Summary
לא פולשני מדידות של דפוסי פעילות עצבית להתנהג בחופשיות בעלי חיים מתקבלים על ידי שילוב של הקלטות neurophysiological עם videography במהירות גבוהה.
Abstract
הקשר בין דפוסי הפעילות העצבית ואת הביטוי ההתנהגותי המקביל קשה לקבוע בבעלי חיים בלתי מרוסנת. מסורתית פולשני שיטות דורשים נושאי מחקר לפחות חלקית מאופקת, והם רק לאפשר זיהוי של מספרים גדולים של נוירונים מופעלים במקביל. מצד שני, הרכבים קטנים של נוירונים נוירונים בודדים או יכול להיות רק נמדד באמצעות תא יחיד הקלטות המתקבל ההכנות מופחת במידה רבה. מאז הביטוי של התנהגות טבעית מוגבלת בחיות מאופקת גזור, המנגנונים העצביים הבסיסיים ששולטים התנהגות כזו שקשה לזהות.
הנה, אני מציג טכניקה לא פולשנית המאפשרת מדידה פיזיולוגית הפעלת המעגל העצבי להתנהג בחופשיות בעלי חיים. שימוש בזוג אלקטרודות מתכת בתוך חדר מלא מים, אלקטרודות אמבטיה שיא הפוטנציאל בתחום עצביים ושרירי שנוצר על ידי סרטנים לנוער במהלך התגובות לברוח או טבעי עורר בניסוי. התגובות הבריחה העיקרי של סרטנים מתווכות על ידי שלושה סוגים שונים של זנב סלטות אשר להזיז את החיות הרחק מנקודת גירוי. כל סוג של זנב להעיף נשלטת על ידי מעגלים עצביים משלה; שתי התגובות הבריחה המהירה והחזקה ביותר ומצריכות הפעלה של קבוצות שונות של נוירונים הפקודה גדול. בשילוב עם תצפיות התנהגותיות, את האלקטרודה הקלטות אמבטיה לאפשר זיהוי חד משמעי של הנוירונים האלה ואת המעגלים העצביים הקשורים. לכן הפעילות של המעגלים העצביים שבבסיס ההתנהגות טבעי ניתן למדוד חיים מרוסנת בהקשרים התנהגותיים שונים.
Protocol
חלק 1: חדר הקלטה
- חדר ההקלטה של צורה מלבנית והוא עשוי זכוכית חומה דקה. ממדים לשכת הם 8.5 ס"מ X 2 ס"מ X 5 ס"מ (אורך x רוחב x גובה) עבור חיות של 2.5-3.5 ס"מ אורך הכולל (הנמדד מעל במה כדי telson).
ראה איור. 1 למשל של החדר המשמש בניסויים שלנו. - לחלופין, חדרי הקלטה יכול להיות עשוי מחומרים אחרים (למשל, רעיל פלסטיק שקוף). גודל צ'יימברס עשוי להשתנות בהתאם לנוהל ותאי הניסוי צריך להיות מותאם אישית עבור כל סידרת ניסויים. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, גודל החדר צריך להיות קטן ככל האפשר ללא הגבלה החיות בהתנהגות הטבעית שלהם. ככלל אצבע, אורך ורוחב של החדר לא צריך להיות יותר משלוש פעמים את הגודל של החיה.
חלק 2: אלקטרודות באת חוט הקרקע
- זוג אחד של אלקטרודות הקלטה אלקטרודה הקרקע משמשים. אלקטרודות עשויות חוטי נחושת מבודדים (26 AWG עם בידוד 0.25 מ"מ). קצה אחד של אלקטרודות אמבטיה מחוברת למגבר תאיים (AM מערכות 1700, ראה להלן) ו 0.5-1.0 מ"מ של בידוד הם הפשיטו את הקצוות האחרים. חוט הקרקע מחוברת לקרקע של המגבר או כל ציוד אחר מעוגנת 2-3 ס"מ של בידוד הוא פשט את הקצה השני.
- אלקטרודות באת חוט הקרקע מחוברים הקירות הפנימיים של חדר הקלטה עם דבק רעיל. אלקטרודות הקלטה ממוקמים מרכזי משני צידי קצר של החדר ומול זה לזה (איור 1).
- אלקטרודה קרקע ממוקם בצד אחד ארוך של בניצב ההקלטה הקאמרית של אלקטרודות הקלטה (איור 1).
- לשכת מלא במים deionized. התוצאות הטובות ביותר מושגות עם עמידות גבוהה של מים (~ 18 MΩ).
