Summary
Serbestçe hayvanlar davranıyor sinirsel aktivite desen non-invaziv ölçümler, yüksek hız videografisi ile nörofizyolojik kayıtları birleştirerek elde edilir.
Abstract
Nöral aktivitenin ve ilgili davranışsal ifade kalıpları arasındaki ilişkinin dizginlenmemiş hayvanlarda kurmak zordur. Geleneksel non-invaziv yöntemler, en azından kısmen ölçülü araştırma konuları gerektirir ve bunlar aynı anda aktif nöron çok sayıda kimlik sadece izin. Öte yandan, küçük bir nöron toplulukları ya da bireysel nöronlar sadece büyük ölçüde azaltılmış hazırlıkları elde edilen tek hücreli kayıtları kullanılarak ölçülür olabilir. Ölçülü ve disseke hayvanların doğal davranışı ifade sınırlı olduğundan, bu tür davranışları kontrol altında yatan nöral mekanizmaların tespit etmek zordur.
Burada, serbestçe hayvanlar davranıyor nöral devre aktivasyon ölçüm sağlayan bir non-invaziv fizyolojik tekniği mevcut. Su dolu bir kabin içerisinde bir çift tel elektrotlar kullanarak, banyo elektrotlar, sinir ve kas alan, doğal ya da deneysel uyarılmış kaçış tepkiler sırasında çocuk kerevit tarafından üretilen potansiyelleri kaydedin. Kerevit birincil kaçış yanıtları stimülasyon noktasından uzakta, hayvanların hareket kuyruk döndürür üç farklı türlerine göre aracılık eder. Kuyruk flip Her tür kendi nöral devre tarafından kontrol edilir, en hızlı ve en güçlü iki kaçış yanıtları farklı büyük komut nöronların setleri aktivasyonu gerektirir. Davranışsal gözlemler ile birlikte, banyo elektrot kayıtları açık kimliği ve bu nöronların ilişkili nöral devreler izin verir. Böylece doğal olarak ortaya çıkan davranışın altında yatan nöral devreleri faaliyet dizginlenmemiş hayvanlarda ve farklı davranış bağlamlarda ölçülebilir.
Protocol
Bölüm 1: Kayıt odasına
- Kayıt odası, dikdörtgen şeklinde ve ince duvarlı cam yapılır. Odası boyutları 8,5 cm x 2 cm hayvanlar için 2,5 x 5 cm (uzunluk x genişlik x yükseklik) - 3,5 cm toplam uzunluk (telzon için kürsüden ölçülen).
Bkz: Şekil. 1, deneylerde kullanılan bir oda bir örnek için. - Alternatif olarak, kayıt odaları, diğer malzemeler (örneğin, non-toksik şeffaf plastik) yapılabilir. Chambers boyutu her bir deney serisi için özelleştirilmiş olmalıdır deneysel prosedür ve odalarına göre farklılık gösterebilir. En iyi sonuç için, oda büyüklüğü, hayvanların doğal davranışlarını kısıtlama olmadan, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Genel bir kural olarak, uzunlukları ve hayvan odasının genişliği en fazla üç katı büyüklüğünde olmamalıdır.
Bölüm 2: Banyo elektrotlar ve topraklama kablosu
- Bir kayıt elektrot çifti ve bir zemin elektrot kullanılır. Elektrotlar yalıtılmış bakır tel (0.25 mm yalıtım ile 26 AWG) yapılır. Banyo elektrotların bir ucu ekstraselüler amplifikatör (AM Sistemleri 1700; aşağıya bakınız) bağlı olan ve 0,5 - 1,0 mm yalıtım diğer ucu çıkardı. Topraklama kablosu amplifikatör veya diğer herhangi bir topraklı yalıtım ekipman ve 2-3 cm yere bağlı diğer ucunu çıkardı.
- Banyo elektrotlar ve topraklama kablosu, toksik olmayan yapıştırıcı ile kayıt odasının iç duvarları bağlıdırlar. Kayıt elektrotları kısa her iki tarafta birbirine odasının tam karşısında, (Şekil 1) merkezi olarak konumlandırılmış.
- Zemin elektrot kayıt elektrotlar (Şekil 1) kayıt odası dik uzun bir tarafında konumlandırılmış.
- Odası deiyonize su ile doldurulur. En iyi sonuçlar, yüksek direnç su (M ~ 18) ile elde edilir.
