Summary
Nicht-invasive Messungen der neuronalen Aktivitätsmuster in frei lebenden Tier werden durch die Kombination neurophysiologischen Aufnahmen mit hoher Geschwindigkeit Videografie erhalten.
Abstract
Die Beziehung zwischen Muster neuronaler Aktivität und entsprechende Verhaltensänderungen Ausdruck ist schwierig, in hemmungsloser Tiere zu schaffen. Traditionelle nicht-invasive Methoden erfordern zumindest teilweise zurückgehalten Versuchspersonen, und sie nur eine Identifizierung zulassen einer großen Zahl von Neuronen gleichzeitig aktiviert. Auf der anderen Seite können kleine Ensembles von Neuronen oder einzelne Neuronen nur gemessen Single-Cell-Aufnahmen aus weitgehend reduziert Zubereitungen erhalten werden. Da der Ausdruck des natürlichen Verhaltens in zurückhaltender und seziert Tiere begrenzt ist, sind die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen, die solchen Verhalten zu kontrollieren schwer zu identifizieren.
Hier präsentiere ich eine nicht-invasive physiologische Technik, die die Messung neuronaler Schaltkreis Aktivierung in frei lebenden Tier erlaubt. Mit einem Paar Drahtelektroden in einem mit Wasser gefüllten Kammer, notieren Sie die Bad Elektroden neuronalen und muskulären Bereich Potenziale durch juvenile Krebse während einer natürlichen oder experimentell hervorgerufenen entkommen Antworten generiert. Der primäre Flucht Reaktionen der Krebse sind durch drei verschiedene Arten von Schwanz-Flips, die die Tiere bewegen sich weg von dem Punkt der Stimulation vermittelt. Jede Art von Schwanz-flip wird von einem eigenen neuronalen Schaltkreis gesteuert, die beiden schnellsten und stärksten entkommen Antworten erfordern die Aktivierung unterschiedlicher Sätze von großer Befehl Neuronen. In Kombination mit Verhaltensbeobachtungen ermöglichen die Badelektrode Aufnahmen eindeutige Identifizierung dieser Neurone und der damit verbundenen neuronalen Schaltkreisen. So Aktivität neuronaler Schaltkreise zugrunde liegenden natürlichen Verhalten kann in hemmungsloser Tieren und in verschiedenen Kontexten Verhaltens gemessen werden.
Protocol
Teil 1: Recording Kammer
- Die Aufnahme Kammer ist eine rechteckige Form und ist von dünnwandigen Glas. Chamber Abmessungen 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (Länge x Breite x Höhe) für Tiere von 2,5 bis 3,5 cm Gesamtlänge (gemessen vom Rednerpult zu Telson).
Siehe Abb.. 1 für ein Beispiel einer Kammer in unseren Experimenten verwendet. - Alternativ kann die Aufnahme Kammern aus anderen Materialien (z. B., ungiftig durchsichtigen Kunststoff) hergestellt werden. Chambers Größe kann je nach Versuchsanordnung und Kammern variieren sollte für jede Versuchsreihe angepasst werden. Für beste Ergebnisse sollte Kammer Größe so klein wie möglich, ohne einzuengen Tiere in ihrem natürlichen Verhalten. Als Faustregel gilt, sollte die Länge und Breite der Kammer nicht mehr als drei Mal so groß wie das Tier sein.
Teil 2: Bad Elektroden und Massekabel
- Ein Paar der Aufnahme Elektroden und einer Masseelektrode verwendet werden. Die Elektroden sind aus isoliertem Kupferdraht (26 AWG mit 0,25 mm Isolierung) hergestellt. Ein Ende des Bades Elektroden ist mit einer extrazellulären Verstärker (AM-Systeme 1700, siehe unten) angeschlossen und von 0,5 bis 1,0 mm der Isolierung sind aus den anderen Enden entfernt. Die Erdung wird mit dem Boden des Verstärkers oder einer anderen geerdeten Geräten und 2-3 cm der Isolation verbunden ist vom anderen Ende entfernt.
