Summary
ويتم الحصول على قياسات غير الغازية من أنماط النشاط العصبي في التصرف بحرية الحيوانات من خلال الجمع بين العصبية تسجيلات بالفيديو مع سرعة عالية.
Abstract
العلاقة بين أنماط النشاط العصبي والتعبير السلوكي المقابلة من الصعب تحديد في الحيوانات غير المقيد. غير الغازية التقليدية تتطلب طرق موضوعات بحثية على الأقل جزئيا ضبط النفس ، وأنها لا تسمح بتحديد أعداد كبيرة من الخلايا العصبية تفعيلها في وقت واحد. من ناحية أخرى ، لا يمكن إلا فرق صغيرة من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية الفردية يمكن قياسها باستخدام وحيدة الخلية التسجيلات التي تم الحصول عليها من الاستعدادات خفضت الى حد كبير. منذ يقتصر التعبير عن السلوك الطبيعي للحيوانات ضبط النفس وتشريح ، والآليات الكامنة وراء العصبية التي تتحكم في مثل هذا السلوك من الصعب التعرف عليها.
هنا ، أقدم تقنية غير الغازية التي تسمح بقياس الفسيولوجية العصبية تنشيط الدائرة في التصرف بحرية الحيوانات. باستخدام زوج من الأقطاب الكهربائية الأسلاك داخل غرفة مملوءة بالماء ، وحمام أقطاب سجل امكانات الحقل العصبية والعضلية التي تولدها الأحداث جراد خلال الاستجابات الطبيعية أو الهرب أثار تجريبيا. وتوسط في الاستجابات الأولية من جراد البحر هربا من ثلاثة أنواع مختلفة من الذيل تقلب الحيوانات التي تتحرك بعيدا عن نقطة من التحفيز. يتم التحكم في كل نوع من الذيل الوجه بواسطة دارتها العصبية الخاصة ، وردين الهروب أسرع وأقوى تتطلب تفعيل مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية الأمر واسع. بالاشتراك مع الملاحظات السلوكية ، وتسجيلات الكهربائي حمام تتيح تحديد هوية لا لبس فيه من هذه الخلايا العصبية والدوائر المرتبطة بها العصبية. بالتالي يمكن قياس نشاط الدوائر العصبية الكامنة وراء السلوك طبيعيا في الحيوانات غير المقيد والسلوكية في سياقات مختلفة.
Protocol
الجزء 1 : غرفة تسجيل
- غرفة تسجيل هو من شكل مستطيل ، والمصنوعة من الزجاج رقيقة الجدران. أبعاد الغرفة هي 8.5 سم × 2 سم x 5 سم (طول × العرض × الارتفاع) للحيوانات من 2.5 -- 3.5 سم مجموع أطوال (تقاس من المنصة لالدبير).
انظر الشكل. 1 للحصول على مثال غرفة المستخدمة في تجاربنا. - بدلا من ذلك ، يمكن تسجيل الغرف من مواد أخرى (مثلا ، وغير السامة من البلاستيك واضح). قد يختلف حجم الدوائر وفقا للإجراءات التجريبية وغرف مخصصة ينبغي لكل سلسلة التجريبية. للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تكون صغيرة الحجم غرفة ممكن دون تقييد الحيوانات في سلوكهم الطبيعي. وكقاعدة عامة ، ينبغي للأطوال وعرض الغرفة لن يكون أكثر من ثلاثة أضعاف حجم الحيوان.
الجزء 2 : الأقطاب الكهربائية والأسلاك الأرضية حمام
- وتستخدم زوجا واحدا من الأقطاب الكهربائية والقطب تسجيل الأرض. أقطاب كهربائية مصنوعة من الأسلاك النحاسية المعزولة (26 AWG مع العزل 0.25 ملم). يتم توصيل واحدة من نهاية الأقطاب حمام الى مكبر للصوت خارج الخلية (AM نظم 1700 ؛ أنظر أدناه) ، و 0.5 -- 1.0 ملم يتم تجريد من المادة العازلة من الغايات الاخرى. توصيل سلك الأرض إلى الأرض من مكبر للصوت أو أي معدات أخرى ترتكز و 2-3 سم من العزل خلع الطرف الآخر.