חלק 3: אלקטרודה הקלטות Bath
- יציאות מן האלקטרודות ההקלטה הם מוגבר (1000x) על ידי מגבר תאיים (AM מערכות; דגם 1700). אותות מן האלקטרודות ההקלטה מסונן באמצעות שילוב של תדר נמוך (<100 הרץ) ותדירות גבוהה לחתוך-offs (> 5 KHz). אותות מחובר אז לתיבת מתג לוח רכישת נתונים (מכשירים הלאומי). נתונים סרוקים נרשם, לאחסן ולנתח נתונים באמצעות תוכנה הרכישה (Photron כלי Motion).
- לחלופין, אות מוגבר של אלקטרודות ההקלטה ניתן דיגיטציה באמצעות אחרים אנלוגי דיגיטלי הממירים (למשל, MDS אנליטי טכנולוגיות; Digidata 1440) לפני נתונים דיגיטציה נרשם באמצעות נתונים אחרים זמינים מסחרית תוכנה הרכישה (למשל, MDS אנליטי טכנולוגיות; Axoscope).
חלק 4: בדיקה מגרה
- בדיקה מגרה עשוי פיפטה זכוכית (14 ס"מ אורך) מצויד בזוג אלקטרודות חוט דק. טיפים אלקטרודה חשופים (0.2 מ"מ) כדי לייצר אות אלקטרוני כאשר החיה הוא נגע החללית. זה מאפשר למדוד את הזמן המדויק של גירוי.
- יציאות החל לחקור מגרה הם מוגבר (1000x) על ידי מגבר תאיים (AM מערכות; דגם 1700). האות מסונן באמצעות שילוב של תדר נמוך (<100 הרץ) ותדירות גבוהה לחתוך-offs (> 5 KHz). אות מחוברת אז לתיבת מתג לוח רכישת נתונים (מכשירים הלאומי). נתונים סרוקים נרשם, לאחסן ולנתח נתונים באמצעות תוכנה הרכישה (Photron כלי Motion).
חלק 5: הקלטות וידאו
- מצלמת וידאו במהירות גבוהה (Fastcam PCI-X 1280, Photron) ממוקם בניצב חדר הקלטה על מנת לספק מבט מהצד. רמת בהירות בתוך חדר ההקלטה חייב להיות מותאם על מנת לספק את התוצאות הטובות ביותר, למשל באמצעות הפנס אווז הצוואר או אחר מקורות אור focusable.
- במהירות גבוהה videography משולב ומסונכרן עם הקלטות אלקטרוניים באמצעות תיבת הפריצה & נתונים הרכישה הלוח (National Instruments). אות Amplified מן האלקטרודות אמבטיה מחוברת תיבת הפריצה ולוח נתונים הרכישה באמצעות כבלי BNC. טריגר חיצוני יד מתחיל לעבור את הרכישה מסונכרן וידאו ונתונים.
חלק 6: נוהל ניסיוני
- חיה אחת מוחדר לתא ואיפשר להסתגל במשך 5 דקות. הבריחה זנב הטלות הם שהושרו על ידי אחד הברזים בעוצמה שונה על הראש או הבטן, בהתאמה. האינטנסיביות של הברזים נשלטת על ידי הנסיין. לברוח כל זנב להעיף מוקלט עם וידאו במהירות גבוהה בשיעור מסגרת של 1,000 נקודות ו / sec, ונתונים של הפוטנציאל בתחום אלקטרוניים נרשמות kHz 25. התחלה של האמבט, הקלטת וידאו היא שיזמה לעבור ידנית על תיבה ההדק. זמן הקלטה נקבעת על ידי קצב הפריימים נבחר (למשל, 1000 ו / sec = 4 שניות זמן ההקלטה הכולל). פוסט מראש ההדק הקלטה פעמים ניתן לבחור.
- לאדואר: אלקטרודה הקלטות אמבטיה צריך להיות מאומת פעם אחת על ידי שילוב של האלקטרודה הקלטות אמבטיה עם שיטות זמין הקלטות אחרות עבור כל המינים שנבדקו. ב סרטנים, זוג אלקטרודות כסף יכול להיות מושתל בניתוח סביב חוט העצב הגחון. גירויים לעורר זנב סלטות לברוח יכול להיות מיושם והקליט עקבות האלקטרונית של מושתל אלקטרודות אמבטיה ניתן להשוות.
- הבריחה זנב להעיף התנהגות פעילות עצבית מקבילה ניתן להקליט במגוון בהקשרים שונים, למשל בתגובה לאיומים חזותי, במהלך התקפות טורף, או במהלך המפגשים agonistic של סרטנים השניים. גודל הקאמרית, מצב הקלטה וכו 'צריך להיות בהתאם (ראה דיון).