- Bath Elektroden und Erdungskabel sind an den Innenwänden der Aufnahme Kammer mit ungiftiger Klebstoff befestigt. Recording-Elektroden werden zentral auf beiden kurzen Seiten des Kammer-und einander gegenüber (Abb. 1) positioniert.
- Masseelektrode ist an einer Längsseite der Aufnahme Kammer senkrecht zur Aufnahme Elektroden (Abb. 1) positioniert.
- Kammer ist mit destilliertem Wasser gefüllt. Die besten Ergebnisse werden mit Wasser von hoher Widerstand (~ 18 MOhm) erhalten.
Teil 3: Badelektrode Aufnahmen
- Ausgänge von der Aufnahme Elektroden werden verstärkt (1000x) durch eine extrazelluläre Verstärker (AM-Systeme; Modell 1700). Signal von der Aufnahme Elektroden wird unter Verwendung einer Kombination von niedriger Frequenz (<100 Hz) und Hochfrequenz-cut-offs (> 5 KHz). Signal wird dann an einen Schaltkasten und einer Datenerfassungskarte (National Instruments) angeschlossen. Digitalisierte Daten werden aufgezeichnet, gespeichert und analysiert mit Software zur Datenerfassung (Photron Motion-Tools).
- Alternativ können verstärkte Signal von der Aufnahme Elektroden digitalisiert mit anderen Analog-Digital-Wandlern (zB MDS Analytical Technologies, Digidata 1440) vor digitalisierten Daten, die mit anderen im Handel erhältlichen Software zur Datenerfassung (zB MDS Analytical Technologies, Axoscope).
Teil 4: Förderung Sonde
- Eine anregende Sonde wird von einer Glaspipette (14 cm Länge) mit einem Paar feine Drahtelektroden bestückt. Elektrodenspitzen ausgesetzt sind (0,2 mm) in ein elektronisches Signal, wenn das Tier von der Sonde berührt zu produzieren. Dies erlaubt es, den genauen Zeitpunkt der Stimulation zu messen.
- Ausgänge von stimulierenden Sonde verstärkt (1000x) durch eine extrazelluläre Verstärker (AM-Systeme; Modell 1700). Das Signal wird unter Verwendung einer Kombination von niedriger Frequenz (<100 Hz) und Hochfrequenz-cut-offs (> 5 KHz). Das Signal wird dann an einen Switch-Box und einer Datenerfassungskarte (National Instruments) angeschlossen. Digitalisierte Daten werden aufgezeichnet, gespeichert und analysiert mit Software zur Datenerfassung (Photron Motion-Tools).
Teil 5: Video-Aufnahmen
- Ein High-Speed-Video-Kamera (FastCAM-x 1280 PCI, Photron) steht senkrecht auf der Aufnahme Kammer positioniert, um eine Seitenansicht bieten. Grad der Helligkeit im Inneren der Aufnahme Kammer muss angepasst werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen, zB durch einen Schwanenhals Beleuchtung oder andere fokussierbar Lichtquellen liefern.
- High-Speed-Videografie ist kombiniert und synchronisiert mit elektronischen Aufzeichnungen über eine Breakout-Box & Datenerfassungskarte (National Instruments). Verstärkte Signal aus dem Bad Elektroden ist die Breakout-Box und Messkarte mit BNC-Kabel verbunden. Eine externe Hand-Schalter auslösen beginnt die synchronisierte Video-und Datenerfassung.
Teil 6: Experimentelle Verfahren
- Ein einzelnes Tier wird in die Kammer eingeführt und dürfen für 5 Minuten akklimatisieren. Escape-tail-Flips sind durch einzelne Armaturen unterschiedlicher Intensität ausgelöst, um den Kopf oder den Bauch, bzw.. Die Intensität der Armaturen wird durch den Versuchsleiter kontrolliert. Jede Flucht tail-Flip ist mit High-Speed-Video mit einer Bildfrequenz von 1000 m / sec, und Datenpunkte von elektronischen Feldpotentiale aufgezeichnet werden bei 25 kHz aufgezeichnet. Beginn der Bade-und Video-Aufnahme wird durch manuelle Umschaltung auf einen Trigger-Box gestartet. Die Aufnahmezeit ist durch gewählte Bildrate (zB 1000 f / sec = 4 sec gesamte Aufnahmezeit) bestimmt. Post-und Pre-Trigger-Aufnahme Mal gewählt werden.
