Summary
자유롭게 동물 행동의 신경 활동 패턴의 비침습 측정은 고속 videography와 neurophysiological 레코딩을 결합하여 얻을 수 있습니다.
Abstract
신경 활동 및 대응 행동 표현의 패턴 사이의 관계는 억제 동물 구축하기가 어렵습니다. 전통 비침습 방법은 적어도 부분적으로 억제 연구 과목을 요구하고, 그들은 동시에 활성화된 뉴런 다수의 식별만을 허용합니다. 반면에, 뉴런 또는 개별 뉴런의 작은 ensembles은 크게 감소 준비에서 얻은 단일 셀 녹음을 사용하여 측정할 수 있습니다. 자연 행동의 표현이 억제 및 해부 동물에 제한이 있기 때문에, 그런 행동을 제어하는 기본 신경 메커니즘은 파악하기 어렵습니다.
자, 내가 자유롭게 동물을 행동의 신경 회로 활성을 측정 수있는 비침습 생리 기법을 제시한다. 물이 채워진 챔버 내부 와이어 전극의 쌍을 사용하여 목욕 전극 자연 또는 실험적 evoked 탈출 반응 동안 청소년 왕새우에 의해 생성된 신경 및 근육의 현장 잠재력을 기록합니다. 왕새우 기본 탈출 응답 자극의 시점에서 멀리 동물을 이동하는 꼬리 - 팅겨주는군요 세 가지 유형의에 의해 중재됩니다. 꼬리 - 플립의 각 유형은 자신의 신경 회로에 의해 제어되며 두 빠르고 가장 강력한 탈출 응답은 대형 명령 뉴런의 다른 세트의 활성화가 필요합니다. 행동 관찰와 함께, 목욕 전극 녹음이 뉴런의 모호하지 신분증과 관련된 신경 회로를 허용합니다. 따라서 자연스럽게 발생하는 문제가 근본적인 신경 회로의 활동이 억제 동물과 다른 행동 상황에서 측정할 수 있습니다.
Protocol
1 부 : 녹음 챔버
- 녹음 챔버는 직사각형 모양이며, 얇은 벽의 유리로 만들어진 것입니다. 챔버 크기는 8.5 cm 아르 X 2cm 2.5 동물 X 5cm (길이 X 너비 X 높이) - 3.5 cm 전체 길이 (텔슨에 연단에서 측정).
그림을 참조하십시오. 우리의 실험에 사용되는 챔버 예를 들어 1. - 또는 녹음 여왕님 기타 자료 (예, 무독성 투명한 플라스틱)에서 할 수 있습니다. 챔버의 크기는 각 실험 시리즈에 맞게해야 실험 절차와 챔버에 따라 다를 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 챔버의 크기는 자연 행동에 동물을 억제하지 않고 가능한 한 작게해야합니다. 엄지의 규칙으로, 길이와 챔버의 너비가 동물보다 3 배 크기해서는 안됩니다.
2 부 : 목욕 전극과 접지 와이어
- 한 기록 전극의 쌍 및 접지 전극이 사용됩니다. 전극은 절연 구리선 (0.25 mm 절연와 26 AWG)의 만들어집니다. 욕조 전극의 한쪽 끝을는 세포 증폭기 (AM 시스템 1700, 아래 참조)에 연결되어 있고 0.5 - 단열 1.0 mm는 다른 끝을에서 제외됩니다. 접지 와이어는 앰프 또는 다른 접지 설비 및 단열의 2~3센티미터의 접지에 연결되어있는 것은 다른 한쪽을 분해까지입니다.
- 목욕 전극과 접지 와이어는 무독성 접착제로 기록 챔버의 내부 벽면에 붙어있다. 녹화 전극이 서로 챔버와 반대 (그림 1)의 두 짧은 측면에서 중앙 위치입니다.
- 접지 전극은 기록 전극 (그림 1)에 기록 챔버 직각 중 하나가 긴 측면에 위치합니다.
- 상공 회의소는 탈이온수으로 가득합니다. 최상의 결과는 높은 저항의 물 (MΩ ~ 18)을 얻을 수 있습니다.
파트 3 : 바스 전극 레코딩
- 기록 전극의 출력은 세포 증폭기 (; 모델 1700 AM 시스템)에 의해 (1000x) 증폭됩니다. 기록 전극의 신호는 낮은 주파수의 조합 (<100 Hz에서) 높은 주파수 컷 - 싫어하는 (> 5 kHz에서)를 사용하여 필터링됩니다. 신호는 다음 스위치 박스와 데이터 수집 보드 (국가 악기)에 연결되어 있습니다. 디지털 데이터는 기록 저장 및 데이터 수집 소프트웨어 (Photron 모션 도구)를 사용하여 분석합니다.
