Inspelningar av neurala Circuit Aktivering i fritt bete Djur

Summary

Icke-invasiv mätning av neural aktivitet mönster i fritt bete djur erhålls genom att kombinera neurofysiologiska inspelningar med hög hastighet Videografi.

Abstract

Förhållandet mellan mönster av neural aktivitet och motsvarande beteendemässiga uttryck är svårt att fastställa i ohämmad djur. Traditionella icke-invasiva metoder kräver åtminstone delvis återhållsamma försökspersoner, och de bara möjliggör identifiering av ett stort antal samtidigt aktiverade nervceller. Å andra sidan kan små ensembler av neuroner eller enskilda nervceller bara mätas med hjälp av encelliga inspelningar från i stort sett minskat förberedelser. Eftersom uttrycket av naturliga beteende är begränsad i återhållen och dissekerade djur, de underliggande neurala mekanismer som styr detta beteende är svåra att identifiera.

Här presenterar jag en icke-invasiv fysiologiska teknik som möjliggör mätning av neurala kretsar aktivering i fritt bete djur. Använda ett par av tråd elektroder inuti en vattenfylld kammare, badet elektroderna rekord neurala och muskulös fältet potentialer som genereras av unga kräftor under naturlig eller experimentellt framkallat fly svar. Den primära fly svar kräftor förmedlas av tre olika typer av svans-flips som rör sig djuren bort från den punkt stimulans. Varje typ av svans-flip styrs av sina egna neurala kretsar, de två snabbaste och mest kraftfulla fly svar kräver aktivering av olika uppsättningar av stora kommandot nervceller. I kombination med beteendeterapi observationer, badet elektroden inspelningarna kan otvetydig identifiering av dessa neuroner och tillhörande neurala kretsar. Således aktivitet neurala kretsar underliggande naturligt förekommande beteende kan mätas i ohämmad djur och i olika beteende sammanhang.

Protocol

Del 1: Inspelning kammaren

1. Inspelningen kammaren är av rektangulär form och är tillverkad av tunnväggiga glas. Avdelningen dimensioner är 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (längd x bredd x höjd) för djur på 2,5 - 3,5 cm längder (mätt från talarstolen till mellersta stjärtfenan).
   Se figur. 1 för ett exempel på en kammare som används i våra experiment.
2. Alternativt kan spela kammare göras från andra material (t.ex., giftfri klar plast). Chambers storlek kan variera beroende på experimentella förfarande och kammare bör skräddarsys för varje experimentell serie. För bästa resultat bör kammare storlek vara så liten som möjligt utan att hålla fast djuren i deras naturliga beteende. Som en tumregel bör längder och bredd kammaren inte vara mer än tre gånger storleken på djuret.

Del 2: Badkar elektroder och jordledning

1. Ett par spelar in elektroder och en jordelektrod används. Elektroder är gjorda av isolerad koppartråd (26 AWG med 0,25 mm isolering). Ena änden av badet elektroderna är ansluten till ett extracellulärt förstärkare (AM Systems 1700, se nedan) och 0,5 - 1,0 mm isolering är klädde av de andra ändarna. Jordkabeln är ansluten till marken av förstärkaren eller annan jordad utrustning och 2-3 cm på isoleringen som klädde av den andra änden.
2. Bad elektroder och jordledning är knutna till innerväggarna av inspelningen kammare med giftfritt lim. Inspelning elektroder placeras mitt på båda kortsidorna av kammaren och mitt emot varandra (Fig. 1).
3. Ground elektroden är placerad på ena långsidan av inspelningen kammaren vinkelrätt mot inspelning elektroderna (Fig. 1).
4. Kammaren är fylld med avjoniserat vatten. Bästa resultat uppnås med vatten av hög resistans (~ 18 Mohm).

Del 3: Bad elektrod inspelningar

1. Utgångar från inspelning elektroderna förstärks (1000x) med ett extracellulärt förstärkare (AM System, modell 1700). Signal från inspelningen elektroderna filtreras med hjälp av en kombination av lågfrekventa (<100 Hz) och hög frekvens cut-off (> 5 kHz). Signal kopplas sedan till en switch box och en datainsamling styrelse (National Instruments). Digitaliserad data registreras, lagras och analyseras med hjälp av datainsamling programvara (Photron Motion Tools).
2. Alternativt kan förstärkta signalen från inspelning elektroder ska digitaliseras med hjälp av andra analog-digital-omvandlare (t ex MDS Analytisk teknik; Digidata 1440) innan digitaliserade data registreras med hjälp av andra kommersiellt tillgängliga datainsamling programvara (t ex MDS Analytisk teknik; Axoscope).

