आज़ादी पशु व्यवहार में तंत्रिका सर्किट सक्रियकरण की रिकॉर्डिंग

Summary

आज़ादी बर्ताव पशुओं में तंत्रिका गतिविधि पैटर्न के गैर इनवेसिव मापन उच्च गति वीडियोग्राफी के साथ neurophysiological रिकॉर्डिंग के संयोजन के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं.

Abstract

तंत्रिका गतिविधि और इसी व्यवहार अभिव्यक्ति के पैटर्न के बीच संबंधों को अनर्गल पशुओं में स्थापित करने के लिए मुश्किल है. पारंपरिक गैर इनवेसिव तरीकों कम से कम आंशिक रूप से स्र्द्ध अनुसंधान के विषय की आवश्यकता होती है, और वे केवल एक साथ सक्रिय न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या की पहचान की अनुमति. दूसरी ओर, न्यूरॉन्स या व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के छोटे ensembles केवल काफी हद तक कम की तैयारी से प्राप्त एकल कक्ष रिकॉर्डिंग का उपयोग कर मापा जा सकता है. प्राकृतिक व्यवहार की अभिव्यक्ति के बाद से रोका और dissected पशुओं में सीमित है, अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र है कि इस तरह के व्यवहार नियंत्रण की पहचान करने के लिए मुश्किल हैं.

यहाँ, मैं एक गैर इनवेसिव शारीरिक तकनीक है कि स्वतंत्र रूप से जानवरों का बर्ताव में तंत्रिका सर्किट सक्रियण को मापने की अनुमति देता उपस्थित थे. पानी भरा कक्ष के अंदर तार इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का उपयोग करना, स्नान इलेक्ट्रोड तंत्रिका और मांसपेशियों क्षेत्र प्राकृतिक या प्रयोगात्मक पैदा बच प्रतिक्रियाओं के दौरान किशोर क्रेफ़िश द्वारा उत्पन्न क्षमता रिकॉर्ड. क्रेफ़िश के प्राथमिक बच प्रतिक्रियाओं पूंछ - flips जो जानवरों की उत्तेजना के बिंदु से दूर हटो तीन अलग अलग प्रकार के द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. पूंछ - फ्लिप के प्रत्येक प्रकार की अपनी तंत्रिका सर्किट द्वारा नियंत्रित किया जाता है, दो सबसे तेजी से और सबसे शक्तिशाली भागने प्रतिक्रियाओं बड़े आदेश न्यूरॉन्स के विभिन्न सेट के सक्रियण की आवश्यकता होती है. व्यवहार टिप्पणियों के साथ संयोजन में, स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग इन न्यूरॉन्स की स्पष्ट पहचान और संबद्ध तंत्रिका सर्किट की अनुमति देते हैं. इस प्रकार तंत्रिका स्वाभाविक रूप से घटनेवाला व्यवहार अंतर्निहित circuitry के गतिविधि अनर्गल पशुओं में है और अलग अलग व्यवहार संदर्भों में मापा जा सकता है.

Protocol

भाग 1: रिकॉर्डिंग कक्ष

1. रिकॉर्डिंग कक्ष आयताकार आकार का है और पतली दीवारों कांच के बने है. चैंबर आयामों 8.5 सेमी x 2 सेमी x 2.5 के जानवरों के लिए 5 (लम्बाई x चौड़ाई x ऊँचाई) सेमी 3.5 सेमी की कुल लंबाई (Telson करने के लिए मंच से मापा).
   चित्र देखें. हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया चैम्बर के एक उदाहरण के लिए 1.
2. वैकल्पिक रूप से, रिकॉर्डिंग कक्षों अन्य सामग्री (उदाहरण के लिए, गैर विषैले स्पष्ट प्लास्टिक) से बनाया जा सकता है. चेम्बर्स आकार प्रयोगात्मक प्रक्रिया और कक्षों के अनुसार भिन्न प्रत्येक प्रायोगिक श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए सकता है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, कक्ष आकार के रूप में संभव के रूप में छोटे उनके प्राकृतिक व्यवहार में पशुओं निरोधक के बिना किया जाना चाहिए. अंगूठे का एक नियम के रूप में, लंबाई और कक्ष की चौड़ाई से अधिक तीन बार जानवर के आकार नहीं होना चाहिए.

