Biology

Mus Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Adrenal medullär chromaffin cellodling system är mycket användbara för studier av excitation-sekretion koppling i en in vitro miljö. Detta protokoll illustrerar den metod som används för att dissekera binjurarna och sedan isolera medullär regionen genom strippa bort binjurebarken. Den nedbrytning av medulla i enskilda chromaffin celler är då påvisas.

Abstract

Protocol

Förkortningar:
ACC - Adrenal Chromaffin Celler, E. lösn. - Enzyme lösning, E. DMEM - Berikade Dulbecco ändrade Eagle Medium

Förberedelser
1. Lägg papain till önskad mängd E. lösn. (40 enheter papain / 1ml E. lösn..).
2. Aktivera papain med carbogen i ca 15 minuter på is. Syresätter Lockes buffert på is också.
Dissection
1. Använd 8-10 vecka mus.
2. Rötningen bort syresatt Lockes buffert och placera på is.
3. Se video för dissekering förfarande.
4. När exciderad, syresatt plats körtlar i Lockes buffert.
Beredning av Gland
1. Ta bort fett från körteln.
2. Strip cortex från körteln.
Enzymatisk spjälkning
1. Sterilfilter syresatt papain.
2. Gör fyra pooler av syresatt papain på en petriskål.
  1. 3 pooler bör vara ca 100uls.
  2. 1 av poolerna bör vara ca 400uls.
3. Tvätta medullae genom pooler
  1. 1:a genom 3 100ul pooler.
  2. Sedan genom 400ul poolen
  3. Pippette 300ul E. lösn. och märgen bitar från 400ul pool i mikrofugrör.
  4. Qrap parafilm på mikrofugrör och placera i 37 ° C vattenbad i 20min.
  5. Kom ihåg att fortsätta att syresätta återstående E. lösn. innehåller papain.
  6. Efter 20 minuter sterilfilter mer E. lösn..
  7. Byt ut gamla E. lösn. bad medullae med nyligen filtreras E. lösn..
Trituration
1. Aspirera och kassera E. lösn..
2. Tvätta medullae i 1 ml E. DMEM.
3. Aspirera och kassera E. DMEM.
4. Lägg 300ul E. DMEM och mal sönder 20X med 1ml spets.
5. Skär 200ul spets med steril rakblad.
6. Mal sönder 5-10X med avskurna 200ul spets.
7. Kasta E. DMEM bitar bad medullae. Medel kommer att innehålla skräp.
8. Lägg 300uls färska E. DMEM till medullae bitar.
9. Mal sönder med 200ul spets 20x
10. Pippette E. DMEM att mikrofugrör withough medullae bitar. Medel kommer att innehålla fri ACC.
11. Lägg 300uls färska E. DMEM till medullae bitar.
12. Mal sönder medullae med 23,5 gauge sprutnålen 20x.
13. Kombinera E. DMEM från båda trituration. Medullae bitar bör inte vara närvarande och ska nu ha en featherlike utseende.
Plating
1. Mikrofugrör E. DMEM från de senaste två trituration stegen för 2,5 minuter på 3.7g s.
2. Resuspendera pelleten i 50uls-200 E. DMEM, beroende på efterföljande experiment.
3. Plate 10-30uls på ett glas täckglas.
4. Vänta 15 minuter för celler att hålla sig.
5. Lägg 750uls av E. DMEM.