Detektion av protein Ubiquitination

Summary

Ubiquitination är en viktig posttranslational modifiering som utförts av en uppsättning av tre enzymer. Mutationer av gener involverade i denna förändring är förknippade med många olika mänskliga sjukdomar. Här beskriver vi protokoll för att upptäcka protein ubiquitination i odlade celler

Abstract

Ubiquitination, kovalent bindning av polypeptid ubiquitin till målproteiner, är en viktig posttranslational modifiering som utförts av en uppsättning av tre enzymer. De omfattar ubiquitin-aktiverande enzymet E1, ubiquitin-konjugera enzym E2 och ubiquitin ligas E3. Till skillnad från med E1 och E2, E3 ubiquitin ligases visa substrat specificitet. Å andra sidan, många deubiquitylating enzymer har roller i behandlingen polyubiquitinated proteiner. Ubiquitination kan leda till förändring av protein stabilitet, cellulär lokalisering och biologisk aktivitet. Mutationer av gener involverade i ubiquitination / deubiquitination väg eller ändras ubiquitin systemet att fungera är förknippade med många olika mänskliga sjukdomar, såsom olika typer av cancer, neurodegeneration och metabola sjukdomar. Upptäckten av förändrad eller normal ubiquitination av målproteiner kan ge en bättre förståelse för patogenesen av dessa sjukdomar. Här beskriver vi protokoll för att upptäcka protein ubiquitination i odlade celler

Protocol

Detektion av protein ubiquitination i odlade celler

1. Transfektera odlade celler med plasmider som uttrycker proteinet av intresse och (epitop-märkta versionen av) ubiquitin.
2. Gör komplett buffert cellslys (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) med 2mm natrium orthovanadate, 50 mm natriumfluorid, och proteashämmare.
3. Lyse cellerna med 100 l cellslys buffert per platta (6 cm maträtt). Om en större antenn används, justera volymen. Snurra skålen noga för att låta lyseringsbuffert täcka hela området vuxit celler.
4. Samla cellerna med en cell skrapa och överföra cellen lysates i ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Placera röret på en värmeplatta omedelbart att koka i 10 min.
5. Shear cellerna med en sonication enhet.
6. Lägg 900ul av spädningsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Inkubera prov vid 4 ° C i 30-60 min med rotation.
7. Snurra spädda prover på 20.000 xgi 30 min. Överför den resulterande supernatanten till ett nytt Eppendorf-rör. Var noga med att inte störa pelleten.
8. Mät proteinkoncentration.
9. Förbered Protein A-eller G-agarose pärla antikropp mot målet protein i en kompatibel buffert (50% slurry). Skär smala änden av en P-200 pipettspetsen och överlåtelse 14-20 ìl av harts till 500-1,500 mikrogram av beredda cell lysates för immunoprecipitation. För celler med hög transfektion effektivitet, kommer 500 mikrogram vara tillräckligt. För celler med låg transfektion effektivitet, kan mer protein behövas.
10. Inkubera cellen lysat-pärla blandning vid 4 ° C över natten med rotation.
11. Spinn ner kulorna vid 5000 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten. Tvätta hartset med tvätt buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) två gånger.
12. Snurra pärlor för en sista gång på 20.000 xgi 30 sek. Sug kvarvarande tvättlösningen och koka harts med 2X SDS buffert.
13. Ladda prover på en SDS-PAGE gel för immunoblotting analys.
14. Identifiera ubiquitin och målet protein med respektive antikroppar. För immunoblotting, upptäcker vi vanligtvis ubiquitin först. Membranet kommer sedan att användas för att detektera proteinet fälls ut.

Upptäckt av ubiquitination på målprotein genom In vitro ubiquitination analys

1. Gör 5X ubiquitination buffert (100 mM Tris-HCl, 7,5 pH, 25 mm MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mm ATP). Förvara dem i små alikvoter vid -20 ° C i upp till 6 månader. Vissa protokoll också lägga kreatinfosfat och kreatinkinas i bufferten för ATP regeneration ^1,2.
2. För varje reaktion, förbereda en blandning som innehåller följande:
   

   8 l	5X ubiquitination buffert
   250 ng	ubiquitination E1
   500 ng	ubiquitination E2
   0,5 mikrogram	ubiquitin
   0,5 mikrogram	proteinet av intresse
   	vatten till 40 l totalvolym

   Som kontroller, förbereder liknande reaktioner i avsaknad av antingen E1, E2 eller ubiquitin.
3. Inkubera blandningen vid 37 ° C i 1 timme eller längre.
4. Stoppa reaktionen genom att tillsätta SDS-PAGE prov buffert och koka provet i 10 min.
5. Ladda prover på SDS-PAGE gel för immunoblotting analys.
6. Identifiera ubiquitin och målet protein med respektive antikroppar.

Discussion

I den här presentationen beskrev vi de första stegen som möjligt upptäcka ubiquitin modifiering på ett protein av intresse i odlade däggdjursceller. För att upptäcka ubiquitination specifikt på proteinet av intresse, inte på icke-kovalent interagerande proteiner, använde vi en striktare villkor för cell-lys, immunoprecipitation och tvätt ^1,3. Ubiquitination, upptäcks av immunoprecipitation av målprotein i ett sådant hårda villkor följt av anti-ubiquitin immunoblotting, är därför sannolikt att vara specifika för målprotein. För att förhindra protein deubiquitination under experimentella procedurer kan deubiquitinating enzym-hämmare såsom N-Ethylmaleimide och ubiquitin aldehyd läggas till alla buffertar ^4. Det är dock osannolikt att deubiquitination enzymer vara aktiv efter 10 min kokning förfarande. Starka utstryk eller stegar med hög molekylvikt arter är oftast ett resultat av ubiquitination. Graden av ubiquitination av proteinet av intresse kan bedömas genom att jämföra förhållandet mellan ubiquitinated / omodifierade målprotein i flera experiment förhållanden. Samtidigt är fria ubiquitin molekyler generellt reduceras när ubiquitination av målprotein ökar. Detta protokoll är också användbar för att identifiera andra ubiquitin-liknande liten molekyl modifiering som sumolyation och neddylation.

Vi beskrev också en in vitro ubiquitination analys med hjälp av renad eller rekombinanta proteiner. Olika epitop-märkta ubiquitination komponenter finns kommersiellt tillgängliga. Ubiquitination E3 ligas är inte nödvändigt för ubiquitin konjugering in vitro.