भाग 2: स्नान इलेक्ट्रोड और जमीन तार

1. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी और एक जमीन इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल कर रहे हैं. इलेक्ट्रोड अछूता तांबे के तार (0.25 मिमी इन्सुलेशन के साथ 26 AWG) के बने होते हैं. एक बाह्य (AM सिस्टम 1700, नीचे देखें) प्रवर्धक स्नान इलेक्ट्रोड के एक छोर जुड़ा हुआ है और 0.5 - 1.0 मिमी इन्सुलेशन के दूसरे छोर से छीन रहे हैं. जमीन तार एम्पलीफायर या किसी अन्य पर आधारित उपकरणों और इन्सुलेशन के 2-3 सेमी की जमीन से जुड़ा है दूसरे छोर से छीन लिया है.
2. स्नान इलेक्ट्रोड और गैर विषैले गोंद के साथ रिकार्डिंग कक्ष के अंदर दीवारों को जमीन तार जुड़े होते हैं. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड केंद्रीय कक्ष और विपरीत एक दूसरे से (छवि 1) दोनों ही पक्षों पर तैनात हैं.
3. ग्राउंड इलेक्ट्रोड एक रिकॉर्डिंग कक्ष रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (छवि 1) के लिए सीधा के लंबे पक्ष पर तैनात है.
4. चैंबर विआयनीकृत जल से भरा है. सर्वश्रेष्ठ परिणामों के उच्च प्रतिरोध के पानी (~ MΩ 18) के साथ प्राप्त कर रहे हैं.

भाग 3: स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग

1. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से outputs (1000x) एक बाह्य प्रवर्धक (, मॉडल 1700 AM सिस्टम) से परिलक्षित कर रहे हैं. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से सिग्नल कम आवृत्ति (<100 हर्ट्ज) का एक संयोजन और उच्च आवृत्ति में कटौती नापसंद (> 5 KHz) का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर किया जाता है. सिग्नल तो एक स्विच बॉक्स और डाटा अधिग्रहण बोर्ड (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) से जुड़ा है. डिजीटल डेटा दर्ज है, संग्रहीत है, और डाटा अधिग्रहण (Photron मोशन उपकरण) सॉफ्टवेयर का उपयोग का विश्लेषण किया.
2. पहले डिजीटल डेटा अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डाटा अधिग्रहण (Axoscope, उदाहरण के लिए, एमडीएस विश्लेषणात्मक टेक्नोलॉजीज) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज की गई है, वैकल्पिक रूप से, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से परिलक्षित संकेत अन्य एनालॉग डिजिटल कन्वर्टर्स (1440 Digidata जैसे, एमडीएस विश्लेषणात्मक टेक्नोलॉजीज) का उपयोग कर डिजीटल किया जा सकता है.

भाग 4: उत्तेजक जांच

1. एक उत्तेजक जांच एक गिलास (14 सेमी लंबाई) विंदुक ठीक तार इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी के साथ सुसज्जित किया जाता है. इलेक्ट्रोड सुझावों (0.2 मिमी) उजागर कर रहे हैं एक इलेक्ट्रॉनिक संकेत है जब जानवर जांच द्वारा छुआ है का उत्पादन. यह उत्तेजना का सही समय को मापने की अनुमति देता है.
2. उत्तेजक जांच से outputs (1000x) एक बाह्य प्रवर्धक (, मॉडल 1700 AM सिस्टम) से परिलक्षित कर रहे हैं. सिग्नल कम आवृत्ति (<100 हर्ट्ज) का एक संयोजन और उच्च आवृत्ति में कटौती नापसंद (> 5 KHz) का उपयोग फ़िल्टर्ड है. संकेत तो एक स्विच बॉक्स और डाटा अधिग्रहण बोर्ड (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) से जुड़ा है. डिजीटल डेटा दर्ज है, संग्रहीत है, और डाटा अधिग्रहण (Photron मोशन उपकरण) सॉफ्टवेयर का उपयोग का विश्लेषण किया.

