Summary
Неинвазивная измерения нейронные структуры деятельности в свободное поведение животных получаются путем объединения нейрофизиологические записи с высокой скоростью видеосъемка.
Abstract
Отношения между паттернов нейронной активности, и соответствующие поведенческие выражения трудно установить в безудержной животных. Традиционные неинвазивные методы требуют по крайней мере частично сдержан субъектов исследований, и они лишь позволяют идентифицировать большое количество одновременно активированных нейронов. С другой стороны, малые ансамбли нейронов или отдельных нейронов может быть измерена с помощью одноклеточных записей, полученных от в значительной степени снижается препаратов. Так как выражение естественного поведения ограничен в сдержанной и расчлененных животных, лежащий в основе нейронных механизмов, которые контролируют такое поведение трудно определить.
Здесь я представляю неинвазивных физиологических техника, которая позволяет измерять нейронную активацию замыкания в свободное поведение животных. Используя пару проволочных электродов внутри заполненные водой камеры, ванны электроды записи нервные и мышечные потенциалы поля порожденных несовершеннолетних раков во время стихийных или экспериментально вызывали ответы бежать. Ответных мер по первичной избежать раков опосредованы три различных типа хвостом сальто, которые перемещаются животных от точки стимуляции. Каждый тип хвоста-флип находится под контролем свои нейронные цепи; два самых быстрых и мощных ответы избежать требует активации различных наборов больших нейронов команды. В сочетании с поведенческими наблюдения, записи ванне электродов позволяют однозначно идентифицировать этих нейронов и нейронных цепей, связанных. Таким образом деятельность нервной системы лежащий в основе естественного поведения может быть измерена в безудержной животных и в различных поведенческих контекстах.
Protocol
Часть 1: Запись камеры
- Запись камеры имеет прямоугольную форму и изготовлен из тонкостенных стекла. Палата размеры 8,5 см х 2 см х 5 см (длина х ширина х высота) для животных в 2,5 - 3,5 см, общая длина (измеряется от трибуны тельсона).
См. рис. 1 для примера камера, используемая в наших экспериментах. - Кроме того, записи камер могут быть изготовлены из других материалов (например, нетоксичный прозрачный пластик). Палаты размер может варьироваться в зависимости от экспериментальной процедуры и камеры должны быть настроены для каждой экспериментальной серии. Для достижения наилучших результатов камерой размер должен быть как можно меньше, без ограничения перемещения животных в их естественной поведения. Как правило, длина и ширина камеры не должны быть более чем в три раза размера животного.
Часть 2: ванны электроды и провода заземления
- Одна пара записи электроды и электрод используется. Электроды изготовлены из изолированной медной проволоки (26 AWG с изоляцией 0,25 мм). Один конец ванны электродов подключается к усилителю внеклеточной (AM Системы 1700, см. ниже) и 0,5 - 1,0 мм изоляции снял других целей. Заземляющий провод соединен с землей из усилителя или любым другим заземленным оборудованием и 2-3 см изоляции сняли с другого конца.
- Ванна электроды и провода заземления прикрепляются к стенкам камеры записи с помощью нетоксичных клея. Запись электроды располагаются централизованно на обе короткие стороны камеры и друг против друга (рис. 1).
- Земля электрод располагается на одной длинной стороне перпендикулярной записи камеры записи электроды (рис. 1).
- Палата заполнена деионизированной водой. Лучшие результаты получены с водой высокой устойчивостью (~ 18 МОм).
Часть 3: записи ванны электродом
- Выходы из записи электродов усиливается (1000x) с внеклеточной усилителя (АМ системы; модель 1700). Сигнал от электродов записи фильтруется с помощью комбинации низких частот (<100 Гц) и высокочастотные отключений (> 5 кГц). Сигнал затем подключен к распределительной коробки и платы сбора данных (National Instruments). Оцифрованные данные записываются, хранятся и анализируются с помощью ПО для сбора данных (Photron движения Tools).
- Кроме того, усиленный сигнал от электродов записи могут быть оцифрованы с использованием других аналого-цифровых преобразователей (например, MDS Аналитические технологии; DIGIDATA 1440), прежде чем оцифрованные данные записываются с помощью других имеющихся в продаже ПО для сбора данных (например, MDS Аналитические технологии; Axoscope).
Часть 4: Стимулирование зонд
- Стимулирующий зонд состоит из стеклянной пипетки (14 см длиной), оснащенный парой тонких электродов проволоки. Электрод советы подвергаются (0,2 мм) для производства электронный сигнал, когда животное тронут зонда. Это позволяет измерять точное время стимуляции.
- Выходы из стимулирующих зонд усиливаются (1000x) по внеклеточной усилителя (АМ системы; модель 1700). Сигнал фильтруется с помощью комбинации низких частот (<100 Гц) и высокочастотные отключений (> 5 кГц). Затем сигнал подключен к распределительной коробки и платы сбора данных (National Instruments). Оцифрованные данные записываются, хранятся и анализируются с помощью ПО для сбора данных (Photron движения Tools).
