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Biology

La détection des protéines ubiquitination

doi: 10.3791/1293 Published: August 19, 2009

Summary

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture

Abstract

L'ubiquitination, la fixation covalente de l'ubiquitine polypeptide de cibler les protéines, est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Ils comprennent l'enzyme activant l'ubiquitine-E1, E2 enzyme conjuguant l'ubiquitine et ubiquitine ligase E3. Contrairement à E1 et E2, E3 ubiquitine ligases la spécificité de substrat d'affichage. D'autre part, de nombreuses enzymes deubiquitylating ont des rôles dans le traitement des protéines polyubiquitinated. L'ubiquitination peut entraîner un changement de la stabilité des protéines, localisation cellulaire et l'activité biologique. Des mutations de gènes impliqués dans la voie d'ubiquitination / déubiquitination ou altération de la fonction système ubiquitine sont associés à différentes pathologies humaines telles que divers types de cancer, maladies neurodégénératives et les troubles métaboliques. La détection de l'ubiquitination altérée ou normale de protéines cibles peuvent fournir une meilleure compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture

Protocol

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Détection de l'ubiquitination de protéines dans des cellules en culture

  1. Transfecter des cellules en culture avec des plasmides exprimant la protéine d'intérêt et (épitope taggés version de) l'ubiquitine.
  2. Faire complète du tampon de lyse cellulaire (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0) avec orthovanadate de sodium 2 mM, 50 mM de fluorure de sodium, et les inhibiteurs de protéase.
  3. Lyse des cellules avec tampon de 100 cellules lyse ul par plaque (6 vaisselle cm). Si un plus grand plat est utilisé, régler le volume en conséquence. Agiter le plat de soin de laisser le tampon de lyse couvrir toute la zone de cellules cultivées.
  4. Recueillir les cellules avec un racleur de cellules et de transférer les lysats de cellules dans un tube eppendorf de 1,5 ml. Placer le tube sur une plaque chaude immédiatement à bouillir pendant 10 min.
  5. Cisaillement des cellules avec un dispositif de sonication.
  6. Ajouter 900ul de tampon de dilution (10 Triton mM Tris-HCI, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 1%). Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30-60 min avec rotation.
  7. Faites tourner les échantillons dilués à 20.000 xg pendant 30 min. Transférer le surnageant résultant d'un nouveau tube Eppendorf. Attention à ne pas perturber le culot.
  8. Mesurer la concentration en protéines.
  9. Préparer la protéine A ou G-agarose perles conjugué anticorps contre la protéine cible dans un tampon compatible (50% lisier). Coupez l'extrémité étroite d'une pointe P-200 pipette et transférer 14-20 ul de résine 500-1500 mg de lysats de cellules préparées pour immunoprécipitation. Pour les cellules avec une efficacité de transfection élevée, 500 ug sera suffisant. Pour les cellules avec une efficacité de transfection bas, plus de protéines peuvent être nécessaires.
  10. Incuber le lysat cellulaire-billes mélange à 4 ° C pendant la nuit avec la rotation.
  11. Isoler les perles à 5000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Laver la résine avec le tampon de lavage (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) à deux reprises.
  12. Faites tourner les perles pour une dernière fois à 20 000 xg pendant 30 sec. Aspirer le tampon de lavage résiduelle et faire bouillir la résine avec le tampon de chargement SDS 2X.
  13. Charger les échantillons sur un gel SDS-PAGE pour immunoblot analyse.
  14. Détecter l'ubiquitine et la protéine cible avec des anticorps respectifs. Pour immunoblot, nous avons généralement de détecter l'ubiquitine premier. La membrane sera alors utilisé pour détecter les protéines précipitées.

Détection de l'ubiquitination de protéines cibles par le biais d'ubiquitination in vitro dans le test

  1. Faire tampon ubiquitination 5X (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 25 mM de MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM d'ATP). Rangez-les dans de petites aliquotes à -20 ° C pendant 6 mois. Certains protocoles aussi ajouter de la créatine phosphate et la créatine kinase dans le tampon pour régénération de l'ATP 1,2.
  2. Pour chaque réaction, préparer un mélange contenant les éléments suivants:
    8 pl Buffer 5X ubiquitination
    250 ng ubiquitination E1
    500 ng ubiquitination E2
    0,5 pg ubiquitine
    0,5 pg protéine d'intérêt
    l'eau à 40 ul volume total
    Comme témoins, de préparer des réactions similaires en l'absence de soit E1, E2, ou ubiquitine.
  3. Incuber le mélange à 37 ° C pendant 1 heure ou plus.
  4. Arrêter la réaction par addition de tampon échantillon SDS-PAGE et faire bouillir l'échantillon pendant 10 min.
  5. Charger les échantillons sur gel SDS-PAGE pour immunoblot analyse.
  6. Détecter l'ubiquitine et la protéine cible avec des anticorps respectifs.

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Discussion

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Dans cette présentation, nous avons d'abord décrit les étapes qui permettent de détecter la modification d'ubiquitine sur une protéine d'intérêt dans des cultures de cellules de mammifères. Afin de détecter spécifiquement sur ​​l'ubiquitination de la protéine d'intérêt, non pas sur les protéines qui interagissent de façon non covalente, nous avons utilisé une condition stricte pour la lyse cellulaire, immunoprécipitation et de lavage 1,3. L'ubiquitination, détectée par immunoprécipitation de la protéine cible dans un tel état dure suivie par les anti-ubiquitine immunoblot, est donc susceptible d'être spécifique à la protéine cible. Pour éviter déubiquitination protéines pendant les procédures expérimentales, inhibiteurs de l'enzyme désubiquitination comme la N-éthylmaléimide et aldéhyde ubiquitine peut être ajouté à tous les tampons 4. Cependant, il est peu probable que les enzymes déubiquitination reste actif après 10 min procédure d'ébullition. Forte frottis ou des échelles de haute espèces moléculaires sont généralement le résultat d'ubiquitination. Le degré d'ubiquitination de la protéine d'intérêt peut être évaluée en comparant le ratio de protéine cible ubiquitinées / non modifiée dans les conditions de l'expérience de plusieurs. Pendant ce temps, sans molécules d'ubiquitine sont généralement réduits lorsque l'ubiquitination de la protéine cible est augmenté. Ce protocole est également utile pour détecter d'autres ubiquitine-like modification de petites molécules telles que sumolyation et neddylation.

Nous avons également décrit un essai in vitro en utilisant des protéines d'ubiquitination purifiée ou recombinante. Différents composants d'ubiquitination épitope-étiquetés sont disponibles dans le commerce. Ligase E3 ubiquitination n'est pas nécessaire pour la conjugaison d'ubiquitine in vitro.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH RO1 DC006497, RO1 NS057289 et PO1 ES016738 (à Z. Zhang); California Institute for Regenerative Medicine subventions RS1-00331-1 et RL1-00682-1 (à Z. Zhang), la maladie de Parkinson américaine Disease Association (à Z. Zhang et YS Choo) et la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson (Z. Zhang).

References

  1. Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
  2. Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity. Cell. 118, 83-97 (2004).
  3. Didier, C. RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization. Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).
  4. Laney, J. D., Hochsetrasser, M. Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination. Current Protocols in Protein Science. 14.5.1-14.5.11 (2002).
La détection des protéines ubiquitination
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Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293, doi:10.3791/1293 (2009).More

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