- وترد أقطاب حمام والأسلاك الأرضية على الجدران داخل القاعة مع تسجيل غير سامة الغراء. يتم وضع أقطاب تسجيل مركزيا على جانبي قصيرة للغرفة ، ومعاكس لبعضها البعض (الشكل 1).
- يتوضع قطب الأرض على جانب واحد طويل من تسجيل عمودي غرفة للتسجيل أقطاب (الشكل 1).
- يملأ الغرفة مع الماء منزوع الأيونات. ويتم الحصول على أفضل النتائج مع الماء للمقاومة عالية (~ 18 MΩ).
الجزء 3 : تسجيلات الكهربائي حمام
- وتتضخم المخرجات من أقطاب تسجيل (1000x) بواسطة مكبر للصوت خارج الخلية (AM الأنظمة ؛ 1700 النموذجي). يتم تصفية إشارة من أقطاب تسجيل باستخدام مزيج من التردد المنخفض (<100 هرتز) وارتفاع وتيرة انقطاع (> 5 كيلو هيرتز). ثم يتم توصيل الإشارات إلى مربع التبديل واقتناء لوحة البيانات (الصكوك الوطنية). يتم تسجيل البيانات الرقمية وتخزينها وتحليلها باستخدام برنامج اكتساب البيانات (Photron أدوات موشن).
- بدلا من ذلك ، يمكن الإشارة الرقمية تضخيمها من أقطاب أخرى باستخدام تسجيل التناظرية الرقمية المحولات (على سبيل المثال ، MDS تقنيات تحليلية ؛ Digidata 1440) قبل أن يتم تسجيل البيانات الرقمية باستخدام الأخرى الحصول على البيانات المتاحة تجاريا البرامج (على سبيل المثال ، MDS تقنيات تحليلية ؛ Axoscope).
الجزء 4 : دقق تحفيز
- يتم إجراء التحقيق لتحفيز ماصة الزجاج (14 سم طول) مجهزة بزوج من سلك كهربائي جيد. ويتعرض نصائح القطب (0.2 ملم) لإنتاج إشارة إلكترونية عند لمس الحيوان التحقيق. وهذا يسمح لقياس الوقت بدقة من التحفيز.
- وتتضخم المخرجات من التحقيق تحفيز (1000x) بواسطة مكبر للصوت خارج الخلية (AM الأنظمة ؛ 1700 النموذجي). يتم تصفية إشارة باستخدام مزيج من التردد المنخفض (<100 هرتز) وارتفاع وتيرة انقطاع (> 5 كيلو هيرتز). ثم يتم توصيل الإشارة إلى مربع التبديل واقتناء لوحة البيانات (الصكوك الوطنية). يتم تسجيل البيانات الرقمية وتخزينها وتحليلها باستخدام برنامج اكتساب البيانات (Photron أدوات موشن).
الجزء 5 : تسجيلات فيديو
- يتم وضع كاميرا فيديو عالية السرعة (Fastcam - X 1280 PCI ، Photron) عمودي على غرفة تسجيل لتقديم وجهة نظر الجانب. ولا بد من تعديل مستوى سطوع داخل غرفة تسجيل لتقديم أفضل النتائج ، على سبيل المثال باستخدام منار أوزة الرقبة أو غيرها من مصادر الضوء focusable.
- يتم الجمع بين السرعة العالية بالفيديو وتزامن ذلك مع التسجيلات الإلكترونية باستخدام اندلاع مربع وبيانات مجلس اقتناء (الصكوك الوطنية). توصيل تضخيم إشارة من الأقطاب الحمام إلى اندلاع مربع وبيانات مجلس اقتناء باستخدام كابلات BNC. خارجي ناحية التبديل الزناد يبدأ باكتساب الفيديو والبيانات المتزامنة.
