения вирусами. Следовательно, многие вирусы эволюционировали супрессоры генов, чтобы их успешной колонизации хозяина 5.
Вирус-индуцированные генов (VIGS) представляет собой метод, использующий преимущества завода RNAi-опосредованной противовирусных защитный механизм. В растениях инфицированных вирусами немодифицированные механизм специально направлены против вирусного генома. Однако в связи с вирусом переносчиков последовательности основе хост генов, процесс может быть дополнительно направлены против соответствующих мРНК хозяина. VIGS был приспособлен для высокой пропускной способности функциональной геномики растений, используя завод патогена tumefaciens Agrobacterium, чтобы поставить, через свой Ti плазмиды, рекомбинантный вирус проведение всей или части гена предназначен для глушителей. Системная распространения вирусов и эндогенных завод RNAi техники заботиться об остальном. dsRNAs соответствующих генов-мишеней производится, а затем расщепляется рибонуклеазы Dicer в siRNAs от 21 до 24 нуклеотидов в длину. Эти siRNAs в конечном итоге руководство РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC) деградировать целевой стенограммы 2.
Различные векторы были заняты в VIGS и один из наиболее часто используемых на основе вируса табачной погремушкой (ТРВ). TRV является двудольным вируса и, таким образом, две различные А. tumefaciens штаммы используются для VIGS. Один несет pTRV1, который кодирует репликации и движения вирусные функции в то время как другие, pTRV2, гавани белковой оболочки и последовательность, используемая для VIGS 6,7. Прививка Nicotiana benthamiana и рассады томатов со смесью обоих штаммов приводит к генов. Отключение от эндогенных фитоинов десатуразу (ПДС) гена, который вызывает фотообесцвечивания, используется в качестве контроля за эффективностью VIGS. Следует отметить, однако, что в томатном глушителей, как правило, менее эффективны, чем у N. benthamiana. РНК стенограммы обилие интересующего гена всегда должна быть измерена, чтобы целевой ген эффективно было вниз регулируется. Тем не менее, гетерологичных последовательностей генов из N. benthamiana может быть использована, чтобы заставить замолчать их ортологи в томатном и наоборот 8.
Protocol
Часть 1: Завод материал
Н. benthamiana растений, используемых для глушителей должна быть около 2 ½ недель которая когда семядоли и первые 2 - 4 настоящих листьев появились. Томатный (Solanum Lycopersicum) растения используются 7 - 8 дней после появления, когда настоящие листья еще не появились.
Часть 2: VIGS
ДЕНЬ 1
- Для каждого эксперимента, Agrobacterium tumefaciens укрывательство pTRV1, pTRV2, pTRV2-ПДС и pTRV2-хозяин гена-мишени выращивают на LB агаром дополнена с 50 мкг / мл канамицина и 100 мкг / мл рифампицина. Канамицин выбирает для pTRV плазмиды в то время как рифампицин, делает это для Agrobacterium. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 2 дней.
Отключение ПДС вызовет растений photobleach и используется в качестве глушителей эффективности контроля. Кроме того, гены однако снижается должны быть клонированы в pTRV2 вектор. Существует шлюз совместимы pTRV2 вектор, который может облегчить клонирование и описывается Liu и соавт. (2002).
ДЕНЬ 3
- Привить 2 - 3 мл жидкости культуры LB с вышеупомянутыми антибиотиками для каждого из штаммов. Инкубируйте при встряхивании при температуре 30 ° С в течение 16 - 18 часов и 200 оборотов в минуту
ДЕНЬ 4
- Привить 1: 25 разбавления первичной культуры в жидкой среде вторичные индукционные (IM) IM культуры с канамицин, рифампицин и 200 мкМ acetosyringone (табл. 1, 2 и 3). Acetosyringone используется как индуктор вир генов Agrobacterium, которые требуются для Т-ДНК в передаче завода в то время как 9 IM имитирует среду этого патогена встречах в принимающей апопласт. Инкубируйте при встряхивании при температуре 30 ° С в течение 20 - 24 часов и 200 оборотов в минуту
ДЕНЬ 5
- Урожай клеток centrifugating течение 10 минут при 3000 х г. Ресуспендируют в том же объеме, что самобытная культура была 10 мМ MgCl 2, 10 мМ MES рН 5,5. Ячейки могут быть аккуратно перемешивают для ресуспендирования них.
- Centrifugue клетки в течение 10 минут при 3000 х г. Ресуспендируют в половину объема самобытная культура, с 10 мМ MgCl2, 10 мМ MES рН 5,5.
- Подготовка бактериальной суспензии с OD 600 в размере 0,3 для каждой бактериальной культуры. Добавить acetosyringone до конечной концентрации 400 мкМ до pTRV1 культуры.
- Смешайте культур, содержащих pTRV1 и pTRV2 (или pTRV2 содержащего ген интереса) в 1 к 1 отношение. Также включите pTRV2-ПДС контроля. Обратите внимание, что конечная концентрация acetosyringone сейчас 200 мкМ и что каждая культура находится в OD 600 составляет 0,15.
- Этикетка саженцы должны быть проникли с геном молчать и дата эксперимента.
- Пока отверстие в каждый лист быть проникли с помощью иглы. Используйте 1 мл шприца ненужных для проникновения бактериальной суспензии в рассады. Для помидоров, проникнуть как семядоли в то время как для N. benthamiana, проникнуть крупнейших два настоящих листа. Пять мл каждой бактериальной смеси должно быть достаточно, чтобы проникнуть N. 15 benthamiana и 25 рассаду помидор. Избегайте перекрестного загрязнения путем изменения перчатки между инфильтрации и не полива растений, пока на следующий день после прививки.