Часть 5: Видеозаписи
- Высокоскоростные видеокамеры (FastCAM-X 1280 PCI, Photron) расположен перпендикулярно записи камеры предоставить вид сбоку. Уровень яркости внутри записи камеры должны быть скорректированы обеспечить наилучшие результаты, например, с помощью гусиного шеи осветителя или другой фокус источников света.
- Высокоскоростная видеосъемка сочетается и синхронизироваться с электронной записи на основе коммутационной панели и плата сбора данных (National Instruments). Усиленный сигнал от электродов ванны подключен к коммутационной панели и сбора данных плату с помощью BNC-кабелей. Внешнего ручного переключения триггера начинает синхронизироваться видео и сбора данных.
Часть 6: Методика эксперимента
- Одного животного вводится в камеру и позволили, чтобы акклиматизироваться в течение 5 минут. Побег хвост-флипов выявляются одиночными краны различной интенсивности в голову или живот, соответственно. Интенсивность краны находится под контролем экспериментатора. Каждый побег хвост-флип фиксируется с высокоскоростным видео с частотой кадров до 1000 F / сек, а точки данных электронных потенциалов поля записываются при 25 кГц. Начало ванны и возможностью записи видео инициируется ручного переключателя на окна триггера. Время записи определяется выбранной частоты кадров (например, 1000 F / сек = 4 сек общее время записи). После и перед срабатыванием триггера время записи может быть выбран.
- Нее: записи ванны электрод должен быть проверен один раз для каждой исследованных видов путем объединения записей ванны электрода с другими существующими методами записи. В раков, пару серебряных электродов может быть имплантируется вокруг брюшной нервной цепочки. Стимулы вызывая выход хвоста переворачивает может быть применен и записанные электронные следы имплантированных электродов и ванной можно сравнить.
- Побег хвост-флип поведение и соответствующий нейронной активности могут быть записаны в различных контекстах, например, в ответ на визуальные угрозы, во время нападения хищников, или во время агонистического встречи двух раков. Размер камеры, режим записи и т.д. должна быть скорректирована соответствующим образом (см. Обсуждение).
Часть 7: Анализ данных
- Одноместный видеокадров анализируются с помощью программного обеспечения движение инструмента (Photron). Электронные следы используются для идентификации типов нейронных схеме, которая была установлена на каждый раздражитель. Видео данные сравниваются с синхронизированных записей физиологических, чтобы определить движение животных и активированный нейронные цепи. Каждый активированный схема издает характерный электронной подписи (см. представитель результатов).
- Задержка между зондом контактов и нейронные / мышечная реакция рассчитываются для каждого эксперимента по измерению задержки между началом пробного сигнала и началом сигнала, записанных с ванной электродов.
Часть 8: Представитель результаты
Серия одиночных высокоскоростного видео кадров и соответствующих электрических полевых записей для побега хвост-флип в ответ на тактильное раздражение доставлены в голову или хвост несовершеннолетних раков (рис. 2).
Рис. 2А: Сильные тактильных стимулов для головы вызвала хвост-флип контролируется медиальной гигантские цепи. Записал всплеск гигант нейрона (звездочки) и большой фазовый отклонение, которое следует позволяет без неоднозначной идентификации хвост-флип при посредничестве гигант активности нейрона. Задний ход показано на видео следы определяет идентичность активированный нейронные цепи (MG).
Рис. 2B: Хвост-флип посредничестве боковой контур гигантской после сильного тактильный стимул был применен к хвосту. Вверх и вперед движения видели в видео следы вместе с синхронизированной электронные следы отображения гигантский пик и большой, фазовые начального отклонения определяет идентичность активированный нейронные цепи (LG).
Рис. 2С: Хвост-флип контролируется не-гигант схемы. Более постепенным тактильный стимул был доставлен в грудную клетку животного. В то время как движение, снятые на видео не позволяет однозначно идентифицировать активированный цепи, электронная запись не хватает гигант шип и состоит из гораздо меньших отклонений определения активированного контура (Non-G).
Рис. 3: Задержка измерений для всех трех типов избежать хвост сальто. Время между контакта зонда и физиологическая реакция измерялась в течение семи животных. Гигант-опосредованной хвост-флипов выявляются значительно быстрее, чем не-гигант хвост сальто.
Рисунок 1: пример для записи камеры, используемые в наших экспериментах на животных 2,5-3,5 см в общей длины. Ванны электроды приклеены к противоположным сторонам камеры в то время как заземляющий провод крепится к длинной стороне камеры и перпендикулярно к ванне электродов.
Рисунок 2: отдельные кадры видео, записанного при 1000 F / сек и соответствующих электронных записей для трех различных типов стимуляции.
