Summary
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تسمية واحدة تصور إيماس حويصلة متشابك والاتجار في خلايا شبكية العين باستخدام القطبين ذهبية مجموع مضان الانعكاس الداخلي (TIRF) المجهري.
Abstract
مجموع الانعكاس الداخلي مضان (TIRF) المجهري هو الاسلوب الذي يسمح للدراسة الأحداث يحدث في غشاء الخلية ، من خلال التصوير الانتقائي للجزيئات الفلورسنت التي هي أقرب إلى مادة الانكسار ارتفاع الرقم القياسي مثل الزجاج
Protocol
الجزء 1 : تشريح القطبين وعزل الخلايا
- إعداد الحلول المدرجة في الجدول 2 ، والرقم الهيدروجيني للقارعو الأجراس "(الخارجية) وينبغي تعديلها إلى 7.4 مع حلول هيدروكسيد الصوديوم ، وينبغي تعديل الرقم الهيدروجيني من الحل الداخلي إلى 7.2 مع CsOH. حماية حل داخلي من الضوء بورق الألمنيوم ويبقيه عند 4 درجات مئوية حتى استخدام ؛
- التكيف مع الظلام سمكة ذهبية على الأقل 30 دقيقة قبل التشريح ؛
- في حين أن الحيوانات تتكيف مع الظلام ، وإعداد 5 مل من هيالورونيداز (V هيالورونيداز نوع ، ووحدات 1100 / مل في كاليفورنيا المنخفضة 2 + رينغر ؛ سيغما ، وسانت لويس ، MO) و 10 مل من السيستين - L (0.5 ملغ / مل انخفاض في الكالسيوم 2 + رينغر) الحلول وتزن غراء (مسحوق مجفف بالتجميد ، والوحدات 40 / مل ؛ سيغما ، وسانت لويس ، MO) لمدة 5 مل من محلول الهضم ؛
- الموت ببطء ذهبية بواسطة قطع الرأس سريع مع مقص جراحي وتدمير خلايا المخ والحبل الشوكي بشفرة مشرط # 11 ؛
- إزالة العيون من خلال تدمير العضلات خارج المقلة بمساعدة الملقط دومون # 7 المنحنية وقطع العصب البصري مع مقص القزحية ؛
- عين واحدة لمبة مكان على قطعة من ورق الترشيح وثقب حوف الصلبة مع غيض من شفرة مشرط # 11 ؛
- إدخال شفرة مقصا vannas داخل كل ثقب وقطع الجزء الأمامي كله بعيدا ؛
- ضع قطعة صغيرة من الورق مرشح على رأس الكأس البصرية المتبقية وممارسة بعض الضغط من أجل الحصول على ورقة نقع مع النكتة الزجاجي ؛
- رفع ورقة الترشيح مع الشبكية الملحقة بها وقطع العصب البصري مع الاسمية للمقص vannas ؛
- مكان ورقة الترشيح التي تحتوي على شبكية العين في طبق بلاستيكي 35 ملم مع ثقافة حل هيالورونيداز وتقشر في شبكية العين من ورقة الترشيح بمساعدة # 7 دومون ملاقط ؛
- قطع في شبكية العين 4-6 مع نصف قطعة من شفرة واحدة الصناعية الكربون الصلب ذو حدين ، والسماح لها الجلوس في حل هيالورونيداز لمدة 20 دقيقة ؛
- في حين تنتظر هيالورونيداز نافذة المفعول ، إضافة 5 مل من محلول L - السيستين إلى غراء واتركه حتى يصبح شفافا السائل (5-10 دقائق تقريبا) ؛
- غسل قطعة من شبكية العين في البلدان المنخفضة 3X كا 2 لرينغر + والسماح لهم الجلوس في حل للغراء 30-35 دقيقة ؛
- غسل قطعة من شبكية العين في البلدان المنخفضة 3X كا 2 لرينغر + وتخزينها حتى استخدامها في 4 درجات مئوية في صحن الثقافة البلاستيكية التي تحتوي على الكالسيوم 35 مم منخفضة 2 + لرينغر ؛
- لفصل الخلايا ، وضعت قطعة من أنبوب في شبكية العين تحتوي على 500 مل microcentrifuge المنخفض من الكالسيوم في 2 + رينغر متمزج ببطء وشبكية العين بواسطة pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة تفارق الزجاج ، وبعناية لا تنتج أي فقاعات هواء. هي ملفقة ماصات تفارق بواسطة تسخين غيض من ماصة باستير الزجاج مع ناسخ بنسن والانحناء قليلا مع مساعدة من ملقط التشريحية ؛
- لوحة الخلايا معزولة عن طريق إضافة قطرة من تعليق الشبكية إلى منزل من صنع غرفة تسجيل شغل في السابق مع 2 مل من الكالسيوم منخفضة 2 + رينغر. الغرفة تتكون من النصف السفلي من صحن 35 ملم مع ثقافة البلاستيك ككل دائرية في وسط وساترة دائرية من الزجاج مؤشر الانكسار 1.78 (PlanOptik ، ألمانيا) لصقها على الجزء السفلي مع الاستومر السيليكون (184 Sylgard ؛ داو كورننغ وميدلاند ، ميتشيغن).