- Nichte: Badelektrode Aufnahmen sollten einmal für jeden getesteten Spezies nachgewiesen werden durch die Kombination Badelektrode Aufnahmen mit anderen verfügbaren Aufzeichnungen Methoden. In Krebse, kann ein Paar Silber-Elektroden operativ rund um die Bauchmark implantiert werden. Hervorrufenden Reize zu entkommen tail-Flips angewendet und aufgezeichnet werden elektronische Spuren von implantierten Elektroden und Bad verglichen werden kann.
- Escape-tail-Flip Verhalten und entsprechende neuronale Aktivität kann in einer Vielzahl von unterschiedlichen Zusammenhängen erfasst werden, in Reaktion auf visuelle Drohungen zB während Raubtier angreift, oder während der agonistischen Begegnungen zweier Krebse. Chamber Größe, Aufnahmemodus usw. muss entsprechend angepasst werden (siehe Diskussion).
Teil 7: Analyse der Daten
- Einzel-Video-Frames werden mit Hilfe Motion-Tool-Software (Photron). Elektronische Spuren werden zur Art der neuronalen Schaltkreis, der von jedem Reiz aktiviert wurde identifizieren. Video-Daten synchronisiert physiologischen Aufzeichnungen, um die Bewegung des Tieres und der aktivierten neuronalen Schaltkreis zu bestimmen. Jede aktivierte Schaltung erzeugt ein charakteristisches elektronische Signatur (siehe Repräsentative Ergebnisse).
- Latency zwischen Sonde Kontakt und neuronale / muskuläre Reaktion sind für jedes Experiment durch Messung der Verzögerung zwischen dem Einsetzen der Sonde Signal und dem Einsetzen des Signals mit dem Bad Elektroden aufgezeichnet berechnet.
Teil 8: Repräsentative Ergebnisse
Eine Reihe von einzelnen High-Speed-Video-Frames und die entsprechenden elektrischen Feld-Aufnahmen für die Flucht tail-Flip in Reaktion auf einen taktilen Reiz geliefert auf den Kopf oder Schwanz eines juvenilen Krebsen (Abb. 2).
Abb.. 2A: Starke taktilen Reiz auf den Kopf stieß auf ein tail-Flip von der medialen riesigen gesteuert. Die aufgezeichneten spike der riesigen Neuron (Sternchen) und der großen phasischen Ablenkung, die folgt ermöglicht nicht eindeutig Identifizierung der tail-Flip als vermittelt durch riesige Neuronen-Aktivität. Die Rückwärtsbewegung in der Video-Spuren gezeigt bestimmt die Identität der aktivierten neuronalen Schaltkreis (MG).
Abb.. 2B: Tail-Flip, vermittelt durch die seitlichen riesigen Schaltung nach einem starken taktilen Reiz war es, den Schwanz angewendet. Nach oben und Vorwärtsbewegung im Video gesehen Spuren zusammen mit dem synchronisiert elektronische Spur zeigt die riesige Spike und das große, phasische Anfangsauslenkung bestimmt die Identität der aktivierten neuronalen Schaltkreis (LG).
Abb.. 2C: Tail-Flip von Nicht-Riesen Schaltung gesteuert. Eine allmähliche taktilen Reiz war auf den Thorax des Tieres geliefert. Während die Bewegung auf Video aufgezeichnet nicht zulässt, dass eine eindeutige Identifizierung der aktivierten Schaltung fehlt der elektronischen Erfassung einer riesigen spike und besteht aus viel kleineren Ausschlägen Identifizierung der aktivierten Schaltung (Non-G).