भाग 5: वीडियो रिकॉर्डिंग

1. एक उच्च गति वीडियो कैमरा (Fastcam एक्स 1280 पीसीआईघड़ी, Photron) सीधा रिकॉर्डिंग कक्ष में तैनात है के लिए एक पक्ष को देखने के प्रदान. रिकार्डिंग कक्ष के अंदर चमक के स्तर के लिए सबसे अच्छा परिणाम, एक हंस गर्दन प्रकाशक या अन्य focusable प्रकाश स्रोतों का उपयोग करके जैसे प्रदान करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
2. उच्च गति वीडियोग्राफी संयुक्त और इलेक्ट्रॉनिक रिकॉर्डिंग का उपयोग कर एक breakout बॉक्स और डाटा अधिग्रहण बोर्ड (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) के साथ सिंक्रनाइज़ है. स्नान इलेक्ट्रोड से प्रवर्धित संकेत breakout बॉक्स और डाटा अधिग्रहण बोर्ड BNC केबल का उपयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है. एक बाहरी हाथ स्विच ट्रिगर सिंक्रनाइज़ वीडियो और डाटा अधिग्रहण शुरू होता है.

भाग 6: प्रायोगिक प्रक्रिया

1. एक एकल जानवर चेंबर में शुरू की है और 5 मिनट के लिए acclimate करने के लिए अनुमति दी. भागने पूंछ flips अलग तीव्रता के एक नल से सिर या पेट में हासिल कर रहे हैं, क्रमशः. नल का तीव्रता experimenter द्वारा नियंत्रित किया जाता है. प्रत्येक बच पूंछ - फ्लिप 1000 इलेक्ट्रॉनिक क्षेत्र क्षमता के च / सेक, और डेटा के एक फ्रेम दर पर उच्च गति वीडियो के साथ दर्ज की है 25 kHz पर दर्ज हैं. स्नान और वीडियो रिकॉर्डिंग प्रारंभ पुस्तिका स्विच द्वारा एक ट्रिगर बॉक्स पर शुरू की है. रिकॉर्डिंग समय चुना फ्रेम दर (उदाहरण के लिए, 1000 च / सेक = 4 सेकंड कुल रिकॉर्डिंग समय) द्वारा निर्धारित किया जाता है. के बाद और पूर्व ट्रिगर रिकॉर्डिंग समय चुना जा सकता है.
2. नहींई: स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग प्रत्येक परीक्षण प्रजातियों के लिए एक बार करना चाहिए अन्य रिकॉर्डिंग उपलब्ध तरीकों के साथ स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के संयोजन के द्वारा सत्यापित. क्रेफ़िश, चांदी इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी शल्य चिकित्सा वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड के आसपास प्रत्यारोपित किया जा सकता है. बच पूंछ flips eliciting उत्तेजनाओं और लागू किया जा सकता है प्रत्यारोपित और स्नान इलेक्ट्रोड की तुलना में किया जा सकता है इलेक्ट्रॉनिक निशान दर्ज की है.
3. भागने पूंछ फ्लिप व्यवहार और इसी तंत्रिका गतिविधि अलग अलग संदर्भों की एक किस्म में दर्ज किया जा सकता है, जैसे दृश्य खतरों के जवाब में शिकारी हमलों के दौरान, या दो क्रेफ़िश के मल्लयुद्ध मुठभेड़ों के दौरान. चैंबर आकार, रिकॉर्डिंग मोड, आदि के लिए तदनुसार समायोजित किया जा (चर्चा देखें) है .