- 디지털 데이터가 다른 상용 데이터 수집 소프트웨어를 (; Axoscope 예를 들어, MDS 분석 기술)를 사용하여 기록되기 전에, 또는 기록 전극에서 증폭된 신호는 다른 아날로그 - 디지털 컨버터 (Digidata 1,440 예, MDS 분석 기술)를 사용하여 디지털하실 수 있습니다.
부 4 : 자극 프로브
- 자극 프로브 미세 와이어 전극의 쌍을 갖춘 유리 피펫 (14cm 길이)의 이루어집니다. 전극 팁은 동물이 프로브에 의해 감동하는 전자 신호를 생성하기 위해 (0.2 mm) 노출됩니다. 이 자극의 정확한 시간을 측정할 수 있습니다.
- 자극 프로브의 출력은 세포 증폭기 (; 모델 1700 AM 시스템)에 의해 (1000x) 증폭됩니다. 신호는 낮은 주파수의 조합 (<100 Hz에서) 높은 주파수 컷 - 싫어하는 (> 5 kHz에서)를 사용하여 필터링됩니다. 신호는 다음 스위치 박스와 데이터 수집 보드 (국가 악기)에 연결되어 있습니다. 디지털 데이터는 기록 저장 및 데이터 수집 소프트웨어 (Photron 모션 도구)를 사용하여 분석합니다.
제 5 부 : 비디오 레코딩
- 고속 비디오 카메라 (Fastcam - X 1280 PCI, Photron)은 측면보기를 제공하기 위해 녹화 실로 수직 위치입니다. 레코딩 챔버 내부의 밝기 레벨은 거위 목 조명기 또는 기타 focusable 광원을 사용하여 예 : 최상의 결과를 제공하기 위해 조정해야합니다.
- 고속 videography가 결합하여 브레이크 아웃 박스 및 데이터 수집 보드 (내쇼날 인 스트 루먼트)를 사용하여 전자 기록과 동기화됩니다. 목욕 전극에서 증폭된 신호는 BNC 케이블을 사용하여 브레이크 아웃 박스와 데이터 수집 보드에 연결됩니다. 외부 손으로 스위치 트리거는 동기화된 비디오 및 데이터 수집을 시작합니다.
6 부 : 실험 절차
- 하나의 동물이 챔버로 도입하고 5 분 순응 수 있습니다. 이스케이프 꼬리를 방방 뜬다는 각각 머리 또는 복부에 서로 다른 강도의 단일 도청 장치에 의해 elicited 수 있습니다. 도청의 강도는 실험자에 의해 제어됩니다. 각 탈출 꼬리 - 플립은 25 kHz에서에서 기록된 전자 분야의 잠재력 1000 F / 초, 데이터 포인트의 프레임 속도로 고속 동영상 기록됩니다. 목욕 및 비디오 녹화의 시작은 트리거 상자에서 수동으로 스위치에 의해 시작됩니다. 녹화 시간은 선택한 프레임 속도 (예 : 1000 F / 초 = 4 초 총 녹화 시간)에 의해 결정됩니다. 우편 및 사전 트리거 녹화 시간을 선택할 수 있습니다.
- 아니E : 바스 전극 기록이 다른 사용 가능한 레코딩 방식 욕조 전극 기록을 결합하여 각 검사 종류에 대해 한 번 확인해야합니다. 크레이 피쉬에서 실버 전극 한 켤레가 수술 복부 신경 코드 주위에 이식 수 있습니다. 탈출 꼬리를 팅겨주는군요 도출 자극이 적용 이식 및 목욕 전극을 비교할 수의 전자 흔적을 기록하실 수 있습니다.
- 꼬리 - 플립 행동과 해당 신경 활동이 다른 문맥 다양한 기록할 수, 시각 위협에 대응 예를 들어, 육식 동물의 공격 중에, 또는 두 왕새우 무리한 조우하는 동안을 탈출. 챔버 크기, 촬영 모드 등 (토론 참조) 이에 따라 조정되어야한다.
7 부 : 데이터 분석
- 단일 비디오 프레임은 모션 도구 소프트웨어 (Photron)를 사용 분석하고 있습니다. 전자 흔적은 각 자극에 의해 활성화된 신경 회로의 종류를 식별하는 데 사용됩니다. 비디오 데이터는 동물의 움직임과 활성화된 신경 회로를 결정하는 동기 생리적 녹음 비교합니다. 각 활성 회로 특성 전자 서명 (대표 결과를 참조) 생산하고 있습니다.
