Summary
在自由的行为的动物的神经活动模式的非侵入性测量是通过结合神经生理学的高速录像录音。
Abstract
奔放的动物的神经活动和相应的行为表现模式之间的关系是很难建立。传统的非侵入性的方法需要至少部分内敛的研究课题，他们只允许同时激活的神经元大量的鉴定。另一方面，小合奏的神经元或个人神经元只能使用从很大程度上减少了筹备工作取得的单细胞记录。由于自然行为表达的是克制和解剖动物有限，基本控制这种行为的神经机制是难以辨认。
在这里，我提出了一种非侵入性的生理的技术，使测量在自由地表现动物的神经回路的激活。使用一对电极丝内充水室，洗澡的电极记录神经和肌肉的领域产生的少年小龙虾在自然的或实验诱发逃避反应的潜力。小龙虾的主要逃生反应介导的三个不同类型的尾翻转移动点刺激的动物。每种类型的尾巴翻转控制自己的神经回路;最快和最强大的的两个逃生反应需要两套不同的大型命令神经元的激活。浴电极录音与行为观察相结合，可以明确识别这些神经元和相关的神经回路。因此自然发生的行为背后的神经电路的活动可以测量奔放的动物，在不同的行为中。
Protocol
第1部分：录音室
- 录音室是长方形的薄壁玻璃。商会尺寸为8.5厘米× 2厘米× 5厘米（长x宽x高）动物为2.5 - 3.5厘米（从主席台到尾节）总长度。
见图。例如在我们的实验中使用的一腔1。 - 或者可以从其他材料（例如，无毒的透明塑料），录音室。钱伯斯的大小可能会有所不同根据实验过程和商会应为每一个实验系列定制。为了达到最佳效果，室尺寸应尽可能小，而不限制在他们的自然行为的动物。作为一个经验法则，室的长度和宽度不应动物的大小的三倍以上。
第2部分：浴电极和地线
- 一对记录电极和接地电极。电极是由绝缘铜线（0.25毫米绝缘AWG 26）。洗澡电极的一端连接到细胞外放大器（AM系统1700，见下文）和0.5 - 1.0 mm的绝缘层剥离的另一端。接地线连接到放大器或任何其他接地设备和保温2-3厘米的地面被剥离的另一端。
- 浴电极和接地线连接到录音室的内壁无毒胶水。记录电极定位集中室和彼此相反（图1）的两个短边。
- 接地电极定位在一个长边垂直记录电极（图1）的录音室。
- 商会是充满了去离子水。最好的结果是获得高抗水（〜18MΩ）。
第3部分：浴电极记录
- 记录电极的输出被放大外放大器（AM系统; 1700型）（1000倍）。从记录电极的信号进行滤波，使用低频率的组合（<100赫兹）和高截止频率平衡（> 5千赫）。信号，然后连接到一个开关盒和数据采集板（美国国家仪器公司）。数字化的数据记录，存储，并使用数据采集软件（Photron Motion工具）进行分析。
- 另外，记录电极的信号放大可数字化之前的数字化数据记录使用其他市售的数据采集软件（例如，MDS分析技术; Axoscope）使用其他模拟数字转换器（例如，MDS分析技术; Digidata 1440）。
第4部分：刺激探头
- 刺激探头是一个配备一双细金属丝电极的玻璃吸管（长14厘米）。电极提示暴露（0.2毫米），动物是由探头接触时产生的电子信号。这使得来衡量的刺激的确切时间。
- 刺激探头的输出被放大外放大器（AM系统; 1700型）（1000倍）。信号进行过滤，使用低频率的组合（<100赫兹）和高截止频率平衡（> 5千赫）。信号，然后连接到一个开关盒和数据采集板（美国国家仪器公司）。数字化的数据记录，存储，并使用数据采集软件（Photron Motion工具）进行分析。
第5部分：视频录制
- 一个高速视频摄像机（Fastcam × 1280 PCI，Photron）垂直于录音室，提供了一个侧面看。录音室里面的亮度等级，必须进行调整，以提供最好的结果，例如，使用鹅颈照明或其他可聚焦光源。
- 高速录像相结合，并使用一个接线盒及数据采集板（美国国家仪器公司）的电子录音同步。从洗澡电极放大信号连接到接线盒和数据采集板，使用BNC电缆。外部的手开关触发启动的同步视频和数据采集。
第6部分：实验过程
- 一个单一的动物是引入室，并允许5分钟，以适应环境。逃生的尾巴，翻起引起不同强度的单水龙头头部或腹部，分别。水龙头的强度是受实验者。每个转义尾巴翻转记录帧速率在1000 F /秒，数据点的电子领域的潜力是在25 kHz高速视频记录。浴和录像开始启动触发盒上的手动开关。录音时间是由选定的帧速率（例如，1000 F /秒= 4秒的总录音时间）。邮政和预触发录像时间可以选择。
- 不E：浴电极记录应结合其他方法可用录音浴电极记录每个测试的物种，一旦被证实。小龙虾，可手术植入一对银电极周围的腹神经索。可用于刺激引出逃生尾巴翻转，并记录可以相比的植入和洗澡电极的电子痕迹。
- 逃生尾翻转行为和相应的神经活动，可在各种不同的背景下记录，在食肉动物的攻击，例如视觉威胁，或在斗殴遇到两个小龙虾。大小会议厅，录音模式等进行相应的调整（见讨论 ）。
第7部分：数据分析
- 单视频帧进行运动的工具软件（Photron）。电子痕迹是用来识别每个刺激被激活的神经回路的类型。视频数据相比，生理同步录音，以确定该动物的运动和激活的神经回路。每个激活电路产生特有的电子签名（ 见代表性的结果） 。
