प्रोटीन ubiquitination की जांच

Summary

Ubiquitination एक महत्वपूर्ण posttranslational तीन एंजाइमों के एक सेट से बाहर किए गए संशोधन है. इस संशोधन में शामिल जीनों के उत्परिवर्तन के कई अलग अलग मानव रोगों के साथ जुड़े रहे हैं. यहाँ, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं में प्रोटीन ubiquitination का पता लगाने

Abstract

Ubiquitination, पॉलीपेप्टाइड के लिए प्रोटीन लक्ष्य ubiquitin सहसंयोजक लगाव, एक प्रमुख posttranslational तीन एंजाइमों के एक सेट से बाहर किए गए संशोधन है. वे ubiquitin को सक्रिय एंजाइम E1, ubiquitin conjugating एंजाइम E2, और ubiquitin ligase E3 शामिल हैं. E1 और E2, E3 ubiquitin ligases प्रदर्शन सब्सट्रेट विशिष्टता के लिए विपरीत. दूसरी ओर, कई एंजाइमों deubiquitylating polyubiquitinated प्रोटीन प्रसंस्करण में भूमिका है. Ubiquitination प्रोटीन स्थिरता, सेलुलर स्थानीयकरण और जैविक गतिविधि के परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं. मार्ग / ubiquitination deubiquitination या बदल ubiquitin प्रणाली समारोह में शामिल जीनों के उत्परिवर्तन कैंसर, neurodegeneration, और चयापचय विकारों के विभिन्न प्रकार के जैसे कई अलग अलग मानव रोगों के साथ जुड़े रहे हैं. लक्ष्य प्रोटीन की बदल या सामान्य ubiquitination का पता लगाने के इन रोगों के रोगजनन पर एक बेहतर समझ प्रदान कर सकता है. यहाँ, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं में प्रोटीन ubiquitination का पता लगाने

Protocol

प्रोटीन ubiquitination की संवर्धित कोशिकाओं में जांच

1. Transfect plasmids हित के प्रोटीन और (मिलान टैग के संस्करण) ubiquitin व्यक्त के साथ संवर्धित कोशिकाओं.
2. पूरा सेल lysis बफर (2% एसडीएस, 150 मिमी NaCl, 10 Tris - एचसीएल मिमी, पीएच 8.0) 2mm सोडियम orthovanadate, 50 मिमी सोडियम फ्लोराइड, और protease inhibitors के साथ.
3. प्लेट प्रति 100 μl सेल lysis बफर (6 सेमी पकवान) के साथ कोशिकाओं lyse. यदि एक बड़ा पकवान प्रयोग किया जाता है, मात्रा तदनुसार समायोजित. भंवर पकवान ध्यान से जाने के लिए lysis बफर विकसित कोशिकाओं के पूरे क्षेत्र को कवर.
4. एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को ले लीजिए और एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में सेल lysates हस्तांतरण. एक गर्म तुरंत थाली करने के लिए 10 मिनट के लिए उबाल पर ट्यूब रखें.
5. कतरनी एक sonication डिवाइस के साथ कोशिकाओं.
6. कमजोर पड़ने बफर के 900ul (10 मिमी Tris - एचसीएल, पीएच 8.0, 150 मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 1% ट्राइटन) जोड़ें. 4 ° C में रोटेशन के साथ 30-60 मिनट के लिए नमूने सेते हैं.
7. 30 मिनट के लिए 20,000 XG पर पतला नमूने स्पिन. एक नई Eppendorf ट्यूब के परिणामस्वरूप सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. गोली को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें.
8. प्रोटीन एकाग्रता उपाय.
9. एक संगत बफर (50% घोल) में लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ एक या जी agarose मनका संयुग्मित एंटीबॉडी प्रोटीन तैयार करें. P-200 विंदुक टिप की संकीर्ण अंत कट और immunoprecipitation के लिए तैयार सेल lysates के 500-1,500 μg राल के 14-20 μl हस्तांतरण. उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ कोशिकाओं के लिए, 500 μg पर्याप्त होगा. कम अभिकर्मक दक्षता के साथ कोशिकाओं के लिए, अधिक प्रोटीन की जरूरत हो सकता है.
10. ° सी रातोंरात रोटेशन के साथ 4 पर सेल मिश्रण lysate - मनका सेते हैं.
11. नीचे 5 मिनट के लिए 5000 XG पर मोती स्पिन. सतह पर तैरनेवाला Aspirate. धोने बफर (10 मिमी Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच, 1 एम NaCl, 1 मिमी EDTA, 1 एनपी 40%) दो बार के साथ राल धो लें.
12. 30 सेकंड के लिए 20,000 XG पर एक अंतिम समय के लिए मोती स्पिन. अवशिष्ट धोने बफर Aspirate और 2X एसडीएस लोड हो रहा है बफर के साथ राल फोड़ा.
13. एसडीएस पृष्ठ एक जेल पर विश्लेषण immunoblotting करने के लिए नमूने का लोड.
14. Ubiquitin और संबंधित एंटीबॉडी के साथ लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने. Immunoblotting के लिए, हम आम तौर पर ubiquitin पहली बार पता लगाने. झिल्ली तो करने के लिए प्रोटीन उपजी का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाएगा.