Bölüm 3: Banyo elektrot kayıtları
- Çıkışlar kayıt elektrotları ekstraselüler amplifikatör (Model 1700 AM Sistemleri) (1000x) güçlendirilir. Kayıt elektrotları Sinyal düşük frekanslı (<100 Hz) ve yüksek frekanslı cut-off (> 5 KHz) kullanılarak süzülür. Sinyal sonra bir anahtar kutusu ve bir veri toplama kartı (National Instruments) bağlıdır. Sayısallaştırılmış veri kaydedilmiş saklanır ve veri toplama yazılımı (Photron Hareket Araçları) kullanılarak analiz edildi.
- Sayısallastırılması piyasada mevcut diğer veri toplama yazılımı (Axoscope örneğin, MDS Analitik Teknolojileri) kullanılarak kaydedilen önce; Alternatif olarak, kayıt elektrotları amplifiye sinyal diğer analog-dijital dönüştürücüler (Digidata 1440 örneğin, MDS Analitik Teknolojileri) kullanılarak sayısallaştırılmış olabilir.
Bölüm 4: Uyarıcı prob
- Bir uyarıcı prob ince tel elektrotlar bir çift ile donatılmış bir cam pipet (14 cm uzunluğunda) yapılır. Elektrot ipuçları hayvan prob tarafından dokunulmaz bir elektronik sinyal üretmek için (0.2 mm) maruz kalmaktadır. Bu uyarımı tam zamanı ölçmek için sağlar.
- Uyarıcı prob Çıkışlar ekstraselüler amplifikatör (Model 1700 AM Sistemleri) (1000x) güçlendirilir. Sinyal düşük frekans kombinasyonu (<100 Hz) ve yüksek frekanslı cut-off (> 5 KHz) kullanılarak süzülür. Sinyal daha sonra bir anahtar kutusu ve bir veri toplama kartı (National Instruments) bağlıdır. Sayısallaştırılmış veri kaydedilmiş saklanır ve veri toplama yazılımı (Photron Hareket Araçları) kullanılarak analiz edildi.
Bölüm 5: Video kayıtları
- Yüksek hızlı video kamera (Fastcam-X 1280 PCI, Photron) bir yan görünüm sağlamak için kayıt odasına dik olarak konumlandırılmış. Örneğin bir kaz boynu aydınlatma veya diğer odaklanamazlar ışık kaynakları kullanılarak, en iyi sonuçları sunmak için kayıt odasının içinde parlaklık seviyesi ayarlanabilir olmalıdır.
- Yüksek hızda videografisi kombine ve bir breakout kutusu ve veri toplama kartı (National Instruments) kullanılarak elektronik kayıtları ile senkronize edilir. Banyo elektrotlar Amplifiye sinyal BNC kablolar kullanarak ara kutusu ve veri toplama kartı bağlı. El-switch harici bir tetikleyici senkronize video ve veri toplama başlar.
Bölüm 6: Deneysel prosedür
- Tek bir hayvan odasına girmiş ve 5 dakika boyunca gelmesini izin verilir. Kaçış kuyruk çevirir, sırasıyla, farklı şiddette tek musluklar baş veya karın tarafından ortaya. Musluklar yoğunluğu deneyci tarafından kontrol edilir. Her kaçış kuyruk-flip 25 kHz kaydedildi elektronik alanında potansiyellerin 1000 f / sn, ve veri noktaları bir kare hızında yüksek hızlı video ile kaydedilir. Banyo ve video kayıt başlangıcı, bir tetikleyici kutusu manuel anahtarı ile başlatılır. Kayıt süresi, seçilen kare hızı (örneğin, 1000 f / sn = 4 sn toplam kayıt süresi) tarafından belirlenir. Post-ve ön-tetiklemeli kayıt süreleri seçilebilir.
- Değile: Banyo elektrot kayıtları, mevcut diğer kayıtları yöntemleri ile banyo elektrot kayıtları birleştirerek her test edilen türler için bir kez kontrol edilmelidir. Kerevit, bir çift gümüş elektrot cerrahi ventral sinir kablosu çevresinde implante edilebilir. Kaçış kuyruk çevirir eliciting Uyaranlar uygulanır ve banyo elektrot implante ve mukayese edilebilir elektronik izleri kaydedilebilir.
- Escape kuyruk flip davranış ve ilgili nöral aktivitenin farklı bağlamlarda çeşitli kaydedilebilir, örneğin görsel tehditlere yanıt olarak, yırtıcı saldırılar sırasında, ya da iki kerevit agonistik karşılaşmalar sırasında. Oda boyutu, kayıt modu, vb (Tartışma) buna göre ayarlanmalıdır .