الجزء 2 : القطبين تحميل الخلية وتغسل
ويتم تصوير أفضل TIRF حويصلات متشابك خارج باستخدام مجهر TIRFM الهدف من نوع مع الهدف NA عالية جدا وكاميرا حساسة. لتجاربنا ، نختار لاستخدام 1.65 NA الهدف (آبو X100 O الموارد البشرية ، NA 1.65 ، أوليمبوس ، واليابان) مع EMCCD (تتالي 512B العلمية روبر ، توكسون ، من الألف إلى الياء). استخدام عالية جدا NA الهدف يتطلب استخدام الزجاج عالية coverslips الانكسار والسوائل الغمر (دى يود الميثان مع الكبريت). تحت ظروفنا ، يقتصر ضوء الإثارة إلى حقل تدهور بشكل كبير ، مع طول ثابت من ما يقرب من 50 نانومتر.
- إضافة قطرة من ارتفاع مؤشر الانكسار السائل (M السلسلة ، معامل الانكسار = 1.7800 ، مختبرات Cargille ، سيدار جروف بولاية نيوجيرسي) في تحقيق الهدف المجهر ؛
- المكان غرفة تسجيل بعناية على أعلى من الهدف المجهر وجبل بعناية القطب الأرض وأنابيب superfusion الخروج إلى الغرفة ؛
- دعونا غرفة الجلوس على المجهر لمدة 10-20 دقيقة للسماح للخلايا لإغراق والالتزام إلى أسفل ؛
- في غضون ذلك ، وإعداد 5 مل من trolox 1MM ® ((±)-6 هيدروكسي - 2 - ،5،7،8 tetramethylchromane - 2 - الكربوكسيلية الحمضية ، سيغما ، وسانت لويس ، MO) الحل في ارتفاع K + في المسابقة . يصوتن حتى المنحل ؛
- تحضير 15 مل من محلول الغسيل ADVASEP - 7 : 1 ملم ADVASEP - 7 (سيغما ، وسانت لويس ، MO) في كاليفورنيا المنخفضة 2 + رينغر. علما بأن استخدام ADVASEP - 7 هو اختياري ويمكن إغفالها إذا كان المطلوب ؛
- تطهير لى superfusionالأخبار وإضافة محلول الغسيل ADVASEP - 7 ، 2 + كا منخفضة الجرس والجرس السيطرة على النظام superfusion ؛
- سحب تحميل ماصات من الزجاج البورسليكات رقيقة الجدران (كويك سن الفيل ® TW150 - 3 ؛ WPI ، ساراسوتا ، فلوريدا). البخاخ المقاومة ماصة ، تقع في مرمى MΩ 1،5-2،5 ؛
- إعداد FM1 - 43 ® (N - (3 - triethylammoniumpropyl) -4 -- (4 -- (dibutylamino) styryl) pyridinium ثنائي البروميد "، التعبئة والتغليف الخاصة" ؛ Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) الحلول. الأولى ، وجعل الأسهم 1 مم بإضافة الماء المقطر 160 ميكرولتر قارورة واحدة (100 ملغ) من FM1 - 43 ®. ويمكن الاحتفاظ بهذا السهم عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. ثم ، إضافة 5 ميكرولتر من FM1 - 43 ® ل1 مل عالية K + + رينغر ® trolox 1MM. حماية حل من الضوء بورق الألمنيوم ويبقيه عند 4 درجات مئوية حتى استخدام ؛
- تحويل ضوء ساطع على حقل المجهر والبحث عن خلايا سليمة بين القطبين. الصنبور قليلا المجهر للتأكد من أن يتم بإحكام الخلايا العصبية في الجزء السفلي من الغرفة ؛
- موقف superfusion القلم على مقربة من خلية من الاهتمام ويروي باستمرار مع إعداد منخفض الكالسيوم 2 + رينغر ؛
- إطفاء الأنوار وإضافة غرفة حمراء طويلة تمرير التصفية (أي RG630 ؛ شوت ، ألمانيا) إلى المسار الضوئية للحد من إثارة للصباغة وزير الخارجية ؛
- ملء ماصة التحميل مع 10 ميكرولتر من محلول الصبغة FM ، تحميل ماصة في micromanipulator وتخفيض ماصة على إعداد دون الضغط الزائد حتى يتم التنسيق في الطائرة نفس الخلية القطبين تريد تحميل. تأكد من وجود أصحاب القطب اثنين على الأقل : لا يمكن لاحد وتستخدم لصبغ FM تستعمل للقط التصحيح ، وإلا فإنه قد تلوث الحل داخل الخلايا ؛
- موقف فتح البخاخ على مسافة نحو 10 ميكرومتر من محطة المحور ، تحويل نظام superfusion قبالة ونفخة في محلول الصبغة لمدة 10 ثانية عن طريق تحويل الضغط الزائد على ماصة ؛
- تحويل الضغط الزائد والخروج ، من دون تحريك ماصة ، والانتظار لمدة 30 ثانية ؛
- تحويل superfusion والاستحمام في الغرفة في حل ADVASEP - 7 لمدة 5 دقائق. في غضون ذلك ، إزالة ماصة البخاخ من الحمام ؛
- بعد 5 دقائق ، والتحول إلى انخفاض الكالسيوم 2 + صوت الجرس ، ويروي للغرفة لمدة 25-30 دقيقة للسماح إزالة الصبغة الزائدة.