- 프로브 연락처 및 신경 / 근육 응답 사이의 지연 시간은 프로브 신호의 발병과 목욕 전극로 기록된 신호의 발병 사이의 지연 시간을 측정하여 각 실험에 대해 계산됩니다.
8 부 : 대표 결과
소년 왕새우 머리 또는 꼬리 (그림 2)에 전달 촉각 자극에 대한 응답으로 단일 고속 비디오 프레임과 탈출 꼬리 - 플립을 위해 해당 전기장 레코딩 시리즈.
그림. 2A : 머리에 강력한 촉각 자극은 중간 거대한 회로에 의해 통제 꼬리 - 플립을 evoked. 거대한 신경 세포 (별표)와 다음과 대형 phasic 편향의 기록 스파이크가 아닌 모호한 신원 꼬리 - 플립 거대한 신경 세포 활동에 의해 중재로 수 있습니다. 비디오 흔적에 나타난 뒤로 운동이 활성화된 신경 회로 (MG)의 신원을 결정합니다.
그림. 2B : 강한 촉각 자극 후 측면 거대한 회로에 의해 타일 - 플립 중재는 꼬리에 적용되었다. 동영상에서 볼 상향 앞으로 움직임은 거대한 스파이크와 대형 phasic 초기 편향이 활성화된 신경 회로 (LG)의 신원을 결정을 표시하는 동기 전자 추적과 함께 흔적.
그림. 2C : 타일 - 플립이 아닌 거대한 회로에 의해 제어. 더 점차 촉각 자극은 동물의 근육에 전달했다. 비디오 캡처 운동은 활성 회로의 모호하지 신분을 허용하지 않는 반면, 전자 기록은 거대한 스파이크를 결여하고 활성 회로 (비 - G)를 식별하는 아주 작은 deflections로 구성되어 있습니다.
그림. 3 : 탈출의 모든 세 가지 유형에 대한 대기 시간 측정 꼬리가 화나게하다. 프로브 연락처 및 생리적 반응 사이의 시간 7 동물 측정되었다. 장 - 중재 꼬리 - 방방 뜬다는 빠른 아닌 거대한 꼬리가 - 팅겨주는군요보다 훨씬 elicited 수 있습니다.
그림 1 : 전체 길이 2.5-3.5 cm의 동물 실험에 사용되는 기록 챔버에 대한 예. 접지 와이어는 챔버의 긴 측면에 붙어 목욕 전극에 수직하는 동안 목욕탕 전극은 챔버의 반대편에 붙어 있습니다.
그림 2 : 자극을 세 가지 유형의 1000 F / 초 및 해당 전자 기록에 기록된 단일 비디오 프레임.
A) 강한 촉각 자극은 동물의 머리에 전달하고 중간 거대한 (MG)는 꼬리 - 플립 중재 elicited했다. 식스 비디오 프레임은 왼쪽에 표시됩니다. 동물을 터치하는 데 사용되는 프로브에서 기록 추적은 회색으로 표시됩니다, 접촉의 요점은 검정색 화살촉으로 표시됩니다. 목욕 전극과 함께 얻은 레코딩 추적이 파란색으로 표시됩니다. 삽입된 페이지는 큰 phasic deflections을 앞에 작은 거대한 축삭의 스파이크를 보여줍니다. 그레이 바는 왼쪽에 표시된 비디오 프레임에 해당합니다. 크레이 피쉬 꼬리의 첫 번째 주목할 움직임은 프로브와 접촉 후 프레임 # 3, 일곱 밀리초에서 발생했습니다.
B) 강한 촉각 자극이 동물의 꼬리에게 전달되었으며 꼬리 - 플립 중재 측면 거대한 (LG)를 elicited. 식스 비디오 프레임은 왼쪽에 표시됩니다. 동물을 터치하는 데 사용되는 프로브에서 기록 추적은 회색으로 표시됩니다, 접촉의 요점은 검정색 화살촉으로 표시됩니다. 기록 추적과 취득목욕 전극은 빨간색으로 표시됩니다. 삽입된 페이지는 큰 phasic deflections을 앞에 작은 거대한 축삭의 스파이크를 보여줍니다. 그레이 바는 왼쪽에 표시된 비디오 프레임에 해당합니다. 크레이 피쉬 꼬리의 첫 번째 주목할 움직임은 프로브와 접촉 후 프레임 # 3, 여덟 밀리초에서 발생했습니다.