А) сильный тактильный стимул был доставлен в голову животного и вызвал медиальной гигант (МГ) опосредованы хвост-флип. Шесть видео-кадры отображаются слева. Запись след от датчика, используемого трогать животное будет серым, точка контакта указывается черные стрелки. Запись следа, полученные с ванной электродов показаны синим цветом. Вставке показан небольшой шип аксон гигант, который предшествует большой фазовый отклонений. Серый баров соответствуют видео-кадрах показано на рисунке слева. Первое заметное движение хвоста раков произошел в кадре № 3, семь миллисекунд после контакта с зондом.
Б) сильный тактильный стимул был доставлен в хвост животного и вызвал гигантский боковой (LG) опосредованы хвост-флип. Шесть видео-кадры отображаются слева. Запись след от датчика, используемого трогать животное будет серым, точка контакта указывается черные стрелки. Запись следа, полученные сванны электроды отображается красным цветом. Вставке показан небольшой шип аксон гигант, который предшествует большой фазовый отклонений. Серый баров соответствуют видео-кадрах показано на рисунке слева. Первое заметное движение хвоста раков произошел в кадре № 3, восемь миллисекунд после контакта с зондом.
С), слабые и постепенное тактильный стимул был доставлен в голову животного и вызвало не-гигант (Non-G) опосредованы хвост-флип. Восемь видео-кадры отображаются слева. Запись след от датчика, используемого трогать животное будет серым, точка контакта указывается черные стрелки. Запись следа, полученные с ванной электродов приведена на черном. Следа не хватает гигантский потенциал шип, больших начальных отклонениях и состоит из потенциалов гораздо меньшей амплитудой. Светло-серый баров соответствуют видео-кадрах показано на рисунке слева. Первое заметное движение хвоста раков произошел в кадре № 6, 115 миллисекунд после первого контакта с зондом.
Рисунок 3: Ответ задержки измерений для семи различных животных обоих полов и аналогичных размеров (средняя длина ± stdv: 3,2 см ± 0,2 см, измеренная от трибуны тельсона). MG (синяя полоса) и LG (красная полоса) хвост-флипов значительно короче, чем задержки ответа хвост-флипов посредничестве Non-G (черная полоса) схемы. Средства и стандартные отклонения показано на рисунке. Бары с той же буквы существенно не отличались друг от друга (Уилкоксона ранг тест для попарного сравнения, р <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неинвазивная записи одной нейронной активности или нервных активации схемы трудно получить в безудержной животных. Метод, описанный здесь, является средством для идентификации паттернов нейронной активации основного естественного поведения.
В прошлом мы успешно использовали этот метод для измерения паттерны активности в нейронных цепей побега несовершеннолетних раков в процессе формирования социальных иерархиях доминирования 1, во время нападений от естественных хищников 2, а в последнее время, в ответ на визуальные угроз 3. В настоящее время мы используем синхронизированный ванны электродом записей и высокоскоростных видеозаписей для оценки важности движениями головы придатков во время выполнения избежать поведения у раки.
Хотя этот метод использовался только в двух разных видов беспозвоночных (раков и стрекоз) и в двух разных лабораториях 4, вполне вероятно, что она может быть применена к другим животным модельных систем, в том числе позвоночных животных, некоторые из которых являются водные и поведения, которые выражают контролируются крупными нейронами. Например, быстрые ответы избежать многих рыб костистых находятся под контролем клетки Маутнер, большие идентифицируемых нейронов 5. Побег поведение опосредовано клетками Маутнер уделяется большое внимание в литературе и изучалось на нескольких уровнях анализа, тем не менее, появляется все больше доказательств того, что Маутнер контрольными клетками быстрого оказывается тела в ситуациях, которые не имеют отношения к побег 6,7. Свидетельство, однако, в основном основе сравнения кинематических переменных поведения, а не из прямых измерений активности клеток Маутнер. Это может быть целесообразно использовать записи ванне электродов в сочетании с высокоскоростной видеосъемки для измерения потенциалов поля порожденные клетки Маутнер или связанное с ним мышечной деятельности.
В дополнение к своей научной ценности, технику, описанную здесь также идеально подходит для образовательных целей (например, студентов лаборатории обучения) в связи с общей простоте и дешевизне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Техника ванны записи был впервые использован Фрике (1984) 8 и Билл и соавт. (1990) 9 для измерения электрических полей, создаваемых во время хвост сальто. Техника позже изменены и улучшены в лаборатории д-р Дональд Эдвардс (Университет штата Джорджия) его бывшим аспирантом доктора Фади Исса А. и его бывший Хавин Доктор Йенс Herberholz. Дальнейшие усовершенствования были сделаны и новые приложения исследования были протестированы в лаборатории доктор Йенс Herberholz в Университете Мэриленда. Я хотел бы поблагодарить моего коллегу доктор Дэвид Ягер, что сообщили мне использовать свои высокоскоростные системы видео-и мои научные сотрудники Дэвид Ротштейн и Уильям Лиден за помощь в экспериментах.
References
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
- Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
