Summary
ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明
Abstract
ユビキチン化、タンパク質を標的とするペプチドユビキチンの共有結合は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。彼らは、ユビキチン活性化酵素E1、ユビキチン結合酵素E2、およびユビキチンリガーゼE3が含まれています。 E1とE2のとは違って、E3ユビキチンリガーゼの基質特異性を表示します。一方、多数のdeubiquitylating酵素はポリユビキチン化タンパク質を処理するの役割を担っている。ユビキチンは、タンパク質の安定性、細胞内局在、及び生物学的活性の変化をもたらすことができる。ユビキチン化/脱ユビキチン化経路または変更されたユビキチンシステムの機能に関与する遺伝子の変異は、癌、神経変性、および代謝性疾患の様々なタイプなど、さまざまなヒト疾患に関連付けられています。標的タンパク質の改変されたか、通常のユビキチン化の検出は、これらの疾患の病因に関するより良い理解を提供することがあります。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明
Protocol
培養細胞におけるタンパク質のユビキチン化の検出
- ユビキチン目的のタンパク質を発現するプラスミドを培養細胞をトランスフェクトし、（のエピトープタグ付きバージョン）。
- 2mMのナトリウムオルトバナジン、50mMのフッ化ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤との完全な細胞溶解緩衝液（2％SDS、150mMのNaCl、10mMトリス- HCl、pH 8.0）を行う。
- プレート当たり100μlの細胞溶解緩衝液（6 cmのシャーレ）で細胞を溶解する。大きな皿が使用されている場合は、それに応じて音量を調整します。スワール溶解バッファーは、培養した細胞の全領域をカバーするように慎重に料理を。
- セルスクレーパーで細胞を回収し、1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞ライセートを転送する。 10分間沸騰し、すぐにホットプレートの上にチューブを置きます。
- 超音波処理装置とせん断は、細胞。
- 希釈バッファーの900ul（10mMトリス- HCl、pH8.0の、150mMのNaCl、2mMのEDTA、1％のトリトン）を追加します。回転で30〜60分間4℃でサンプルをインキュベートする。
- 30分、20,000 × gで希釈した試料を回転させる。新しいエッペンドルフチューブに得られた上清を移す。ペレットを乱さないように注意してください。
- タンパク質濃度を測定する。
- 互換性のあるバッファー（50％スラリー）中の標的タンパク質に対してタンパク質またはG -アガロースビーズ標識抗体を準備します。 P - 200ピペットの先端の狭い方の端をカットし、免疫沈降のために準備した細胞ライセートの500-1,500μgのために樹脂の14〜20μlを移す。高いトランスフェクション効率と細胞の場合は、500μgのは十分だろう。低トランスフェクション効率と細胞の場合は、より多くのタンパク質が必要になることがあります。
- 回転と℃で一晩4℃で細胞ライセートをビーズ混合物をインキュベートする。
- 5分間5000 × gでビーズをスピンダウン。上清を吸引除去する。回洗浄緩衝液（10mMトリス- HCl、pH8.0の、1MのNaCl、1mMのEDTA、1％NP - 40）で樹脂を洗浄します。
- 30秒間に20,000 xgで最終的な時間のためのビーズを回転させる。残留した洗浄液を吸引除去し、2X SDSローディングバッファーでレジンを煮る。
- 分析をイムノブロッティングのためにSDS - PAGEゲルにサンプルをロードします。
- それぞれの抗体によるユビキチンと標的蛋白質を検出。免疫ブロッティングのために、我々は通常、最初のユビキチンを検出。膜は、タンパク質の沈殿を検出するために使用されます。
in vitroのユビキチン化アッセイを介して標的タンパク質に対するユビキチン化の検出
- 5Xユビキチン化バッファー（100mMトリス- HCl、pH7.5の25 mMのMgCl 2、2.5mMのDTT、10mMのATP）を作る。最大6ヶ月間-20℃で小分けに格納します。プロトコルによっては、ATP再生1,2用のバッファにクレアチンリン酸とクレアチンキナーゼを追加。
- 各反応について、以下を含む混合物を準備します。
対照として、E1、E2、またはユビキチンのどちらかがない場合に同様の反応を準備する。μlの8 5Xユビキチン化バッファ 250 ngの ユビキチンE1 500 ngの ユビキチンE2 0.5μgの ユビキチン 0.5μgの 目的のタンパク質 40μlの全体積に水 - ℃で1時間以上37℃混合物をインキュベートする。
- SDS - PAGEサンプルバッファーを加え、反応を停止し、10分間サンプルを煮る。
- 分析をイムノブロッティングのためにSDS - PAGEゲルにサンプルをロードします。
- それぞれの抗体によるユビキチンと標的蛋白質を検出。
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Discussion
このプレゼンテーションでは、まず、培養哺乳動物細胞で目的のタンパク質にユビキチン修飾を検出可能にする手順を説明した。特に興味の蛋白質ではなく、非共有結合的に相互作用するタンパク質のユビキチン化を検出するために、我々は、細胞溶解、免疫沈降および1,3を洗浄するための厳しい条件を使用していました。抗ユビキチンブロッティングが続くような過酷な条件で標的タンパク質の免疫沈降で検出されたユビキチン化は、したがって、標的タンパク質に特異的である可能性が高いです。実験手順の間にタンパク質の脱ユビキチン化を防ぐために、例えば、N -エチルマレイミドおよびユビキチンアルデヒドなどの脱ユビキチン化酵素阻害剤はすべてのバッファ4に追加される可能性があります。しかし、それは脱ユビキチン化酵素は、10分煮沸手順後にアクティブのままになることはほとんどありません。高い分子種の強いスミアやはしごは、通常、ユビキチン化の結果です。目的のタンパク質のユビキチン化の程度は、いくつかの実験条件でユビキチン化/無修正の標的タンパク質の比率を比較することにより評価することができる。標的タンパク質のユビキチン化を増加させるとその一方で、無料のユビキチン分子は一般的に削減されます。また、このプロトコルはsumolyationとneddylationなどの他のユビキチン様小分子の改変を検出することができれば便利です。
我々はまた、精製または組換えタンパク質を用いた in vitroユビキチン化アッセイで説明しています 。様々なエピトープ標識ユビキチン化コンポーネントは、市販されている。ユビキチンE3リガーゼは 、in vitro でユビキチン結合のための必要はありません。
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Acknowledgments
再生医療助成RS1 - 00331から1のためのカリフォルニア工科大学とRL1 - 00682から1（Z.チャンへ）;アメリカのパーキンソンこの作品は、NIHの助成金RO1 DC006497、RO1 NS057289、及びPO1 ES016738（Z.チャンへ）によってサポートされていました疾患協会（Z. ZhangとYSチューチューへ）、およびパーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団（Z.チャン）。
References
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