自由に動物を振る舞うの神経回路のアクティベーションの記録

Summary

自由に動物を振る舞うの神経活動パターンの非侵襲計測は、高速ビデオ撮影で神経生理学的記録を組み合わせることによって得られる。

Abstract

神経活動と対応する行動の発現のパターンとの関係は、無拘束の動物で確立することは困難である。従来の非侵襲的な方法は、少なくとも部分的に抑制された研究課題を必要とし、彼らが同時に活性化ニューロンの多数の識別のみを許可。一方、神経細胞や個々のニューロンのアンサンブルは、大幅に低減調製物から得られる単一細胞記録を用いて測定することができます。自然な行動の発現が抑制され、解剖動物で限られているため、そのような動作を制御する基本的な神経機構は、識別が困難です。

ここで、私は自由に動物を振る舞うの神経回路の活性化を測定することができる非侵襲的生理的手法を提示する。水で満たされたチャンバ内のワイヤ電極のペアを使用して、バス電極は、自然または実験的に誘発エスケープ応答中に幼若ザリガニによって生成された神経と筋肉の電場電位を記録する。ザリガニの主なエスケープ応答は、刺激の点から動物を移動するテールフリップ、3つの異なるタイプによって媒介される。テールフリップの各タイプは、独自の神経回路によって制御され、2最速かつ最も強力なエスケープ応答は、大規模なコマンドのニューロンの異なるセットの活性化を必要とする。行動観察と組み合わせることで、バス電極の録音は、これらのニューロンが明確に識別し、関連する神経回路を可能にする。このように自然に発生する動作の基礎となる神経回路の活動が奔放動物では、さまざまな行動の文脈で測定することができます。

Protocol

パート1：録音室

1. 録音室では、長方形の形状のものであり、薄肉のガラスで作られています。 3.5センチメートル合計の長さ（演壇から尾節に測定） - チャンバーの寸法は2.5の動物用× 2センチ× 5センチメートル（長さ×幅×高さ）8.5 cmである。
   図を参照してください。実験に用いたチャンバーの例1。
2. また、録音室は、他の材料（例えば、非毒性の透明なプラスチック）から行うことができます。チェンバースのサイズは、各実験シリーズ向けにカスタマイズされるべき実験手順やチャンバーに応じて異なる場合があります。最良の結果を得るために、チャンバーの大きさは、彼らの自然な行動に動物を拘束することなく可能な限り小さくする必要があります。経験則として、チャンバーの長さと幅は、動物の3倍以上のサイズでなければいけません。

パート2：バス電極とアース線

1. 記録電極と接地電極のいずれかのペアが使用されています。電極は絶縁銅線（0.25mmの絶縁26 AWG）で作られています。バス電極の一端は細胞外アンプ（AMシステムズ1700;下記参照）に接続され、0.5 - 絶縁体の1.0 mmのもう一方の端を、取り除かれます。アース線はアンプまたは他の接地された機器や断熱材の2-3 cmのグランドに接続され、もう一方の端を取り除かれている。
2. バス電極とアース線は、非毒性接着剤で記録室の内壁に取り付けられている。記録電極は、互いに室と反対側（図1）の両方の短辺の中央に配置されています。
3. 接地電極は記録電極（図1）に録音室に垂直の一本の長い側に位置している。
4. チャンバーは、脱イオン水で満たされている。最良の結果は、高抵抗の水（MΩ〜18）で得られる。

パート3：バス電極記録

1. 記録電極からの出力は、外アンプ（;モデル1700 AMシステム）によって（1000倍）増幅されています。記録電極からの信号は低周波（<100 Hz）と高周波カットオフ値（> 5 kHz）の組み合わせを用いて濾過する。その後、信号はスイッチボックスとデータ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ）に接続されています。デジタル化されたデータは、記録保管、およびデータ収集ソフトウェア（フォトロンモーションツール）を用いて分析される。
2. また、記録電極から増幅された信号は、他のアナログ - デジタル変換器（例えば、MDS解析技術、Digidata 1440）を使用してデジタル化することができるデジタル化されたデータの前に他の市販のデータ集録ソフトウェア（; Axoscopeなど、MDS解析技術）を使用して記録されます。

パート4：刺激的なプローブ

1. 刺激的なプローブは、細線の一対の電極を備えたガラスピペット（14センチ長さ）で作られています。電極チップは、動物がプローブに触れている電気信号を生成する（0.2 mm）の公開されています。これは刺激の正確な時間を計測することができる。
2. 刺激プローブからの出力は外アンプ（;モデル1700 AMシステム）によって（1000倍）増幅されています。信号は低周波（<100 Hz）と高周波カットオフ値（> 5 kHz）の組み合わせを用いて濾過する。その後、信号はスイッチボックスとデータ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ）に接続されています。デジタル化されたデータは、記録保管、およびデータ収集ソフトウェア（フォトロンモーションツール）を用いて分析される。