Abb.. 3: Latency Messungen für alle drei Arten von Flucht tail-Flips. Die Zeit zwischen Sonde Kontakt und physiologische Reaktion wurde für sieben Tiere gemessen. Riesen-vermittelte tail-Flips sind deutlich hervorgerufen schneller als Nicht-Riesen Schwanz-Flips.
Abbildung 1: Ein Beispiel für eine Aufnahme Kammer in unseren Experimenten bei Tieren von 2,5-3,5 cm in Gesamtlängen verwendet. Das Bad Elektroden sind an gegenüberliegenden Seiten der Kammer geklebt, während Sie das Erdungskabel an der langen Seite der Kammer angebracht ist und senkrecht zu den Bad-Elektroden.
Abbildung 2: Single Video-Frames auf 1000 m / sec und entsprechende elektronische Aufzeichnungen für drei verschiedene Arten der Stimulation aufgezeichnet.
A) Eine starke taktile Reiz war, den Kopf des Tieres geliefert und löste eine riesige mediale (MG) vermittelt tail-Flip. Sechs Video-Frames auf der linken Seite angezeigt. Recording Spur von der Sonde verwendet werden, um das Tier berühren ist grau dargestellt, die Anlaufstelle ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Recording Spur mit dem Bad Elektroden erhalten wird, in blauer Farbe dargestellt. Der Einschub zeigt die kleine Riesenaxon spike, dass die großen phasischen Ausschläge vorausgeht. Graue Balken, um das Video-Frames auf der linken Seite gezeigt, entsprechen. Die erste bemerkenswerte Bewegung der Krebse in den Schwanz trat bei Bild Nr. 3, sieben Millisekunden nach dem Kontakt mit der Sonde.
B) Eine starke taktile Reiz war der Schwanz des Tieres geliefert und löste eine seitliche Riese (LG) vermittelt tail-Flip. Sechs Video-Frames auf der linken Seite angezeigt. Recording Spur von der Sonde verwendet werden, um das Tier berühren ist grau dargestellt, die Anlaufstelle ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Recording-Trace mit den erhaltenenBad Elektroden ist in rot dargestellt. Der Einschub zeigt die kleine Riesenaxon spike, dass die großen phasischen Ausschläge vorausgeht. Graue Balken, um das Video-Frames auf der linken Seite gezeigt, entsprechen. Die erste bemerkenswerte Bewegung der Krebse in den Schwanz trat bei Bild Nr. 3, acht Millisekunden nach dem Kontakt mit der Sonde.
C) Eine schwache und schrittweise taktilen Reiz war, den Kopf des Tieres geliefert und löste eine nicht-Riese (Non-G) vermittelt tail-Flip. Acht Video-Frames auf der linken Seite angezeigt. Recording Spur von der Sonde verwendet werden, um das Tier berühren ist grau dargestellt, die Anlaufstelle ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. Recording Spur mit dem Bad Elektroden erhalten wird in schwarz dargestellt. Die Spur fehlt dem Giganten spike Potenzial, die großen anfänglichen Auslenkungen und besteht aus Potentiale viel kleiner Amplitude. Hellgraue Balken, um das Video-Frames auf der linken Seite gezeigt entsprechen. Die erste bemerkenswerte Bewegung der Krebse in den Schwanz trat bei Bild Nr. 6, 115 Millisekunden nach dem ersten Kontakt mit der Sonde.
Abbildung 3: Response-Latenz-Messungen für sieben verschiedene Tiere beiderlei Geschlechts und ähnlicher Größe (Mittelwert ± Längen STDV: 3,2 cm ± 0,2 cm, aus Rostrums bis Telson gemessen). MG (blauer Balken) und LG (roter Balken) tail-Flips haben deutlich kürzere Reaktionszeiten Latenzen als tail-Flips, vermittelt durch Non-G (schwarze Balken)-Schaltung. Mittelwerte und Standardabweichungen dargestellt. Bars mit dem gleichen Buchstaben unterschieden sich nicht signifikant voneinander (Wilcoxon Signed Rank Test für paarweisen Vergleich, p <0,05).