- Растения хранятся при температуре 20 - 22 ° С в ростовой камере с 16 часов длины дня и относительной влажности 50% в течение по крайней мере, на 3 с половиной недель, прежде чем они могут использоваться для анализа.
Часть 3: Представитель результаты
На рисунке 1 показана представитель эксперимент с Н. benthamiana и томатов замолчать для PDS. Растения показывают характерные фотообесцвечивания фенотип наблюдается у растений с уменьшенным количеством каротиноидов. Для PDS-замолчать контрольных растений, фотообесцвечивания начинает рассматриваться, как только 1 ½ недель после инфильтрации.
Рисунок 1. Отключение гена контроля PDS причины фотообесцвечивания в Н. benthamiana (А) и томатный (B) растений. Фотографии были взяты три с половиной недель после глушителя.
Таблица 1. Подготовка индукционные Средняя (IM).
| 400 мл | дистиллированной H 2 O |
| 4,88 г | MES (2 - (4 морфолино)-этан сульфокислоты) |
| 2,5 г | Глюкоза |
| 0,12 г | NaH 2 PO 4 |
Довести до конечного объема 475 мл с дН 2 O и отрегулировать рН до 5,6. Автоклав. После среда остынет, добавить 25 мл 20X соли АВ.
Таблица 2. Подготовка соли АВ.
| 20 г | NH 4 Cl |
| 6 г | MgSO 4 · 7H 2 O |
| 3 г | KCl |
| 0,2 г | CaCl 2 |
| 0,05 г | FeSO 4 · 7H 2 O |
Довести до конечного объема 1 литра дистиллированной водой. Автоклав. Помните, что AB солей осаждаются в виде оранжевого порошка. Просто смешайте их хорошо закрученной до их использования.
Таблица 3. Подготовка 200 мМ Acetosyringone. Обратите внимание, что acetosyringone должны быть подготовлены день он будет использоваться.
| 19,6 мг | Acetosyringone (3 ', 5'-диметокси-4'-hydroxyacetophenone) |
| 500 мкл | ДМСО (диметилсульфоксид) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вирус-индуцированные генов является метод, который позволяет быстро обратный генетический экранов. Он избегает поколения Т-ДНК или транспозонов опосредованной генной заглушками, которые доступны только в некоторых растениях, как Arabidopsis и кукурузы. Он также обходит трудоемкий процесс трансформации растений и позволяет нападения на нескольких генов в то же время, при условии, что они располагают достаточными гомологии 10 или, что различные последовательности целевого узла расположены в тандеме в глушителей 6 вектор, 11.
Тем не менее, глушителей никогда не 100% эффективным и, следовательно, необходимо соблюдать осторожность при интерпретации результатов. Отрицательный результат может просто указать, что остаточная концентрация белка было достаточно, чтобы выполнять свои функции без явных фенотипических последствий. Кроме того, некоторые конструкции лучше глушителей, чем другие, поэтому всегда рекомендуется использовать как минимум два различных регионах мРНК для создания конструкций глушителей для каждого гена. Кроме того, всегда есть возможность за пределы целевых глушителей, если есть достаточные гомологии гена с глушителей построить или, если вторичные siRNAs, что может привести транзитивного глушителей, производятся 12. Это в особенности справедливо для генной семей. В связи с этим первостепенное значение для количественной оценки эффективности глушителей вашей целевой и вне генов-мишеней, либо ПЦР-анализ или Северной блот. Если RT-PCR выбран как метод оценки эффективности VIGS, один из праймеров должны отжигать на ген за пределами региона, предназначены для глушителей, так что запись производится путем вирус также не усиливается и результаты действительно отражают dowregulation из частности эндогенных генов.
VIGS эффективности всегда больше в Н. benthamiana, чем в помидор. Поэтому осторожность должна быть взята, глушителей рассады томатов. В помидор, очень важно правильно выбрать растение стадии развития и поддержания надлежащего состояния окружающей среды для вирусного распространения. Кроме того, обилие генов стенограммы должны быть выполнены для каждого растения в стадии изучения. Кроме того, обычно в томатном VIGS, А. tumefaciens штамма GV3101 то время как в Н. benthamiana либо GV3101 GV2260 или используются 6,13. Вполне возможно, чтобы заставить замолчать ген использовании гетерологичной последовательности из другого вида, если имеются достаточные гомологии между ними. Кроме того, при построении pTRV2-гена-мишени, вектор, длина вставки должна быть в диапазоне от 200 до 1000 б.п., и они не должны включать в себя гомополимерных регионах (например, поли хвосты) 14.
Если культур проведения pTRV2 с генами интерес подвергнуться заражению ПДС, иногда нет фотообесцвечивания будет наблюдаться. Вместо этого, растения будут иметь невысоких мужчин. Поэтому, крайне важно, чтобы свести к минимуму любые источники перекрестного заражения во время эксперимента, который потенциально может смещения результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Патриция Manosalva для нее ценную информацию о рукописи. Финансирование было предоставлено Национальным научным фондом генома растений Программы, награда число DBI-0605059.
References
- Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17, 449-459 (2001).
- Carrington, J. C., Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science. 301, 336-338 (2003).
- Chen, X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science. 303, 2022-2025 (2004).
- Palatnik, J. F. Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature. 425, 257-263 (2003).
- Brigneti, G. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant Journal. 31, 777-786 (2002).
- MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).
- Senthil-Kumar, M. A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing. New Phytol. 176, 782-791 (2007).
- McCullen, C. A., Binns, A. N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 101-127 (2006).
- Rosebrock, T. R. A bacterial E3 ubiquitin ligase targets a host protein kinase to disrupt plant immunity. Nature. 448, 370-374 (2007).
- Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice. Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).
- Voinnet, O. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci. 13, 317-328 (2008).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Liu, E., Page, J. E. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).