パート5：ビデオの録画

1. 高速度ビデオカメラ（FASTCAM - X 1280 PCI、フォトロン）は側面図を提供するために録音室に垂直に配置されている。録音室内の明るさのレベルは、鎌首の照明または他のフォーカス可能な光源を使用してなどし最良の結果を、提供するために調整する必要があります。
2. 高速ビデオ撮影を一緒にし、ブレイクアウトボックス＆データ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ）を使用して、電子記録と同期しています。バス電極から増幅された信号は、BNCケーブルを使用してブレークアウトボックスとデータ集録ボードに接続されています。外付けのハンドスイッチのトリガーは、同期した映像とデータ収集を開始します。

第6部：実験方法

1. 単一の動物をチャンバーに導入し、5分間順応させています。エスケープ尾を反転さはそれぞれ、頭部や腹部に異なる強度のシングルタップによって誘発されています。タップの強さは、実験者によって制御されます。各エスケープテールフリップは1000 F /秒のフレームレートでの高速ビデオで記録され、電子電場電位のデータポイントは、25 kHzで記録されます。お風呂やビデオ録画の開始トリガーボックスの手動スイッチによって開始されます。録音時間は、選択されたフレームレート（例えば、1000 F /秒= 4秒、合計録音時間）によって決定されます。ポストとプレトリガー録画時間を選択することができます。
2. ないeは：バス電極の録音は、他の利用可能な録音方法とバス電極記録を組み合わせることにより、各試験種に一度検証する必要があります。ザリガニでは、銀電極のペアは、外科的腹神経索の周囲に移植することができる。エスケープ尾を反転誘発刺激が適用され、移植されたとバス電極を比較することができるの電子痕跡を記録することができます。
3. テールフリップ動作と対応する神経活動をエスケープする捕食者の攻撃の間、または2つのザリガニのアゴニスト最中に、視覚的な脅威への応答など、異なる様々な文脈の内に記録することができます。チェンバーのサイズ、記録モード、などがそれに応じて調節する必要があります（説明を参照）。

パート7：データの分析

1. 単一のビデオフレームは、モーションツールソフトウェア（フォトロン）を用いて分析されています。電子トレースはそれぞれの刺激によって活性化された神経回路の種類を識別するために使用されています。ビデオデータは、動物と活性化神経回路の動きを決定するために同期生理的録音と比較されます。各アクティブ回路は、特性電子署名を（ 代表的な結果を参照）を生成します。
2. プローブの接触および神経/筋肉の応答との間の待ち時間は、プローブ信号の発症とバス電極で記録された信号の発症との間の遅延を測定することにより、それぞれの実験のために計算されます。

パート8：代表的な結果

若年性ザリガニの頭部または尾部（図2）に配信触覚刺激に応じて単一の高速ビデオフレームとエスケープテールフリップに対応する電界のレコーディングのシリーズ。

図。 2A：頭部への強力な触覚刺激は内側巨大な回路によって制御されるテールフリップを誘発。巨大ニューロン（アスタリスク）の記録されたスパイクと、次の大きな相のたわみが非曖昧識別テールフリップ巨大ニューロンの活性によって媒介として可能になります。ビデオのトレースに示すように後方への移動が活性化した神経回路（MG）のIDが決まります。

図。 2B：横方向の巨大な回路でテールフリップを介した強力な触覚刺激が尾に適用された後。上前方にビデオで見られる動きは、巨大なスパイクを表示する同期電子トレースと一緒にトレースし、大規模な、一過性の初期たわみは、活性化神経回路（LG）のIDが決まります。

図。 2C：テールフリップ以外の巨大な回路によって制御される。より緩やかな触覚刺激は、動物の胸部に配信されました。ビデオのキャプチャされた動きが活性化された回路の明確な識別を可能にするものではありませんが、電子記録は、巨大なスパイクを欠いていると活性化回路（非G）を識別する非常に小さなたわみで構成されています。

図。 3：エスケープの全3種類のレイテンシ測定テールが反転します。プローブの接触と生理反応との間の時間は、7匹のために測定した。巨大介在テールフリップ大幅に高速化以外の巨大なテールフリップよりも誘発されています。