Del 4: Stimulera sond

1. En stimulerande sond är gjord av ett glas pipett (14 cm längd) utrustad med ett par fina tråd elektroder. Elektrod tips är exponerade (0,2 mm) för att producera en elektronisk signal när djuret vidrörs av sonden. Detta gör det möjligt att mäta den exakta tidpunkten för stimulering.
2. Utgångar från stimulera sond förstärks (1000x) med ett extracellulärt förstärkare (AM System, modell 1700). Signalen filtreras med hjälp av en kombination av lågfrekventa (<100 Hz) och hög frekvens cut-off (> 5 kHz). Signalen kopplas sedan till en switch box och en datainsamling styrelse (National Instruments). Digitaliserad data registreras, lagras och analyseras med hjälp av datainsamling programvara (Photron Motion Tools).

Del 5: Videoinspelningar

1. En snabb videokamera (Fastcam-X-1280 PCI, Photron) är placerad vinkelrätt mot inspelningen kammaren för att ge en från sidan. Ljusstyrka inne i inspelningen kammaren måste justeras för att ge bästa resultat, t.ex. med hjälp av en gås-ringad belysning eller andra fokuserbara ljuskällor.
2. Snabb videography kombineras och synkroniseras med elektronisk inspelningar med en breakout box och datainsamling ombord (National Instruments). Förstärkta signalen från badet elektroderna är ansluten till breakout box och datainsamling kort med BNC-kablar. En extern hand-switch utlösa startar synkroniserade video och datainsamling.

Del 6: Tillvägagångssätt

1. En enda djur förs in i kammaren och får vänja sig i 5 minuter. Escape svans-flips utlöses genom en enda kranar av olika intensitet i huvudet eller buken, respektive. Intensiteten i kranar styrs av försöksledaren. Varje fly svans-luckan är inspelad med hög hastighet video med en hastighet på 1000 f / sek, och datapunkter av elektroniska fält potentialer redovisas till 25 kHz. Start av badet och videoinspelning inleds med manuell omkopplare på en utlösande faktor låda. Inspelningstiden är beroende av vald bildhastighet (t.ex. 1000 f / sek = 4 sek total inspelningstid). Post-och pre-trigger inspelningstiden kan väljas.
2. Intee: Bath elektrod inspelningar bör kontrolleras en gång för varje art som testas genom att kombinera inspelningar bad elektrod med andra tillgängliga inspelningar metoder. I kräftor, kan ett par silver elektroderna inopererade runt den ventrala nerv sladden. Stimuli framkallar fly svans-flips kan tillämpas och registreras elektroniskt spår av implantat och bad elektroder kan jämföras.
3. Escape svans-flip beteende och motsvarande neural aktivitet kan registreras i en mängd olika sammanhang, exempelvis som svar på visuella hot, under rovdjur attacker, eller under agonistiska möten av två kräftor. Avdelningen storlek, inspelningsläge, etc. måste anpassas därefter (se diskussion).

Del 7: Dataanalys

1. Enstaka videobildrutor analyseras med hjälp av programvara rörelse verktyg (Photron). Elektroniska spår används för att identifiera typen av neurala kretsen som aktiveras av varje stimulus. Video data jämförs med synkroniserad fysiologiska inspelningar att bestämma rörligheten för djuret och den aktiverade neurala kretsen. Varje aktiverad krets ger en karakteristisk elektronisk signatur (se representativa resultat).
2. Latens mellan sond kontakt och neurala / muskulösa svar beräknas för varje experiment genom att mäta tiden mellan uppkomsten av sonden signalen och uppkomsten av den signal som spelats in med badet elektroderna.

Del 8: representativa resultat

En serie av enstaka höghastighetsvideo ramar och motsvarande elektriska inspelningar fält för flykt svans-flip som svar på en taktil stimulans levereras till huvudet eller svansen på en juvenil kräftor (Fig. 2).

Fig.. 2A: Stark taktil stimulans till huvudet framkallat en svans-flip som styrs av den mediala jätte krets. Det inspelade spetsen av den gigantiska neuron (asterisker) och den stora phasic nedböjningen som följer gör att icke-tvetydigt identifiering av svansen-flip som förmedlas av gigantiska neuron aktivitet. Den bakåt visas i videon spår bestämmer identiteten på den aktiverade neurala kretsen (MG).

Fig.. 2B: Tail-flip medieras av laterala jätte kretsen efter en stark taktil stimulans har tillämpats på svansen. Uppåt och framåt ses i videon spår tillsammans med synkroniserade elektroniska spår som visar jätte spik och de stora, phasic initiala deformationen bestämmer identiteten på den aktiverade neurala kretsen (LG).

Fig.. 2C: Tail-flip som kontrolleras av icke-jätte kretsar. En mer gradvis taktil stimulans levererades till bröstkorgen av djuret. Medan rörelsen fångas på video inte tillåter entydig identifiering av den aktiverade kretsen saknar elektronisk registrering en gigantisk spik och består av mycket mindre nedböjningar identifiera den aktiverade kretsen (icke-G).

Fig.. 3: Latency mätningar för alla tre typer av fly svans-flips. Tid mellan sond kontakt och fysiologiska reaktioner mättes på sju djur. Jätte-medierad tail-flips är framkallade betydligt snabbare än icke-jätte tail-flips.