الجزء 6 : الإجراء التجريبي
- يتم تقديم حيوان واحد في الغرفة والسماح للتأقلم لمدة 5 دقائق. وأثار هروب الذيل تقلب بواسطة الصنابير واحدة من شدة مختلفة في الرأس أو البطن ، على التوالي. يتم التحكم في شدة الصنابير التي المجرب. يتم تسجيل كل الهرب الذيل الوجه مع الفيديو عالي السرعة بمعدل إطار نقطة و / ثانية ، وبيانات 1000 من امكانات الحقل الالكترونية يتم تسجيلها عند 25 كيلوهرتز. يبدأ بداية حمام وتسجيل الفيديو عن طريق تبديل دليل على مربع الزناد. يتم تحديد وقت التسجيل عن طريق اختيار معدل الإطار (على سبيل المثال ، 1000 و / ثانية = 4 ثوانى تسجيل الوقت الإجمالي). يمكن اختيار وآخر مرة قبل تسجيل الزناد.
- ليسه : وينبغي التحقق من صحة التسجيلات قطب مرة واحدة لكل أنواع اختبارها من خلال الجمع بين التسجيلات الكهربائي حمام مع غيرها من الأساليب التسجيلات المتاحة. في جراد البحر ، يمكن أن تكون زوج من أقطاب الفضة مزروع جراحيا حول الحبل العصبي البطني. ويمكن تطبيق مؤثرات انتزاع الذيل تقلب الهرب وسجلت آثار الالكترونية وزرع أقطاب كهربائية يمكن مقارنة الحمام.
- الهروب الذيل الوجه السلوك ويمكن تسجيل النشاط العصبي المناظرة في مجموعة متنوعة من السياقات المختلفة ، على سبيل المثال في الاستجابة للتهديدات البصرية ، وخلال الهجمات المفترس ، أو خلال اللقاءات ناهض اثنين من جراد البحر. حجم الغرفة ، ووضع التسجيل ، الخ لابد من تعديلها وفقا لذلك (انظر مناقشة).
الجزء 7 : تحليل البيانات
- ويتم تحليل إطارات الفيديو واحد باستخدام أداة الحركة البرمجيات (Photron). وتستخدم التعقب الالكترونية لتحديد نوع من الدوائر العصبية التي تم تفعيلها من قبل كل التحفيز. تتم مقارنة البيانات لتسجيلات الفيديو الفسيولوجية متزامنة لتحديد حركة الحيوان وتنشيط الدائرة العصبية. كل دائرة تنشيط تنتج التوقيع مميزة الإلكترونية (انظر نتائج الممثل).
- وتحسب الكمون بين المسبار الاتصال والاستجابة العصبية / العضلي لكل تجربة من خلال قياس التأخير بين ظهور إشارة التحقيق وبداية الإشارات المسجلة مع أقطاب الحمام.
الجزء 8 : نتائج الممثل
سلسلة من إطارات الفيديو واحد عالي السرعة والمناظرة التسجيلات الحقل الكهربائي للهروب الذيل الوجه استجابة لحافز لمسية تسليمها الى الرأس أو الذيل من جراد البحر الأحداث (الشكل 2).
التين. أثار اللمس التحفيز القوية لرأس الذيل الوجه الدوائر التي تسيطر عليها العملاقة الإنسي : 2A. الارتفاع المسجل في الخلايا العصبية العملاقة (النجمة) وانحراف كبير طوري يتبع تمكن غير غامضة تحديد الوجه والذيل بوساطة نشاط الخلايا العصبية العملاقة. حركة الى الوراء تظهر في آثار الفيديو يحدد هوية الدارة العصبية تنشيط (MG).
التين. تم تطبيق الذيل الوجه بوساطة الدائرة العملاقة الوحشي بعد الحافز القوي لمسية الذيل : 2B. الحركة إلى أعلى وإلى الأمام ينظر في شريط الفيديو مع آثار التتبع الإلكترونية تزامن ارتفاع عرض عملاقة و، طوري كبيرة انحراف أولي يحدد هوية الدارة العصبية تنشيط (LG).