भाग 7: डेटा विश्लेषण

1. एकल वीडियो फ्रेम गति उपकरण सॉफ्टवेयर (Photron) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. इलेक्ट्रॉनिक निशान करने के लिए तंत्रिका सर्किट के प्रकार है कि प्रत्येक उत्तेजना से सक्रिय किया गया था की पहचान के लिए उपयोग किया जाता है. वीडियो डेटा सिंक्रनाइज़ शारीरिक रिकॉर्डिंग जानवर के आंदोलन और सक्रिय तंत्रिका सर्किट निर्धारित की तुलना में है. प्रत्येक सक्रिय सर्किट एक विशेषता इलेक्ट्रॉनिक हस्ताक्षर (प्रतिनिधि परिणाम देखने) पैदा करता है.
2. जांच से संपर्क करें और तंत्रिका / पेशी प्रतिक्रिया के बीच लेटेंसी प्रत्येक प्रयोग के लिए जांच संकेत और स्नान इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज संकेत की शुरुआत की शुरुआत के बीच देरी को मापने के द्वारा की गणना कर रहे हैं.

8: भाग प्रतिनिधि परिणाम

सिर या एक किशोर क्रेफ़िश की पूंछ (छवि 2) के लिए दिया एक स्पर्श उत्तेजना के जवाब में एक उच्च गति वीडियो फ्रेम और पूंछ - फ्लिप भागने के लिए इसी बिजली के क्षेत्र रिकॉर्डिंग की एक श्रृंखला.

चित्र 2A: मजबूत सिर को स्पर्श उत्तेजना पैदा एक औसत दर्जे का विशाल सर्किट द्वारा नियंत्रित पूंछ - फ्लिप. विशाल (तारांकनों) न्यूरॉन और बड़े phasic विक्षेपन है कि इस प्रकार के रिकॉर्ड स्पाइक की पहचान गैर अस्पष्ट पूंछ फ्लिप विशाल न्यूरॉन गतिविधि द्वारा मध्यस्थता के रूप में सक्षम बनाता है. पिछड़े वीडियो निशान में दिखाया आंदोलन सक्रिय तंत्रिका सर्किट (एमजी) की पहचान निर्धारित करता है.

चित्र 2B: एक मजबूत स्पर्श उत्तेजना के बाद टेल फ्लिप पार्श्व विशाल सर्किट द्वारा मध्यस्थता पूंछ को लागू किया गया था. ऊपर और आगे वीडियो में देखा गति सिंक्रनाइज़ इलेक्ट्रॉनिक विशाल कील और बड़े, phasic प्रारंभिक विक्षेपन सक्रिय तंत्रिका सर्किट (एलजी) की पहचान निर्धारित करता है प्रदर्शित करने का पता लगाने के साथ साथ बताते हैं.

चित्र 2C: पूंछ फ्लिप गैर - विशाल circuitry द्वारा नियंत्रित है. एक और अधिक क्रमिक स्पर्श उत्तेजना जानवर की छाती के लिए दिया था. जबकि वीडियो पर कब्जा कर लिया आंदोलन सक्रिय सर्किट की स्पष्ट पहचान की अनुमति नहीं है, इलेक्ट्रॉनिक रिकॉर्डिंग एक विशाल कील की कमी है और बहुत छोटे deflections सक्रिय सर्किट (गैर - जी) की पहचान की होते हैं.

चित्र 3: भागने के सभी तीन प्रकार के लिए विलंबता माप पूंछ - flips. जांच से संपर्क करें और शारीरिक प्रतिक्रिया के बीच समय सात जानवरों के लिए मापा गया था. विशालकाय की मध्यस्थता पूंछ flips काफी गैर विशाल पूंछ flips से हासिल कर रहे हैं तेजी से.