図1：合計の長さの2.5〜3.5センチメートルの動物のために私たちの実験で使用した録音室のための例。アース線は、バス電極にチャンバーと垂直の長辺に接続されている間はバス電極は、チャンバの反対側に接着されています。

図2：刺激、3種類の1000 F /秒と、対応する電子記録で記録された単一のビデオフレーム。

A）強い触覚刺激は、動物の頭に配信され、内側の巨人（MG）はテールフリップ媒介誘発された。 6つのビデオフレームが左側に表示されています。動物に触れるために使用するプローブからの記録のトレースは灰色で表示され、接触点は、黒い矢印で示されます。バス電極で得られた記録のトレースは青で示されています。挿入図は、大規模な一過性変形の前に小さな巨大軸索のスパイクを示しています。グレーのバーが左に示すビデオフレームに対応しています。ザリガニの尾の最初の注目すべき動きは、プローブと接触した後のフレーム＃3、七ミリ秒で発生しました。

B）の強力な触覚刺激は、動物の尾に配信され、横方向の巨大な（LG）を介したテールフリップを誘発した。 6つのビデオフレームが左側に表示されています。動物に触れるために使用するプローブからの記録のトレースは灰色で表示され、接触点は、黒い矢印で示されます。で得られた記録のトレースバス電極が赤色で表示されます。挿入図は、大規模な一過性変形の前に小さな巨大軸索のスパイクを示しています。グレーのバーが左に示すビデオフレームに対応しています。ザリガニの尾の最初の注目すべき動きは、8ミリプローブと接触した後、フレーム＃3で発生した。

C）弱と徐々に触覚刺激は、動物の頭に配信され、非巨大な（非G）を介したテールフリップを誘発した。 8つのビデオフレームが左側に表示されています。動物に触れるために使用するプローブからの記録のトレースは灰色で表示され、接触点は、黒い矢印で示されます。バス電極で得られた記録のトレースは黒で示されています。トレースは、巨大なスパイク電位、大規模な初期たわみを欠いているとはるかに小さい振幅の電位で構成されています。ライトグレーのバーは左側に表示されているビデオフレームに対応しています。ザリガニの尾の最初の注目すべき動きは、プローブとのファーストコンタクトの後のフレーム＃6、115ミリ秒で発生しました。

図3：男女と同じようなサイズの両方の7つの動物の応答遅延の測定（長さを平均値± stdv：3.2センチメートル± 0.2 cmであり、尾節に演 ​​壇から測定）。 MG（青いバー）とLGは（赤いバー）フリップテールは、より大幅に短い応答待ち時間がテールフリップ非G（黒バー）回路によって媒介。平均と標準偏差が表示されます。同じ文字を持つ棒（ペアワイズ比較、P <0.05のためにウィルコクソン符号付き順位検定）は互いに有意な差はなかった。

Discussion

単一ニューロンの活動や神経回路の活性化の非侵襲的な録音は、無拘束の動物で得ることが困難です。このメソッドは、天然に存在する行動の根底にある神経活性化のパターンを識別する手段を提供するここで説明する。

過去には、我々は成功し、ビジュアルな脅威³に対応して、最近では天敵^2、からの攻撃の間に、社会的優位性の階層¹の形成時に幼若ザリガニの神経エスケープ回路の活動パターンを測定するには、このテクニックを使用していました。現在、我々はザリガニのエスケープ動作の実行中にヘッドの付属の動きの重要性を測定するために同期したバス電極記録と高速ビデオ録画を使用してください。

このtechnique 2つだけdifferent無脊椎動物種（ザリガニやトンボ）in、二つの異なる実験室^4で使用されていますが、それがその水生およびexpress behaviors areそのうちのいくつかvertebratesを含む他の動物モデル系、、に適用できる可能性だ大規模な神経細胞によって制御されます。例えば、多くの硬骨魚の高速エスケープ応答は、マウスナー細胞、大規模な識別ニューロン⁵によって制御されます。マウスナー細胞により媒介されるエスケープ動作は、文学に注目を集めていると分析のいくつかのレベルで研究されており、まだ、マウスナー細胞は^6,7を逃れるために関係のない状況で急激な体の回転を制御するという証拠が高まっている。証拠は、しかし、ほとんどマウスナー細胞活性の直接測定から行動していないの運動学的変数の比較から導出されます。それは、マウスナー細胞または関連する筋肉の活動によって生成される電場電位を測定するため、高速ビデオ撮影と組み合わせてバス電極の録音を使用することも可能でしょう。

その科学的価値に加えて、ここで説明する手法はまた、理想的には、その全体的なシンプルさと廉価による教育的な目的（例えば、学部教育研究所）に適しています。