C) 나약하고 점진적 촉각 자극은 동물의 머리에 배달하고 이외의 거대한 (비 - G) 중재 꼬리 - 플립을 elicited했다. 에이트 비디오 프레임은 왼쪽에 표시됩니다. 동물을 터치하는 데 사용되는 프로브에서 기록 추적은 회색으로 표시됩니다, 접촉의 요점은 검정색 화살촉으로 표시됩니다. 목욕 전극과 함께 얻은 레코딩 추적은 검은색으로 표시됩니다. 추적 거대한 스파이크 가능성이 큰 초기 deflections이 부족하고 많은 작은 진폭의 가능성으로 구성되어 있습니다. 밝은 회색 막대는 왼쪽에 표시된 비디오 프레임에 해당합니다. 크레이 피쉬 꼬리의 첫 번째 주목할 움직임은 프로브와 첫 접촉 후 프레임 # 6, 115 밀리초에서 발생했습니다.
그림 3 : 남녀와 유사한 크기 모두 7 가지 동물에 대한 응답 대기 시간 측정 (길이를 의미 ± stdv : 3.2 cm ± 0.2 cm, 텔슨에 연단에서 측정). MG (파란색 막대)와 LG 전자 (적색 막대) 팅겨주는군요 - 꼬리보다 훨씬 짧은 응답 대기 시간을 가지고 꼬리 - 팅겨주는군요 비 - G (검은 막대) 회로에 의해 중재. 의미 및 표준 편차가 표시됩니다. 같은 글자로 바 (한쌍 - 현명한 비교, P는 <0.05에 대한 윌콕슨이 체결 순위 테스트) 서로 크게 다를하지 않았다.
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Discussion
단일 신경 세포의 활동이나 신경 회로 활성화 비침습 녹음 억제 동물 얻기 어렵습니다. 방법은 여기에서 설명한이 자연스럽게 동작을 발생 근본적인 신경 활성화의 패턴을 식별하는 수단을 제공합니다.
과거에는, 우리는 성공적으로 영상 위협 3에 대한 응답으로, 더 최근에는 천연 육식 동물 2,에서 공격하는 동안, 사회적 지배 계층 1의 형성 기간 동안 청소년 왕새우 신경 탈출 회로의 활동 패턴을 측정하기 위해이 기술을 사용합니다. 현재, 우리는 왕새우에서 탈출 행동을 실행하는 동안 머리 부속의 움직임의 중요성을 측정하는 동기 목욕 전극 녹음 및 고속 비디오 레코딩을 사용합니다.
이 기술은 단 두 개의 서로 다른 무척추 동물의 종 (왕새우와 잠자리)과 두 개의 다른 실험실 4에서 사용하고있는 동안, 그것이 그 수생 표현 동작 몇 가지 중 척추 동물 등 다른 동물 모델 시스템에 적용할 수있는 가능성이 보인다 대형 뉴런에 의해 제어됩니다. 예를 들어, 많은 teleost 물고기의 빠른 탈출 응답 Mauthner 세포, 대형 식별 뉴런 5 제어됩니다. Mauthner 세포에 의해 매개 탈출 문제는 문학에 많은 관심을 받았습니다 및 분석 여러 수준에서 연구되어, 아직 Mauthner 세포가 6,7를 탈출하기 위해 관련이없는 상황에서 급속한 신체 순서를 제어하는 증거가 증가하고있다. 증거, 그러나, 대부분 Mauthner 세포 활동의 직접적인 측정의 행동과하지 kinematical 변수를 비교에서 파생됩니다. 그것은 Mauthner 세포에 의해 생성이나 근육 활동을 관련 분야의 잠재력을 측정하는 고속 videography와 함께 목욕 전극을 사용하여 녹음 가능있을 수 있습니다.
그 과학적 가치뿐만 아니라, 기술이 여기에 설명된도 이상의 전반적인 단순 성과 inexpensiveness에 의한 교육의 목적 (예 : 학부 교육 연구소)에 적합합니다.
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Acknowledgments
목욕 녹음 기술이 처음 프리클 (1984) 8 비올 외 의해 사용되었다. 꼬리 - 화나게하는 동안 생성된 전기 분야를 측정하기 위해 (1990) 9. 기술은 나중에 수정과 그의 전 대학원생 박사 Fadi A. 이사와 전 박사와 연관 박사 젠스 Herberholz로 박사 도널드 에드워즈 (조지아 주립 대학)의 실험실에서 개선되었습니다. 또한 개선 되었어요과 새로운 연구 응용 프로그램은 메릴랜드 대학에서 박사 젠스 Herberholz의 연구실에서 테스트되었습니다. 나는 내가 실험에 도움을 위해서 자기의 고속 비디오 시스템 및 연구 보조 데이비드 Rotstein와 윌리엄 리덴를 사용셔서 나의 동료 데이빗 예이거 감사하고 싶습니다.
References
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
- Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