चित्रा 1: एक रिकॉर्डिंग कुल लंबाई में 2.5-3.5 सेमी के जानवरों के लिए हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया चैम्बर के लिए एक उदाहरण है. स्नान इलेक्ट्रोड चैम्बर के विपरीत दिशा में चिपका रहे हैं जबकि जमीन तार चैम्बर के लंबे पक्ष से जुड़ा हुआ है और स्नान इलेक्ट्रोड को सीधा.

चित्रा 2: एकल वीडियो फ्रेम 1000 उत्तेजना के तीन अलग अलग प्रकार के लिए च / सेक और इसी इलेक्ट्रॉनिक रिकॉर्डिंग में दर्ज है.

ए) एक मजबूत स्पर्श उत्तेजना जानवर के सिर को दिया गया था और एक औसत दर्जे का विशाल (एमजी) पूंछ फ्लिप मध्यस्थता हासिल है . छह वीडियो फ्रेम बाईं पर प्रदर्शित कर रहे हैं. करने के लिए पशु का स्पर्श किया जाता जांच से रिकॉर्डिंग का पता लगाने भूरे रंग में दिखाया गया है, संपर्क के बिंदु काला arrowhead ने संकेत दिया है. रिकॉर्डिंग स्नान इलेक्ट्रोड के साथ प्राप्त ट्रेस नीले रंग में दिखाया गया है. इनसेट छोटे विशाल अक्षतंतु स्पाइक है कि बड़े phasic deflections पछाड़ से पता चलता है. ग्रे सलाखों वीडियो फ्रेम बाईं तरफ दिखाया गया है के अनुरूप है. क्रेफ़िश पूंछ की पहली उल्लेखनीय आंदोलन # 3 फ्रेम, सात मिलीसेकेंड में जांच के साथ संपर्क के बाद हुई.

बी) एक मजबूत स्पर्श उत्तेजना जानवर की पूंछ के लिए दिया गया था और एक पार्श्व विशाल (एलजी) हासिल मध्यस्थता पूंछ - फ्लिप . छह वीडियो फ्रेम बाईं पर प्रदर्शित कर रहे हैं. करने के लिए पशु का स्पर्श किया जाता जांच से रिकॉर्डिंग का पता लगाने भूरे रंग में दिखाया गया है, संपर्क के बिंदु काला arrowhead ने संकेत दिया है. रिकॉर्डिंग का पता लगाने के साथ प्राप्तस्नान इलेक्ट्रोड लाल रंग में दिखाया गया है. इनसेट छोटे विशाल अक्षतंतु स्पाइक है कि बड़े phasic deflections पछाड़ से पता चलता है. ग्रे सलाखों वीडियो फ्रेम बाईं तरफ दिखाया गया है के अनुरूप है. क्रेफ़िश पूंछ की पहली उल्लेखनीय आंदोलन # 3 फ्रेम, आठ मिलीसेकेंड में जांच के साथ संपर्क के बाद हुई.

सी) एक कमजोर और क्रमिक स्पर्श उत्तेजना जानवर के सिर को दिया गया था और एक गैर - विशाल (गैर जी) मध्यस्थता पूंछ - फ्लिप हासिल है . आठ वीडियो फ्रेम बाईं पर प्रदर्शित कर रहे हैं. करने के लिए पशु का स्पर्श किया जाता जांच से रिकॉर्डिंग का पता लगाने भूरे रंग में दिखाया गया है, संपर्क के बिंदु काला arrowhead ने संकेत दिया है. रिकॉर्डिंग स्नान इलेक्ट्रोड के साथ प्राप्त ट्रेस काले रंग में दिखाया गया है. ट्रेस विशाल कील क्षमता, बड़े प्रारंभिक deflections का अभाव है और बहुत छोटे आयाम की क्षमता के होते हैं. हल्की धूसर बार वीडियो फ्रेम बाईं तरफ दिखाया गया है के अनुरूप हैं. क्रेफ़िश पूंछ की पहली उल्लेखनीय आंदोलन जांच के साथ पहले से संपर्क के बाद फ्रेम # 6, 115 मिलीसेकेंड में हुई.