Bölüm 7: Veri analizi
- Tek video kareleri hareket aracı yazılım (Photron) kullanılarak analiz edilmektedir. Elektronik izleri, her bir uyaran ile aktive olan nöral devrenin türünü tanımlamak için kullanılır. Video veriler, hayvanın hareket ve aktif sinirsel devre belirlemek için senkronize fizyolojik kayıtları karşılaştırılır. Her aktif devre karakteristik bir elektronik imza (Temsilcisi sonuçları görmek) üretir.
- Prob sinyali başlangıcı ve banyo elektrotlar ile kaydedilen sinyal başlangıcı arasındaki gecikme ölçüm probu temas ve sinir / kas yanıt arasındaki Gecikme her bir deney için hesaplanır.
Bölüm 8: Temsilci sonuçları
Bir çocuk kerevit baş ve kuyruk (Şekil 2) teslim dokunsal uyarana yanıt olarak tek bir yüksek hızlı video çerçeveleri ve kaçış kuyruk-flip karşılık gelen elektrik alan kayıtları bir dizi.
Şekil 2A: baş Güçlü dokunsal uyaran medial dev bir devre tarafından kontrol edilen bir kuyruk-flip uyandırdı. Dev nöron (yıldız) ve takip eden büyük bir fazik saptırma kaydedildi başak olmayan belirsiz kimlik kuyruk-flip dev nöron aktivitesi ile aracılı olarak sağlar. Video izlerini gösterilen geri hareket aktive sinir devresi (MG) kimliğini belirler.
Şekil 2B: güçlü bir dokunsal uyaran sonra lateral dev devre Kuyruk-flip aracılı kuyruk uygulandı. Videoda görülen yukarı ve ileri hareket ile birlikte dev başak ve büyük, fazik ilk sapma aktif sinirsel devre (LG) kimliğini belirler gösteren senkronize elektronik iz izler.
Şekil 2C: Kuyruk-flip olmayan dev devresi tarafından kontrol edilir. Daha tedrici bir dokunsal uyaran hayvan toraks teslim edildi. Video yakalanan hareketin aktif devre açık kimliği izin vermez iken, elektronik kayıt dev bir başak yoksundur ve aktif devre (Non-G) tanımlamak daha küçük deplasmanlar oluşur.
Şekil 3: Gecikme ölçümleri her üç tür kaçış için kuyruk çevirir. Prob temas ve fizyolojik tepki arasındaki süre yedi hayvanlar için ölçüldü. Dev-aracılı kuyruk çevirir hızlı devi olmayan kuyruk-çevirir daha belirgin ortaya çıkardı.
Şekil 1: Toplam uzunlukları 2.5-3.5 cm hayvanların deneylerde kullanılan bir kayıt odası için bir örnek. Topraklama kablosu, uzun kenarı odanın bağlı ve banyo elektrodlar dik iken, banyo elektrotlar odasının ters tarafa da yapıştırılmış.
Şekil 2: 1000 f / sn ve buna karşılık gelen üç farklı türleri için stimülasyon elektronik kayıtlar kaydedildi Tek video kareleri.
A) güçlü dokunsal uyaran hayvanın kafasına teslim ve medial dev (MG), kuyruk-flip aracılı ortaya çıkardı . Altı video çerçeveleri soldaki görüntülenir. Hayvan dokunmak için kullanılan prob Kayıt eser, gri renkte gösterilir; temas noktası siyah ok ucu ile gösterilir. Kayıt iz banyo elektrotlar ile elde edilen mavi ile yazılmıştır. Içerlek büyük fazik deplasmanlar önündeki küçük dev akson başak gösterir. Gri çubuklar soldaki gösterilen video kare karşılık gelir. Prob ile temas ettikten sonra çerçeve # 3, yedi milisaniye kerevit kuyruk dikkati çeken ilk hareketi oluştu.
B) güçlü bir dokunsal uyaran hayvanın kuyruk teslim edildi ve kuyruk-flip aracılı lateral dev (LG) ortaya çıkardı. Altı video çerçeveleri soldaki görüntülenir. Hayvan dokunmak için kullanılan prob Kayıt eser, gri renkte gösterilir; temas noktası siyah ok ucu ile gösterilir. Kayıt eser ile elde edilenbanyo elektrotlar kırmızıyla gösterilir. Içerlek büyük fazik deplasmanlar önündeki küçük dev akson başak gösterir. Gri çubuklar soldaki gösterilen video kare karşılık gelir. Prob ile temas ettikten sonra çerçeve # 3, sekiz milisaniye kerevit kuyruk dikkati çeken ilk hareketi oluştu.