פרק 7: ניתוח נתונים
- מסגרות וידאו יחיד מנותחים באמצעות כלי תוכנה תנועה (Photron). עקבות אלקטרוניים המשמשים לזיהוי סוג של מעגלים עצביים אשר הופעל על ידי כל גירוי. נתוני וידאו לעומת הקלטות פיזיולוגיים מסונכרן כדי לקבוע את התנועה של החיה ואת המעגל העצבי הופעל. כל מעגל מופעל מייצר חתימה אלקטרונית מאפיין (ראה תוצאות נציג).
- המתנה בין מגע בדיקה התגובה העצבית / שרירי מחושבים עבור כל ניסוי על ידי מדידת עיכוב בין התפרצות של האות בדיקה לבין הופעת האות המוקלט עם אלקטרודות אמבטיה.
חלק 8: תוצאות נציג
סדרת מהירות גבוהה מסגרות יחיד וידאו המקביל הקלטות שדה חשמלי עבור לברוח זנב להעיף בתגובה לגירוי חוש המישוש נמסר הראש או הזנב של סרטנים נער (איור 2).
איור. 2A: גירוי מישוש חזק על הראש עוררו זנב להעיף נשלט על ידי מעגל ענק המדיאלי. ספייק מוקלט של נוירון ענק (כוכביות) לבין סטיה phasic גדול העוקב מאפשר אי - משמעי זיהוי זנב להעיף כמו מתווך על ידי פעילות נוירון ענק. התנועה לאחור שמוצג עקבות וידאו קובע את הזהות של המעגל העצבי מופעל (MG).
איור. 2B: זנב להעיף בתיווך במעגל ענק לרוחב לאחר גירוי מישוש חזק היה מוחל על הזנב. תנועה מעלה וקדימה לראות וידאו עקבות יחד עם עקבות אלקטרוניים מסונכרן הצגת ספייק הענק סטיה גדולה, phasic הראשוני קובע את הזהות של המעגל העצבי מופעל (LG).
איור. 2C: זנב להעיף בשליטת המעגלים הלא ענק. גירוי מישוש הדרגתי יותר נמסר החזה של החיה. בעוד תנועה שנתפסו על וידאו לא מאפשרת זיהוי חד משמעי של המעגל מופעל, ההקלטה אלקטרוניים חסר ספייק ענק והוא מורכב הרבה יותר קטן deflections זיהוי מעגל מופעל (Non-G).
איור. 3: מדידות המתנה עבור כל שלושת סוגי לברוח זנב הטלות. הקשר בין זמן בדיקה התגובה הפיזיולוגית נמדדה במשך שבעה בעלי חיים. הענק בתיווך זנב הטלות הם עוררו משמעותית מהר יותר מאשר אי - ענק זנב הטלות.
איור 1: דוגמה עבור חדר הקלטה השתמשו בניסויים שלנו עבור בעלי החיים של 2.5-3.5 ס"מ באורכים מוחלט. האלקטרודות אמבטיה מודבקות משני צדי האולם בעוד חוט הקרקע מחוברת לצד הארוך של החדר ואת בניצב האלקטרודות אמבטיה.
איור 2: מסגרות וידאו רווק נרשם הקלטות 1000 ו / sec המקביל אלקטרוניים עבור שלושה סוגים שונים של גירויים.
א) גירוי מישוש חזק נמסרה לראש החיה עורר ענק המדיאלי (מ"ג) בתיווך זנב להעיף. ששת וידאו מסגרות מוצגים בצד שמאל. עקבות הקלטה מתוך בדיקה השתמשו לגעת החיה מוצגת אפור נקודת המגע הוא הצביע על ידי ראש החץ השחור. עקבות הקלטה שהושגו עם האלקטרודות האמבט מוצגים בכחול. הבלעה מראה ענקית קטן האקסון ספייק שלפני deflections phasic גדול. ברים גריי מתאימות הווידאו במסגרות המוצג בצד שמאל. התנועה הבולטים הראשונים של הזנב של סרטנים התרחשו # 3 מסגרת, שבע אלפיות השנייה אחרי הקשר עם החללית.
ב) גירוי מישוש חזק נמסר הזנב של החיה עורר ענק לרוחב (LG) בתיווך זנב להעיף. ששת וידאו מסגרות מוצגים בצד שמאל. עקבות הקלטה מתוך בדיקה השתמשו לגעת החיה מוצגת אפור נקודת המגע הוא הצביע על ידי ראש החץ השחור. עקבות הקלטה שהושגו עםאלקטרודות אמבטיה מוצג באדום. הבלעה מראה ענקית קטן האקסון ספייק שלפני deflections phasic גדול. ברים גריי מתאימות הווידאו במסגרות המוצג בצד שמאל. התנועה הבולטים הראשונים של הזנב של סרטנים התרחשו # 3 מסגרת, שמונה מילישניות לאחר מגע עם החללית.