التين. 2C : الذيل الوجه التي يسيطر عليها غير العملاقة الدوائر. وتم تسليم التحفيز عن طريق اللمس أكثر تدرجا إلى القفص الصدري من الحيوان. في حين أن الحركة استولت على الفيديو لا يسمح بتحديد واضح للدائرة تنشيط وتسجيل الالكترونية يفتقر إلى ارتفاع العملاقة ، ويتألف من الانحرافات أصغر بكثير تحديد الدوائر المنشط (غير - G).
التين. 3 : اختفاء القياسات لجميع الأنواع الثلاثة من الهرب الذيل تقلب. وقد تم قياس الوقت بين الاتصال والاستجابة الفسيولوجية التحقيق لمدة سبعة الحيوانات. وأثارت العملاقة التي تتوسط الذيل تقلب بشكل أسرع من غير العملاقة تقلب الذيل.
الشكل 1 : مثال لدائرة تسجيل المستخدمة في التجارب على الحيوانات لدينا من 2،5-3،5 سم في مجموع أطوال. يتم لصقها على الأقطاب حمام طرفي نقيض في غرفة بينما يتم إرفاق سلك الأرض إلى الجانب البعيد من الغرفة وعمودي على الأقطاب الحمام.
الشكل 2 : واحدة إطارات الفيديو المسجلة في التسجيلات و / ثانية و1000 الموافق الإلكترونية لثلاثة أنواع مختلفة من التحفيز.
أ) وقد وزعت عن طريق اللمس حافزا قويا لرئيس الحيوان واستدعت العملاقة الإنسية (MG) بوساطة الذيل الوجه. يتم عرض ستة إطارات الفيديو على اليسار. ويظهر أثر التسجيل من التحقيق المستخدمة للمس الحيوانات في الرمادي ، ويدل على نقطة الاتصال عن طريق رأس السهم الأسود. ويظهر أثر تسجيل حصلت مع أقطاب حمام باللون الأزرق. وأقحم يبين محوار عملاق الصغيرة التي تسبق ارتفاع الانحرافات الكبيرة طوري. أشرطة رمادية تتوافق مع إطارات الفيديو الذي يظهر على اليسار. وقعت اول تحرك ملحوظ للجراد في ذيل في الإطار رقم 3 ، وسبعة مللي ثانية بعد الاتصال مع التحقيق.
ب) تم تسليمها عن طريق اللمس حافزا قويا لذيل الحيوان واستدعت العملاقة الوحشي (LG) بوساطة الذيل الوجه. يتم عرض ستة إطارات الفيديو على اليسار. ويظهر أثر التسجيل من التحقيق المستخدمة للمس الحيوانات في الرمادي ، ويدل على نقطة الاتصال عن طريق رأس السهم الأسود. تتبع تسجيل حصل معويرد أقطاب حمام باللون الأحمر. وأقحم يبين محوار عملاق الصغيرة التي تسبق ارتفاع الانحرافات الكبيرة طوري. أشرطة رمادية تتوافق مع إطارات الفيديو الذي يظهر على اليسار. وقعت اول تحرك ملحوظ للجراد في ذيل في الإطار رقم 3 ، وثمانية ميلي ثانية بعد الاتصال مع التحقيق.
C) وتم تسليم التحفيز وضعف تدريجي عن طريق اللمس على رأس الحيوان واستدعت غير العملاقة (غير G) بوساطة الذيل الوجه. يتم عرض ثمانية إطارات الفيديو على اليسار. ويظهر أثر التسجيل من التحقيق المستخدمة للمس الحيوانات في الرمادي ، ويدل على نقطة الاتصال عن طريق رأس السهم الأسود. ويظهر أثر تسجيل حصلت مع أقطاب حمام باللون الأسود. تتبع يفتقر إلى إمكانية ارتفاع العملاقة ، فإن هذه الانحرافات الكبيرة الأولي ويتكون من إمكانات سعة أصغر من ذلك بكثير. أشرطة رمادي فاتح تتوافق مع إطارات الفيديو الذي يظهر على اليسار. وقعت اول تحرك ملحوظ للجراد في ذيل في الإطار رقم 6 ، 115 ميلي ثانية بعد أول اتصال مع التحقيق.
