Enregistrements de l'activation des circuits neuronaux dans les Librement Behaving Animaux

Summary

Mesures non invasives de l'activité neuronale dans les modèles librement comportement des animaux sont obtenues en combinant des enregistrements neurophysiologiques avec vidéographie à grande vitesse.

Abstract

La relation entre les tendances de l'activité neuronale et correspondant expression comportementale est difficile à établir chez les animaux sans retenue. Traditionnel des méthodes non invasives nécessitent des sujets de recherche, au moins partiellement restreinte, et elles ne permettent l'identification d'un grand nombre de neurones activés simultanément. D'autre part, les petits ensembles de neurones ou de neurones individuels ne peuvent être mesurées en utilisant une seule cellule enregistrements obtenus à partir des préparations largement réduite. Depuis l'expression du comportement naturel des animaux est limité sobre et disséqué, les mécanismes neuraux sous-jacents qui contrôlent un tel comportement sont difficiles à identifier.

Ici, je présente une technique non invasive qui permet de mesurer physiologiques d'activation des circuits neuronaux dans le comportement des animaux librement. En utilisant une paire d'électrodes de fil dans une eau remplie de chambre, les électrodes d'enregistrement de bain potentiels de champ neuronal et musclé généré par écrevisses juvéniles au cours des réponses échapper naturelle ou expérimentale évoquée. Les réponses échapper primaires d'écrevisses sont médiés par trois types différents de la queue-flips qui déplacent les animaux à l'écart du point de stimulation. Chaque type de la queue-flip est contrôlée par son propre circuit neuronal; les deux réponses échapper à la plus rapide et plus puissant nécessitent une activation de différents ensembles de neurones de commande importante. En combinaison avec les observations comportementales, les enregistrements d'électrode de bain permettent l'identification sans ambiguïté de ces neurones et les circuits associés neurones. Ainsi, l'activité des circuits neuronaux qui sous-tendent le comportement naturel peut être mesuré chez les animaux sans retenue et dans différents contextes de comportement.

Protocol

Partie 1: chambre d'enregistrement

1. La chambre d'enregistrement est de forme rectangulaire et est fait de verre à parois minces. Dimensions de la chambre sont de 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (longueur x largeur x hauteur) pour les animaux de 2.5 à 3.5 cm de longueur totale (mesuré à partir de tribune pour telson).
   Voir Fig. 1 pour un exemple d'une chambre utilisée dans nos expériences.
2. Alternativement, des chambres d'enregistrement peuvent être faites d'autres matériaux (par exemple, non-toxique en plastique transparent). Taille Chambres peuvent varier en fonction de la procédure expérimentale et les chambres doivent être personnalisées pour chaque série expérimentale. Pour de meilleurs résultats, la taille de la chambre doit être aussi petit que possible, sans retenir les animaux dans leur comportement naturel. En règle générale, les longueurs et largeur de la chambre ne doit pas être plus de trois fois la taille de l'animal.

Partie 2: électrodes de Bath et le fil de terre

1. Une paire d'électrodes d'enregistrement et une électrode de masse sont utilisés. Les électrodes sont faites de fil de cuivre isolé (26 AWG avec 0,25 mm d'isolation). Une extrémité de l'électrode de bain est connecté à un amplificateur extracellulaire (AM Systems 1700; voir ci-dessous) et de 0,5 - 1,0 mm d'isolation sont arraché les autres extrémités. Le fil de terre est reliée à la terre de l'amplificateur ou tout autre équipement mis à la terre et de 2-3 cm d'isolant est arraché l'autre extrémité.
2. Électrodes de Bath et le fil de terre sont attachés à la paroi intérieure de la chambre d'enregistrement avec la colle non toxique. Les électrodes d'enregistrement sont positionnés au centre des deux côtés courts de la chambre et en face les uns aux autres (Fig. 1).
3. Électrode de masse est positionné sur un côté long de la perpendiculaire à la chambre d'enregistrement des électrodes d'enregistrement (Fig. 1).
4. Chambre est remplie d'eau déminéralisée. Les meilleurs résultats sont obtenus avec de l'eau de haute résistance (~ 18 MQ).