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Discussion
Non-invasive-Aufnahmen von einzelnen Neuronen-Aktivität oder neuronalen Schaltkreis Aktivierung sind schwer zu hemmungsloser Tiere zu erhalten. Die hier beschriebene Methode bietet die Möglichkeit, Muster der neuronalen Aktivierung zugrunde liegenden natürlichen Verhalten zu identifizieren.
In der Vergangenheit haben wir erfolgreich diese Technik, um Muster der Aktivität in neuronalen Schaltkreisen entkommen jugendlicher Krebse messen während der Bildung der sozialen Dominanzhierarchien 1, während der Angriffe von natürlichen Feinden 2, und in jüngerer Zeit, in Reaktion auf visuelle Drohungen 3. Zurzeit verwenden wir synchronisiert Badelektrode Aufnahmen und High-Speed-Videoaufnahmen auf die Bedeutung der Bewegungen des Kopfes Anhängsel während der Ausführung der Flucht Verhaltensweisen in Krebsen zu messen.
Während diese Technik nur in zwei verschiedenen Wirbellosen (Krebse und Libellen) und in zwei verschiedenen Laboratorien 4 verwendet, so scheint es wahrscheinlich, dass es für andere tierische Modellsysteme, einschließlich Wirbeltieren, von denen einige Wasser-und Verhaltensweisen, die Ausdruck sind, können angewendet werden zeichnen sich durch große Neuronen gesteuert. Zum Beispiel sind schnelle Flucht Reaktionen vieler Knochenfische von Mauthner-Zellen, große identifizierbaren Neuronen 5 gesteuert. Escape-Verhalten durch die Mauthner-Zellen vermittelt hat viel Aufmerksamkeit in der Literatur erhalten hat und auf mehreren Ebenen der Analyse untersucht worden, doch gibt es immer mehr Belege dafür, dass Mauthner-Zellen schnellen Körper dreht Kontrolle in Situationen, die nicht mit 6,7 entkommen sind. Der Beweis ist aber vor allem aus dem Vergleich kinematischen Variablen des Verhaltens und nicht aus direkten Messungen der Mauthner-Zell-Aktivität abgeleitet. Es kann möglich sein, Badelektrode Aufnahmen in Kombination mit High-Speed-Videografie zu Feldpotentiale durch die Mauthner-Zellen erzeugt oder assoziierten muskulären Aktivität zu messen.
Neben seiner wissenschaftlichen Wert, beschrieb die Technik hier ist auch ideal für pädagogische Zwecke (z. B. Bachelor Lernlabore) aufgrund seiner Einfachheit und Kostengünstigkeit insgesamt geeignet.
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Acknowledgments
Das Bad Aufnahmetechnik wurde zuerst von Fricke (1984) 8 und Beall et al. (1990) 9, um elektrische Felder während tail-Flips generiert messen. Die Technik wurde später modifiziert und verbessert im Labor von Dr. Donald Edwards (Georgia State University) von seinem ehemaligen Doktoranden Dr. Fadi A. Issa und seine ehemaligen Postdoktorand Dr. Jens Herberholz. Weitere Verfeinerungen vorgenommen wurden und neue Forschungsergebnisse Anwendungen im Labor von Dr. Jens Herberholz wurde an der University of Maryland getestet. Ich möchte meinem Kollegen Dr. David Yager, dass Sie mich Nutzung seiner High-Speed-Video-System und meine wissenschaftliche Mitarbeiter David Rotstein und William Liden für die Hilfe bei den Experimenten danken.
References
- Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish. J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).
- Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions. J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).
- Liden, W. H., Herberholz, J. Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J. Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).
- Finley, L. A., Macmillan, D. L. An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish. Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).
- Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish. Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).
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- Wöhl, S., Schuster, S. The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start. J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).
- Fricke, R. A. Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses. Brain Res. 322, 139-143 (1984).
- Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture. J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).