C) zayıf ve yavaş yavaş dokunsal uyaran hayvanın kafasına teslim devi olmayan (Non-G) aracılı tail-flip ortaya çıkardı. Sekiz video çerçeveler soldaki görüntülenir. Hayvan dokunmak için kullanılan prob Kayıt eser, gri renkte gösterilir; temas noktası siyah ok ucu ile gösterilir. Kayıt iz banyo elektrotlar ile elde edilen siyah gösterilir. Iz dev başak potansiyeli, büyük ilk deplasmanlar yoksun ve çok daha küçük genlik potansiyelleri oluşur. Açık gri çubukları, sol tarafta gösterilen video kare karşılık gelir. Probu ile ilk temastan sonra çerçeve # 6, 115 milisaniye kerevit kuyruk dikkati çeken ilk hareketi oluştu.
Şekil 3: Tepki gecikme ölçümleri her iki cinsiyette ve benzeri boyutları yedi farklı hayvanlar için (uzunlukları ortalama ± stdv: 3.2 cm ± 0.2 cm, telzon için kürsüden ölçülen). MG (mavi bar) ve LG (kırmızı bar) flip-tail göre anlamlı derecede daha kısa tepki gecikmeleri var kuyruk çevirir Non-G (siyah çubuk) devresi aracılığı ile. Ortalama ve standart sapmaları gösterilmiştir. Aynı harf ile Barlar (Wilcoxon Signed Rank testi per bilge karşılaştırma, p <0.05) birbirinden anlamlı farklılık yoktu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Non-invaziv kayıtları, tek bir nöron aktivitesinin veya nöral devre aktivasyon dizginlenmemiş hayvanlar elde etmek zordur. Burada açıklanan yöntem, davranış oluşan doğal altta yatan nöral aktivasyon kalıplarını belirlemek için bir araç sağlar.
Geçmişte, başarılı görsel tehditleri 3 yanıt olarak, daha yakın zamanlarda doğal yırtıcılar 2 ve saldırılar sırasında, faaliyet şekillerinin oluşumu sırasında sosyal baskınlık hiyerarşileri 1 çocuk kerevitler sinir kaçış devrelerde ölçmek için bu tekniği kullandı. Şu anda, senkronize banyo elektrot kayıtları ve yüksek hızda video kayıtları kerevit kaçış davranışları yürütülmesi sırasında, baş uzantıları hareketleri önemini ölçmek için kullanın.
Bu tekniğin sadece iki farklı omurgasız türleri (kerevit ve yusufçuklar) ve iki farklı laboratuvarlarda 4 kullanılmış olsa da, bu, su ve ifade davranışların bazıları omurgalıların da dahil olmak üzere diğer hayvan modeli sistemleri, uygulanabilir olası görünüyor büyük nöronlar tarafından kontrol edilir. Örneğin, birçok teleost balık hızlı kaçış yanıtları Mauthner hücreleri, büyük tanımlanabilir nöronlar 5 tarafından kontrol edilir. Mauthner hücreleri aracılığı ile kaçış davranışı literatüründe çok dikkat aldı ve çeşitli düzeylerde analiz çalışılmıştır; henüz Mauthner hücreleri 6,7 kaçmak ilgisiz durumlarda hızlı vücut döner kontrol dair kanıtlar artmaktadır. Ancak, delil, çoğunlukla Mauthner hücre aktivitesini doğrudan ölçümlerden davranışları ve kinematik değişkenleri karşılaştırarak elde edilir. Mauthner hücreleri tarafından üretilen veya kas aktivitesi ile ilişkili alanında potansiyellerini ölçmek için banyo elektrot kayıtları ile birlikte yüksek hızda videografisi kullanmak mümkün olabilir.
Bilimsel değere ek olarak, burada açıklanan tekniği de ideal genel basitlik ve ucuzluk nedeniyle eğitim amaçlı (örneğin, lisans öğretim laboratuarlar) için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Banyo kayıt tekniği ilk Fricke (1984), 8 ve Beall ve ark tarafından kullanılmıştır. Kuyruk çevirir sırasında oluşan elektrik alanları ölçmek için (1990) 9. Bu teknik daha sonra modifiye edilmiş ve Dr. Donald Edwards (Gürcistan Devlet Üniversitesi) eski yüksek lisans öğrencisi Dr. Fadi A. Issa ve eski doktora sonrası yardımcısı Dr Jens Herberholz laboratuvarında geliştirildi. Daha fazla ayrıntılandırmaları yapılmış ve yeni araştırma uygulamaları Maryland Üniversitesi'nden Dr. Jens Herberholz laboratuvar test edilmiştir. Benim meslektaşım Dr David Yager deneyler ile yardım için bana onun yüksek hızda video sistemi ve araştırma görevlisi David Rotstein ve William Liden bildirdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum.
References
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
- Canfield, J. G. Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated. J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).
- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