Partie 3: Les enregistrements d'électrode de bain

1. Sorties d'électrodes d'enregistrement sont amplifiés (1000x) par un amplificateur extracellulaire (systèmes AM; modèle 1700). Signal provenant des électrodes d'enregistrement est filtré en utilisant une combinaison de basse fréquence (<100 Hz) et hautes fréquences des seuils (> 5 KHz). Le signal est ensuite connecté à un commutateur et une carte d'acquisition de données (National Instruments). Les données numérisées sont enregistrées, stockées et analysées à l'aide du logiciel d'acquisition de données (Photron Outils Motion).
2. Alternativement, le signal amplifié à partir d'électrodes d'enregistrement peuvent être numérisés à l'aide d'autres convertisseurs analogiques-numériques (par exemple, MDS Analytical Technologies, Digidata 1440) avant que les données numérisées sont enregistrées à l'aide d'autres logiciels disponibles sur le marché d'acquisition de données (par exemple, MDS Analytical Technologies, Axoscope).

Partie 4: sonde de stimulation

1. Une sonde de stimulation est constitué d'une pipette en verre (14 cm de longueur) équipé d'une paire d'électrodes à fil fin. Extrémités des électrodes sont exposés (0,2 mm) pour produire un signal électronique lorsque l'animal est touché par la sonde. Cela permet de mesurer le temps exact de la stimulation.
2. Sorties de la sonde stimulantes sont amplifiés (1000x) par un amplificateur extracellulaire (systèmes AM; modèle 1700). Le signal est filtré en utilisant une combinaison de basse fréquence (<100 Hz) et hautes fréquences des seuils (> 5 KHz). Le signal est ensuite connecté à un commutateur et une carte d'acquisition de données (National Instruments). Les données numérisées sont enregistrées, stockées et analysées à l'aide du logiciel d'acquisition de données (Photron Outils Motion).

Partie 5: Les enregistrements vidéo

1. Une caméra vidéo à haute vitesse (FastCAM-X 1280 PCI, Photron) est positionné perpendiculairement à la chambre d'enregistrement pour fournir une vue de côté. Niveau de luminosité à l'intérieur de la chambre d'enregistrement doit être ajusté pour fournir de meilleurs résultats, par exemple en utilisant un éclairage à col de cygne ou d'autres sources de lumière focalisable.
2. Haute vitesse vidéographie est combiné et synchronisée avec les enregistrements électroniques en utilisant un boîtier de dérivation et d'acquisition de données pension (National Instruments). Signal amplifié par les électrodes de bain est relié à la boîte de dérivation et de carte d'acquisition de données en utilisant des câbles BNC. Une alimentation externe main gâchette commence l'acquisition vidéo et de données synchronisées.

Partie 6: Procédure expérimentale

1. Un seul animal est introduit dans la chambre et a permis de s'acclimater pendant 5 minutes. Evasion queue flips sont suscités par des robinets simples d'intensité différente à la tête ou l'abdomen, respectivement. L'intensité des robinets est contrôlé par l'expérimentateur. Chaque échapper à la queue-flip est enregistré avec la vidéo haute vitesse à une cadence de points f / sec, et les données 1000 des potentiels de champ électroniques sont enregistrés à 25 kHz. Début de la baignoire et l'enregistrement vidéo est initié par un interrupteur manuel sur une boîte de déclenchement. Le temps d'enregistrement est déterminée par la cadence choisie (par exemple, 1000 f / sec = 4 temps sec total d'enregistrement). Post-temps d'enregistrement et de pré-déclenchement peuvent être sélectionnés.
2. None: les enregistrements d'électrode de bain doit être vérifié une fois pour chacune des espèces testées en combinant des enregistrements d'électrode de bain avec d'autres méthodes d'enregistrements disponibles. Dans les écrevisses, une paire d'électrodes d'argent peuvent être implantés chirurgicalement dans la corde nerveuse ventrale. Les stimuli provoquant la queue-flips d'échappement peut être appliquée et a enregistré des traces électroniques d'électrodes implantées et salle de bain peut être comparé.
3. Evasion queue-flip comportement et l'activité neuronale correspondante peuvent être enregistrées dans une variété de contextes différents, par exemple, en réponse aux menaces visuelle, au cours des attaques de prédateurs, ou lors de rencontres agonistiques de deux écrevisses. Taille de la chambre, le mode d'enregistrement, etc doit être ajustée en conséquence (voir discussion).