Ubiquitination के लक्ष्य प्रोटीन पर इन विट्रो ubiquitination परख में के माध्यम से जांच

1. 5X ubiquitination बफर (100 Tris - एचसीएल मिमी, 7.5 पीएच, 25 MgCl2 मिमी 2.5 मिमी, डीटीटी, 10 मिमी एटीपी). उन्हें छोटे aliquots में 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. कुछ प्रोटोकॉल भी एटीपी उत्थान ^1,2 के लिए बफर में creatine फॉस्फेट और creatine kinase जोड़ें.
2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक निम्न युक्त मिश्रण तैयार:
   

   8 μl	5X ubiquitination बफर
   250 एनजी	ubiquitination E1
   500 एनजी	ubiquitination E2
   0.5 μg	ubiquitin
   0.5 μg	ब्याज की प्रोटीन
   	40 μl कुल मात्रा के लिए पानी

   नियंत्रण के रूप में, या तो E1, E2, या ubiquitin के अभाव में इसी तरह की प्रतिक्रियाओं को तैयार है.
3. 37 में मिश्रण सेते डिग्री सेल्सियस 1 घंटे या उससे अधिक समय के लिए.
4. एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर जोड़ने के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो और 10 मिनट के लिए नमूना फोड़ा.
5. एसडीएस - PAGE जेल पर विश्लेषण immunoblotting करने के लिए नमूने का लोड.
6. Ubiquitin और संबंधित एंटीबॉडी के साथ लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने.

Discussion

इस प्रस्तुति में, हम पहली बार कदम है कि पता लगाने की अनुमति सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रोटीन पर ubiquitin संशोधन का वर्णन किया. आदेश में ubiquitination का पता लगाने के लिए ब्याज की प्रोटीन पर गैर covalently बातचीत प्रोटीन पर नहीं, विशेष रूप से, हम सेल lysis, ^{immunoprecipitation} और 1,3 धोने के लिए कड़े हालत इस्तेमाल किया. Ubiquitination, इस तरह के एक कठोर विरोधी ubiquitin immunoblotting द्वारा पीछा हालत में लक्ष्य प्रोटीन की immunoprecipitation द्वारा पता लगाया है, इसलिए लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट होने की संभावना है. प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन deubiquitination को रोकने के लिए, जैसे एन ethylmaleimide और ubiquitin एल्डिहाइड ^{deubiquitinating} एंजाइम inhibitors सभी 4 बफ़र्स को जोड़ा जा सकता है है. हालांकि, यह संभावना नहीं है कि deubiquitination एंजाइमों 10 मिनट उबलते प्रक्रिया के बाद सक्रिय रहते हैं. मजबूत स्मीयरों या सीढ़ी उच्च आणविक प्रजातियों के आम तौर पर ubiquitination का परिणाम हैं. ब्याज की प्रोटीन का ubiquitination की डिग्री कई प्रयोग की स्थिति में ubiquitinated / असंशोधित लक्ष्य प्रोटीन के अनुपात की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इस बीच, मुफ्त ubiquitin अणुओं आम तौर पर कम कर रहे हैं जब लक्ष्य प्रोटीन की ubiquitination बढ़ जाती है. इस प्रोटोकॉल भी अन्य ubiquitin की तरह छोटे अणु sumolyation और neddylation के रूप में इस तरह के संशोधन का पता लगाने में उपयोगी है.

हम भी इन विट्रो शुद्ध या पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग ubiquitination परख में वर्णित है. विभिन्न मिलान टैग ubiquitination घटकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. Ubiquitination E3 ligase इन विट्रो में ubiquitin संयुग्मन के लिए आवश्यक नहीं है .