Figur 1: Ett exempel på en inspelning kammare används i våra experiment för djur av 2,5-3,5 cm i total längd. Badet elektroderna limmas till olika sidor av kammaren medan jordkabeln är fäst på den långa sidan av kammaren och vinkelrätt mot badet elektroderna.

Figur 2: Enkel videobildrutor in på 1000 f / sek och motsvarande elektroniska inspelningar för tre olika typer av stimulering.

A) En stark taktil stimulans överlämnades till chefen för djuret och framkallade en medial jätte (MG) ​​medierad svans-flip. Sex video-frames visas till vänster. Inspelning spår från sonden används för att röra djuret visas i grått, en kontaktpunkt indikeras av den svarta pilspetsen. Inspelning spåra erhålls med badet elektroderna visas i blått. Den infällda bilden visar den lilla spiken jätte axon som föregår den stora phasic nedböjningar. Grå staplar motsvarar video-frames visas till vänster. Den första märkbara rörelser kräftor svans inträffade vid ram # 3, sju millisekunder efter kontakt med sonden.

B) En stark taktil stimulans levererades till svansen på djuret och framkallade en lateral jätte (LG) medierad svans-flip. Sex video-frames visas till vänster. Inspelning spår från sonden används för att röra djuret visas i grått, en kontaktpunkt indikeras av den svarta pilspetsen. Inspelning spåra erhålls medbad elektroder visas i rött. Den infällda bilden visar den lilla spiken jätte axon som föregår den stora phasic nedböjningar. Grå staplar motsvarar video-frames visas till vänster. Den första märkbara rörelser kräftor svans inträffade vid ram # 3, åtta millisekunder efter kontakt med sonden.

C) En svag och gradvis taktil stimulans överlämnades till chefen för djuret och framkallade en icke-jätte (icke-G) medierad svans-flip. Åtta video-frames visas till vänster. Inspelning spår från sonden används för att röra djuret visas i grått, en kontaktpunkt indikeras av den svarta pilspetsen. Inspelning spåra erhålls med badet elektroderna visas i svart. Det spår saknar jätte spetsen potential, den stora initiala omläggningar och består av potentialer mycket mindre amplitud. Ljusgrå staplarna motsvarar video-frames visas till vänster. Den första märkbara rörelser kräftor svans inträffade vid ram # 6, 115 millisekunder efter den första kontakten med sonden.

Figur 3: Response latency mätningar för sju olika djur av båda könen och liknande storlek (genomsnittlig längd ± stdv: 3,2 cm ± 0,2 cm, mätt från talarstolen till mellersta stjärtfenan). MG (blå stapel) och LG (röd stapel) svans-flips har betydligt kortare svar latenser än tail-flips medierad av icke-G (svart fält) kretsar. Medelvärden och standardavvikelser redovisas. Barer med samma bokstav skiljer sig inte väsentligt från varandra (Wilcoxon Signed Rank test för parvisa jämförelser, p <0,05).

Discussion

Icke-invasiv inspelningar av enstaka neuron aktivitet eller neurala kretsen aktivering är svårt att få i ohämmad djur. Den metod som beskrivs här ger en möjlighet att identifiera mönster av neural aktivering underliggande naturligt beteende.

Förr i tiden använde vi med framgång denna teknik för att mäta mönster av aktivitet i neurala fly kretsar av ung kräftor under bildandet av social dominans hierarkier ^1, under attacker från naturliga fiender ^2, och mer nyligen, som svar på visuella hot ^3. För närvarande använder vi synkroniserade inspelningar bad elektrod och höghastighetståg videoinspelningar för att mäta vikten av rörelser huvudet bihang under genomförandet av flykten beteenden i kräftor.

Även denna teknik har bara använts i två olika ryggradslösa djur (kräftor och trollsländor) och i två olika laboratorier ^4, verkar det troligt att den kan tillämpas på andra system djurmodell, bland ryggradsdjuren, varav vissa är vattenlevande och uttrycka beteenden som styrs av stora nervceller. Till exempel är snabba flykt reaktioner hos många teleost fisk kontrolleras av Mauthner celler, stora identifierbara nervceller ^5. Escape beteende förmedlas av Mauthner cellerna har fått mycket uppmärksamhet i litteraturen och har studerats på flera nivåer för analys, men finns det alltfler tecken på att Mauthner celler kontroll snabba kroppen blir i situationer som inte är relaterade till flykten ^6,7. Bevisen är dock oftast kommer från att jämföra kinematiska variabler av de beteenden och inte från direkta mätningar av Mauthner cellernas aktivitet. Det kan vara möjligt att använda inspelningar bad elektrod i kombination med hög hastighet videography att mäta fält potentialer som genereras av Mauthner celler eller tillhörande muskelaktivitet.

Förutom det vetenskapliga värdet, som beskrivs tekniken här är också perfekt för utbildningsändamål (t.ex. grundutbildningen laboratorier) på grund av dess övergripande enkelhet och inexpensiveness.