Partie 7: Analyse des données

1. Les images vidéo individuelles sont analysées en utilisant l'outil logiciel de mouvement (Photron). Des traces électroniques sont utilisés pour identifier le type de circuit neuronal qui a été activé par chaque stimulus. Les données vidéo sont synchronisés par rapport aux enregistrements physiologiques pour déterminer le mouvement de l'animal et le circuit neuronal activé. Chaque circuit activé produit une signature caractéristique électronique (voir résultats représentatifs).
2. La latence entre le contact de la sonde et la réponse neurale / musculaires sont calculées pour chaque expérience en mesurant le délai entre l'apparition du signal de la sonde et l'apparition du signal enregistré avec les électrodes de bain.

Partie 8: Les résultats représentatifs

Une série de simples images vidéo à haute vitesse et correspondant enregistrements champ électrique pour échapper à la queue-flip en réponse à un stimulus tactile livrée à la tête ou la queue d'une écrevisse juvénile (fig. 2).

Fig. 2A: Forte stimulus tactile à la tête évoquait une queue-flip commandé par le circuit médial géant. Le pic enregistré le neurone géant (astérisques) et la déviation de grandes phasique qui suit permet l'identification non ambiguë de la queue-flip que médiée par l'activité des neurones géants. Le mouvement en arrière montre le trace vidéo détermine l'identité du circuit neuronal activé (MG).

Fig. 2B: Queue-flip médiée par le circuit gigantesque latérale après un fort stimulus tactiles a été appliquée à la queue. Mouvement vers le haut et en avant vu dans la vidéo avec des traces de la trace synchronisé électronique affichant le géant pic et la grande, la déviation phasique initiale détermine l'identité du circuit neuronal activé (LG).

Fig. 2C: Queue-flip contrôlées par des non-géant circuits. Un stimulus tactiles plus graduelle a été livré au thorax de l'animal. Alors que le mouvement capté sur vidéo ne permet pas l'identification non ambiguë du circuit est activé, l'enregistrement électronique manque un pic géant et se compose de beaucoup plus petites déflexions identifier le circuit activé (non-G).

Fig. 3: Les mesures de latence pour les trois types d'échapper à la queue-flips. Temps entre le contact de la sonde et la réponse physiologique a été mesurée pour sept animaux. Giant-médiée queue flips sont déclenchés nettement plus rapide que le géant non la queue-flips.

Figure 1: Un exemple pour une chambre d'enregistrement utilisée dans nos expériences pour les animaux de 2,5-3,5 cm de longueur totale. Les électrodes de bain sont collés sur les côtés opposés de la chambre tandis que le fil de terre est attaché au côté long de la chambre et perpendiculaire aux électrodes de bain.

Figure 2: des images vidéo enregistrées à simple enregistrements f / sec et correspondant électroniques 1000 pour trois différents types de stimulation.

A) Une forte impulsion tactiles a été livré à la tête de l'animal et a suscité un géant médial (MG) ​​médiée queue-flip. Six vidéo-cadres sont affichés sur la gauche. Enregistrement à partir de traces de la sonde utilisée pour toucher l'animal est affichée en gris; le point de contact est indiqué par la flèche noire. Enregistrement de traces obtenus avec des électrodes de bain est représentée en bleu. L'encart montre le pic de petit géant qui précède l'axone grands déplacements phasique. Les barres grises correspondent aux images de la vidéo-montre sur la gauche. Le premier mouvement notable de la queue de l'écrevisse s'est produite à l'image n ° 3, sept millisecondes après le contact avec la sonde.