الشكل 3 : قياسات كمون الاستجابة لمدة سبعة حيوانات مختلفة من كلا الجنسين وأحجام مماثلة (يعني أطوال ± stdv : 3.2 سم ± 0.2 سم ، يقاس من المنصة لالدبير). MG (الشريط الأزرق) وشركة إل جي (أحمر بار) الذيل تقلب والإختفاء استجابة أقصر بكثير من الذيل تقلب بوساطة الدوائر (شريط أسود) غير G. وتظهر وسائل والانحرافات المعيارية. لم الحانات مع الرسالة نفسها لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض (اختبار Wilcoxon رتبة توقيع للمقارنة الزوج الحكيم ، P <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
غير الغازية تسجيلات لنشاط الخلايا العصبية واحدة أو العصبية تنشيط الدائرة يصعب الحصول عليها في الحيوانات غير المقيد. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتحديد أنماط التنشيط العصبي الكامنة طبيعيا السلوك.
في الماضي ، ونحن استخدمت بنجاح هذه التقنية لقياس أنماط النشاط في الدوائر العصبية من جراد البحر هربا من الأحداث خلال تشكيل الهرمية الاجتماعية هيمنة 1 ، خلال هجمات من الحيوانات المفترسة الطبيعية 2 ، ومؤخرا ، ردا على تهديدات البصرية 3. حاليا ، ونحن نستخدم مزامنة التسجيلات الكهربائي حمام وتسجيلات الفيديو عالية السرعة لقياس أهمية تحركات لواحق الرأس أثناء تنفيذ السلوكيات الهرب في جراد البحر.
في حين تم فقط هذه التقنية المستخدمة في نوعين من أنواع اللافقاريات المختلفة (جراد البحر واليعسوب) ومعملين مختلفين 4 ، يبدو من المرجح أنه يمكن تطبيقها على غيرها من نظم النموذج الحيواني ، بما في الفقاريات ، وبعض السلوكيات التي المائية والتعبير عن ذلك والخلايا العصبية التي تسيطر عليها كبيرة. على سبيل المثال ، يتم التحكم في ردود هروب سريع للأسماك مكتملة العظام العديد من الخلايا ماوتنر ، الخلايا العصبية تعريفية كبيرة 5. وقد تلقت سلوك الهروب بوساطة الخلايا ماوتنر اهتماما كبيرا في الأدب ودرست على عدة مستويات من التحليل ، ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أن خلايا الجسم يتحول ماوتنر التحكم السريع في الحالات التي لا علاقة لها 6،7 الهرب. الأدلة ، ومع ذلك ، في معظمها مشتق من مقارنة المتغيرات kinematical من السلوكيات وليس من القياسات المباشرة للنشاط الخلايا ماوتنر. قد يكون من الممكن استخدام التسجيلات الكهربائي حمام في تركيبة مع سرعة عالية بالفيديو لقياس امكانات الحقل تم إنشاؤها بواسطة الخلايا ماوتنر أو ما يرتبط بها النشاط العضلي.
أيضا ، بالإضافة إلى قيمته العلمية ، والتقنية وصفها هنا مثاليا للأغراض التعليمية (مثل المختبرات التعليمية الجامعية) وذلك بسبب بساطته الشاملة والرخص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
كان أول من استخدم هذه التقنية من خلال تسجيل حمام فريك (1984) [بل] (8) وآخرون. (1990) 9 لقياس المجالات الكهربائية المولدة خلال الذيل تقلب. تعديل في وقت لاحق وتحسين تقنية في مختبر الدكتور دونالد ادواردز (جامعة ولاية جورجيا) من قبل تلميذه السابق الدكتور عيسى خريج ألف فادي وفريقه السابق بعد الدكتوراه المنتسبين الدكتور Herberholz ينس. وقد أحرز مزيد من التحسينات ولقد تم اختبار تطبيقات البحوث العلمية الجديدة في مختبر الدكتور ينس Herberholz في جامعة ميريلاند. وأود أن أشكر زميلي الدكتور ديفيد Yager على السماح لي استخدام جهازه الفيديو عالية السرعة وبحثي مساعدي ديفيد روتشتاين ويدن وليام للمساعدة في التجارب.
References
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
- Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