ג) גירוי מישוש חלש הדרגתי נמסרה לראש החיה עורר אי - ענק (Non-G) בתיווך זנב להעיף. שמונה וידאו מסגרות מוצגים בצד שמאל. עקבות הקלטה מתוך בדיקה השתמשו לגעת החיה מוצגת אפור נקודת המגע הוא הצביע על ידי ראש החץ השחור. עקבות הקלטה שהושגו עם האלקטרודות אמבטיה מוצגת בשחור. עקבות חסר פוטנציאל ענק ספייק, deflections הראשוני גדול ומורכב הפוטנציאלים של משרעת הרבה יותר קטן. ברים אפור בהיר מתאימות הווידאו במסגרות המוצג בצד שמאל. התנועה הבולטים הראשונים של הזנב של סרטנים התרחשו מסגרת # 6, 115 אלפיות השנייה לאחר המגע הראשון עם החללית.
איור 3: חביון תגובה מדידות במשך שבע חיות שונות משני המינים והגדלים דומה (כלומר אורכי ± stdv: 3.2 ס"מ ± 0.2 ס"מ, שנמדד מעל במה כדי telson). MG (פס כחול) ו-LG (אדום בר) זנב הטלות יש latencies תגובה משמעותית קצר יותר מאשר זנב סלטות בתיווכו של המעגלים (פס שחור) Non-G. ממוצעים וסטיות תקן מוצגים. ברים עם אותו מכתב לא היו שונים משמעותית זה מזה (מבחן Wilcoxon דרגה חתומים להשוואה זוג חכם, p <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לא פולשני הקלטות של פעילות נוירון בודד או הפעלת המעגל העצבי קשה להשיג אצל בעלי חיים בלתי מרוסנת. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי כדי לזהות דפוסים של הפעלה עצבית הבסיסית טבעי התנהגות.
בעבר, הצלחנו להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד את דפוסי הפעילות של מעגלים עצביים בריחה של סרטנים לנוער במהלך היווצרות של היררכיות דומיננטיות חברתית 1, במהלך התקפות של טורפים טבעיים 2, ולאחרונה, בתגובה לאיומים חזותי 3. נכון לעכשיו, אנו משתמשים מסונכרן אלקטרודה אמבטיה הקלטות במהירות גבוהה הקלטות וידאו למדוד את החשיבות של תנועות הנספחים ראש במהלך הביצוע של התנהגויות לברוח סרטנים.
בעוד טכניקה זו יש רק שימשו שני מינים חסרי חוליות שונים (סרטנים ושפיריות) ובשני 4 מעבדות שונות, נראה כי זה יכול להיות מיושם על מערכות אחרות מודל החיה, כולל חוליות, שחלקן התנהגויות מימיים ולהביע כי נשלטים על ידי עצב גדול. לדוגמה, תגובות לברוח מהר דגים teleost רבים נשלטים על ידי תאים מאוטנר, נוירונים לזיהוי גדול 5. בריחה התנהגות מתווכת על ידי התאים מאוטנר קיבל תשומת לב רבה בספרות נחקרה בכמה רמות של ניתוח; זאת, גוברות העדויות כי תאי מאוטנר השליטה הופך בגוף מהיר במצבים שאינן קשורות לברוח 6,7. הראיות, עם זאת, נגזר בעיקר בהשוואת משתנים kinematical של התנהגויות ולא מתוך מדידות ישירות של פעילות התא מאוטנר. זה עשוי להיות אפשרי להשתמש אלקטרודה הקלטות אמבטיה בשילוב עם videography במהירות גבוהה כדי למדוד את פוטנציאל השדה הנוצר על ידי תאים מאוטנר או קשור בפעילות השרירים.
בנוסף לערך המדעי שלה, הטכניקה המתוארת כאן היא גם אידיאלי למטרות חינוכיות (למשל, מעבדות הוראה לתואר ראשון) בשל הפשטות שלה, הכוללת inexpensiveness.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
טכניקת ההקלטה אמבטיה שימש לראשונה על ידי Fricke (1984) 8 ו Beall et al. (1990) 9 למדוד שדות חשמליים שנוצר במהלך זנב הטלות. הטכניקה שונה מאוחר יותר ומשופר במעבדה של ד"ר דונלד אדוארדס (ג'ורג'יה סטייט) על ידי בוגר סטודנט שלו לשעבר ד"ר פאדי עיסא א לשעבר דוקטורט שלו עמית ד"ר Jens Herberholz. שיפורים נוספים נעשו ויישומים המחקר החדש נבדקו במעבדה של ד"ר Jens Herberholz באוניברסיטת מרילנד. אני רוצה להודות לעמית ד"ר דוד שלי Yager שנתת לי להשתמש במערכת במהירות גבוהה שלו וידאו מחקר מעוזרי דוד רוטשטיין וויליאם Liden לעזרה עם הניסויים.
References
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
- Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