चित्रा 3: रिस्पांस दोनों लिंगों और इसी तरह के आकार के सात अलग - अलग जानवरों के लिए विलंबता माप (लंबाई मतलब ± stdv: 3.2 सेमी ± 0.2 सेमी, Telson करने के लिए मंच से मापा ). एमजी (नीली पट्टी) और एलजी (लाल पट्टी) पूंछ flips काफी कम की तुलना में प्रतिक्रिया सुप्तावस्था पूंछ flips गैर - जी (काली पट्टी) circuitry द्वारा मध्यस्थता. मतलब और मानक विचलन दिखाए जाते हैं. बार्स एक ही पत्र के साथ एक दूसरे से काफी अलग नहीं किया था (Wilcoxon हस्ताक्षरित श्रेष्टता श्रेणी परीक्षण जोड़ी वार, पी <0.05 तुलना के लिए).

Discussion

एकल न्यूरॉन गतिविधि या तंत्रिका सर्किट सक्रियण के गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग अनर्गल पशुओं में प्राप्त करना कठिन है. विधि यहाँ वर्णित करने के लिए स्वाभाविक रूप से व्यवहार घटनेवाला अंतर्निहित तंत्रिका सक्रियण के पैटर्न की पहचान करने का मतलब है प्रदान करता है.

अतीत में, हम सफलतापूर्वक इस तकनीक का इस्तेमाल सामाजिक प्रभुत्व ^एक पदानुक्रम के गठन के दौरान किशोर क्रेफ़िश के तंत्रिका बच सर्किट में गतिविधि के पैटर्न को ^{मापने,} प्राकृतिक 2 शिकारियों, और अधिक हाल ही में से हमलों के ^{दौरान} दृश्य 3 खतरों के जवाब में. वर्तमान में, हम सिंक्रनाइज़ स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग और उच्च गति वीडियो रिकॉर्डिंग का उपयोग क्रेफ़िश में बच व्यवहार के निष्पादन के दौरान सिर appendages के आंदोलनों के महत्व को मापने.

हालांकि इस तकनीक केवल दो अलग invertebrate प्रजातियों (क्रेफ़िश और dragonflies) और दो ​​अलग अलग ⁴ प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है है, यह संभावना लगता है कि यह रीढ़ सहित अन्य पशु मॉडल प्रणाली है, जिनमें से कुछ जलीय और एक्सप्रेस व्यवहार है कि लागू किया जा सकता बड़े न्यूरॉन्स द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, कई teleost मछली के तेजी से भागने प्रतिक्रियाओं Mauthner कोशिकाओं, बड़े से पहचाने जाने योग्य ^{न्यूरॉन्स} 5 के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. भागने व्यवहार Mauthner कोशिकाओं द्वारा मध्यस्थता साहित्य में ज्यादा ध्यान प्राप्त हुआ है और विश्लेषण के कई स्तरों पर अध्ययन किया गया है, अभी तक, वहाँ सबूत है कि Mauthner कोशिकाओं स्थितियों ^है कि 6,7 भागने के लिए असंबंधित हैं में तेजी से शरीर बदल जाता है नियंत्रण से बढ़ रहा है. सबूत है, तथापि, ज्यादातर Mauthner सेल गतिविधि के प्रत्यक्ष माप से और व्यवहार नहीं kinematical चर की तुलना से ली गई है. यह उच्च गति वीडियोग्राफी के साथ संयोजन में स्नान इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग क्षेत्र Mauthner कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न या मांसपेशियों गतिविधि जुड़े क्षमता को मापने के लिए उपयोग संभव हो सकता है.

इसकी वैज्ञानिक मूल्य के अलावा, इस तकनीक यहाँ वर्णित भी आदर्श शिक्षा (जैसे, स्नातक शिक्षण प्रयोगशालाओं) प्रयोजनों के अपने समग्र सादगी और inexpensiveness के कारण के लिए अनुकूल है.