- 探针接触和神经/肌肉的反应之间的延迟计算每个实验，通过测量探头信号的发病和同浴电极记录信号的发病之间的延迟。
第8部分：代表结果
一个单一高速视频帧和相应的逃生尾巴翻转电场录音系列在交付少年小龙虾的头部或尾部（图2）触觉刺激的反应。
图2A：强烈的触觉刺激头部诱发尾部内侧巨头电路控制的翻转。记录的巨型神经元（星号）和大的阶段性偏转扣球使非模糊识别的尾巴翻转介导的由巨大的神经元活动。向后移动视频跟踪中确定激活的神经电路（MG）的身份。
图2B：强烈的触觉刺激后尾翻转横向巨头电路介导的尾巴。向上和向前运动的视频中看到的痕迹连同同步显示的巨穗大，阶段性的初步偏转决定激活的神经电路（LG）的身份的电子跟踪。
图2C：尾翻转非巨头电路控制。胸廓的动物被送到一个更渐进的触觉刺激。虽然在视频捕捉运动不允许明确识别激活电路，电子记录缺乏一个巨大的扣球和小得多的挠度确定激活电路（非G）组成。
图3：逃跑的所有三种类型的延迟测量的尾巴，翻起。探针接触和生理反应之间的时间测量七个动物。介导的巨尾翻转引起明显快于非巨尾翻转。
图1：总长度为2.5-3.5厘米的动物在我们的实验中用于录音室的一个例子。洗澡电极粘室的两侧，而接地线连接到室长边洗澡电极垂直。
图2：单在1000 F /秒和相应的三个不同类型的刺激的电子录音记录的视频帧。
A）强烈的触觉刺激被送到动物的头，引起内侧巨人（MG）介导的尾翻转。 6个视频帧显示在左侧。从触摸动物探头跟踪记录显示为灰色;接触点是由黑色箭头表示。同浴电极获得的记录跟踪显示为蓝色。插图显示了前面的大阶段性变形小巨人轴突尖峰。灰色条显示在左边的视频帧对应。探针接触后，小龙虾的尾巴的第一个显着的运动发生在帧＃3，七毫秒。
B）强烈的触觉刺激被送到动物的尾巴，引起了横向巨头（LG电子）介导的尾部翻转。 6个视频帧显示在左侧。从触摸动物探头跟踪记录显示为灰色;接触点是由黑色箭头表示。获得记录跟踪浴电极以红色显示。插图显示了前面的大阶段性变形小巨人轴突尖峰。灰色条显示在左边的视频帧对应。小龙虾的尾巴的第一个显着的运动发生在帧＃3，八毫秒后，用探针接触。
C）薄弱，循序渐进的触觉刺激被送到动物的头，并引起了非巨人（非G）介导的尾巴翻转。 8个视频帧显示在左侧。从触摸动物探头跟踪记录显示为灰色;接触点是由黑色箭头表示。同浴电极获得的记录跟踪显示为黑色。微量元素缺乏的巨穗潜力，大量的初始挠度和更小的幅度潜力。浅灰色条显示在左边的视频帧。小龙虾的尾巴的第一个显着的运动发生在＃6帧，115毫秒后的第一次接触探头。
图3：七男女及类似尺寸的不同动物的响应延迟测量（平均长度± stdv：3.2厘米± 0.2厘米，从讲台上尾节测量）。 MG（蓝色条）和LG（红色条）尾翻转比明显更短的响应延迟尾非G（黑条）电路翻转介导的。手段和标准差显示。同一封信酒吧没有显着差异（Wilcoxon符号秩检验成对比较，P <0.05）对方。
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Discussion
非侵入性的录音，单一的神经元活动或神经回路活化很难获得，奔放的动物。这里描述的方法提供了一种手段，以确定神经激活模式，基本自然发生的行为。
在过去，我们成功地使用这种技术来衡量少年小龙虾的神经逃脱电路的活动模式，在社会地位的层次1形成，在天敌2，最近的攻击，在 3种可视化的威胁。目前，我们使用同步的浴室电极录音和录像高速来衡量在小龙虾的逃逸行为的执行期间的头部附肢的运动的重要性。
虽然这项技术只被用于在两个不同的无脊椎动物（小龙虾和蜻蜓），并在两个不同的实验室4，似乎有可能，它可以适用于其他动物模型系统，包括脊椎动物，其中有一些水生生物和表达行为由大量的神经元控制。例如，许多硬骨鱼类的快速逃逸反应控制Mauthner细胞，大的可识别的神经元5。逃逸行为的Mauthner细胞介导的文献中已收到的重视，并已在几个层次上的分析研究;然而，有越来越多的证据表明，Mauthner 细胞控制逃脱6,7无关的情况下，快速的身体变成。然而，证据，主要是来自比较Mauthner细胞活动的直接测量的行为和不运动的变量。这可能是可行的，使用高速摄像浴电极记录的组合来衡量Mauthner细胞或肌肉活动产生的场电位。
除了它的科学价值，在这里描述的技术也非常适合用于教育目的（如本科教学实验室），由于其整体的简洁和廉。
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Acknowledgments
洗澡的录音技术最早是由皮尔斯（1984）8和北奥等。 （1990）9，测量尾翻转时产生的电场。该技术后来又修改和完善唐纳德爱德华兹（美国乔治亚州立大学）博士在他的前研究生博士发地答：伊萨和他的前博士后副延Herberholz博士的实验室。已作出进一步的改进，并在马里兰大学的新研究中的应用已经在实验室的博士延Herberholz的测试。我想感谢给我帮助与实验中使用他的高速视频系统和我的研究助理大卫Rotstein和威廉利登，我的同事大卫耶格尔博士。
References
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