B) Un fort stimulus tactiles a été livré à la queue de l'animal et a suscité un géant latéral (LG) médiée queue-flip. Six vidéo-cadres sont affichés sur la gauche. Enregistrement à partir de traces de la sonde utilisée pour toucher l'animal est affichée en gris; le point de contact est indiqué par la flèche noire. Enregistrement de traces obtenues avec leélectrodes de bain est affichée en rouge. L'encart montre le pic de petit géant qui précède l'axone grands déplacements phasique. Les barres grises correspondent aux images de la vidéo-montre sur la gauche. Le premier mouvement notable de la queue de l'écrevisse s'est produite à l'image n ° 3, huit millisecondes après le contact avec la sonde.

C) Un stimulus faible et progressive tactiles a été livré à la tête de l'animal et a suscité un non-géant (Non-G) médiée queue-flip. Huit vidéo-cadres sont affichés sur la gauche. Enregistrement à partir de traces de la sonde utilisée pour toucher l'animal est affichée en gris; le point de contact est indiqué par la flèche noire. Enregistrement de traces obtenus avec des électrodes de bain est représentée en noir. La trace manque le potentiel gigantesque pic, les grands déplacements initiaux et se compose des potentiels d'amplitude beaucoup plus petite. Barres gris clair correspondent à des images vidéo-montre sur la gauche. Le premier mouvement notable de la queue de l'écrevisse s'est produite à l'image n ° 6, 115 millisecondes après le premier contact avec la sonde.

Figure 3: mesures de latence de réponse pour les sept animaux différents des deux sexes et de tailles similaires (moyenne ± stdv longueurs: 3,2 cm ± 0,2 cm, mesurée à partir de tribune pour telson). MG (barre bleue) et LG (barre rouge) queue-flips ont latences de réponse significativement plus courts que la queue-flips médiée par des non-G (barre noire) circuits. Moyennes et déviations standards sont affichées. Bars avec la même lettre ne diffèrent pas significativement les unes des autres (test de Wilcoxon Rank Signé à titre de comparaison par paire, p <0,05).

Discussion

Non-invasif des enregistrements de l'activité seul neurone ou l'activation des circuits neuronaux sont difficiles à obtenir chez les animaux sans retenue. La méthode décrite ici fournit un moyen d'identifier des schémas d'activation neuronale sous-jacente naturellement comportement.

Dans le passé, nous avons utilisé avec succès cette technique pour mesurer les tendances de l'activité dans les circuits neuronaux de s'échapper écrevisses juvéniles lors de la formation de hiérarchies de dominance sociale ^1, lors des attaques de prédateurs naturels ^2, et plus récemment, en réponse aux menaces visuelle ^3. Actuellement, nous utilisons des enregistrements synchronisés électrode de bain et des enregistrements vidéo haute vitesse pour mesurer l'importance des mouvements d'appendices tête pendant l'exécution de comportements de fuite dans les écrevisses.

Bien que cette technique n'a été utilisée que dans deux différentes espèces d'invertébrés (langoustes et les libellules) et dans deux laboratoires différents ^4, il semble probable qu'il puisse être appliqué à d'autres systèmes de modèles animaux, y compris les vertébrés, dont certains sont des comportements aquatiques et expresse que sont contrôlés par des grands neurones. Par exemple, les réponses évacuation rapide des poissons téléostéens sont contrôlés par de nombreuses cellules de Mauthner, de grands neurones identifiables ^5. Evasion comportements médiée par les cellules de Mauthner a reçu beaucoup d'attention dans la littérature et a été étudié sur plusieurs niveaux d'analyse, et pourtant, il ya plus de preuves que les cellules de contrôle Mauthner tourne rapides du corps dans des situations qui ne sont pas liés à s'échapper ^6,7. La preuve, cependant, est principalement dérivée de comparer les variables cinématiques des comportements et non pas de mesures directes de l'activité des cellules de Mauthner. Il peut être possible d'utiliser des enregistrements d'électrode de bain en combinaison avec haute vitesse pour mesurer la vidéographie potentiels de champ généré par les cellules de Mauthner ou associés de l'activité musculaire.

En plus de sa valeur scientifique, la technique décrite ici est également parfaitement adapté à des fins éducatives (par exemple, des laboratoires d'enseignement de premier cycle) en raison de sa simplicité globale et leur coût modique.