الجزء 3 : تصحيح لقط والتصوير TIRFM
- في حين أن إعداد وغسل بها ، وسحب ماصات التصحيح من الزجاج البورسليكات سميكة الجدران (B150 - 86 - 10 ؛ سوتر شركة الصك ، نوفاتو ، CA). التصحيح ماصة المقاومة هي في حدود 80-10 MΩ ؛
- تغسل بعد اكتمال وضع محطة محوار في مركز مجال الرؤية ؛
- ملء ماصة التصحيح مع 7μL الحل الداخلي ، والاستفادة من ماصة للتخلص من فقاعات الهواء ، ومعطف ماصة مع الشمع المنصهر الأسنان (موضوع الشمع ؛ مؤسسة كير ، أورانج ، كاليفورنيا) وتركيبها في micromanipulator ؛
- تحويل الضغط الزائد على ماصة وتخفيض ماصة ببطء على التحضير. الاختيار المقاومة ماصة في مكبر للصوت ، وإزاحة ماصة الصحيح والسعة مع الضوابط مكبر للصوت منها ؛
- تبديل superfusion للسيطرة على الجرس. لإنشاء gigaseal بين ماصة والخلية ، لمسة قليلا غيض من القطب ضد خلايا الجسم وتحويل الضغط الزائد ماصة قبالة بلطف مع تطبيق الضغط السالب إلى القطب ؛
- بينما مختومة ، واختيار "خلية كاملة" في وضع مكبر للصوت وتعيين زنزانة المحتملة إلى -60 بالسيارات ؛
- اختيار المنطقة في المصالح مع برامج التصوير التي تشمل محطة محور عصبي كامل ، وتحويل ضوء قبالة ومشرق الميدان ، من خلال تعريض لفترة وجيزة (30 مللي) محطة ليزر نانومتر 488 ، عثور على الطائرة حق الاتصال للتصوير TIRF ؛
- اقتحام خلية باستخدام "انطلق" القيادة من مكبر للصوت أثناء تطبيق الضغط السلبي قليلا إلى ماصة ؛
- الصحيح لسعة الخلية والمقاومة السلسلة ، ومن ثم تطبيق بروتوكول الجهد المصالح أثناء التصوير حركة الحويصلات متشابك. فمن المهم في هذه المرحلة أن يكون البروتوكول الجهد تزامن الى الكاميرا معدل الإطار. في حالتنا ، كل الإطار هو 30 مللي طويل ، وبالتالي فإن التغييرات في الجهد تحدث مضاعفات هذه القيمة (أي كل 300 مللي أو إطارات 10) ؛
- الانتظار على الأقل 40 ثانية بين التجارب للسماح للانتعاش ؛
- للتحقق من موقف شرائط متشابك ، والتقاط صور في حين تحول ليزر 561 نانومتر جرا.
الشكل 1 : الإعداد التجريبية. وتركز الليزر 488 نانومتر (الأزرق) على هامش البؤري الخلفي للموضوعية وتعاني الانعكاس الداخلي الكامل ، عندما يصل إلى واجهة الزجاج المائي المتوسط. الحقل الكهرومغناطيسي التي تم إنشاؤها بواسطة الشعاع المنعكس يثير fluorophore تحميلها في الحويصلات متشابك الأقرب إلى بوتام من الغرفة الزجاجية ، والتي يتألق ثم (الخضراء). ويسترشد ثم ضوء الفلورسنت لعين المراقب (صور) أو كاميرا CCD. يتم التحكم إمكانات غشاء الخلايا المصورة في نفس الوقت عن طريق التصحيح ، تحامل عليها. هذا النهج يتيح للدراسة العلاقة بين الإشارات الواردة (الجهد الغشاء) والإخراج العصبية (إيماس).
الشكل 2 : نتائج نموذجي. اليسار : صورة مشرقة ميدان خلية معزولة ذهبية القطبين. اليمنى : صورة TIRF من الحويصلات متشابك في محور عصبي بين القطبين محطة الخلية محملة FM 1-43 ® والمصورة مع ليزر 488 نانومتر (FM صبغة). أسفل اليمين : صورة للمحطة نفسها بعد خلية التصحيح والتصوير المعبر محوار مع الليزر 561 نانومتر. وصفت شرائط متشابك من الببتيد RIBEYE ملزم رودامين المستندة (Rpep_rhod).
الجدول رقم 1 : الكواشف والمعدات الخاصة.
اسم | نوع | الصانع | فهرس | تعليق |
| -- | الجدول الهواء | شركة نيوبورت | -- | -- |
| IX70 | مجهر مقلوب | اوليمبوس | -- | مجهزة مصباح التنغستن لحقل مشرق وفتح الميناء الوحشي للTIRF |
| TH4 - 100 | مصباح مصدر الطاقة | اوليمبوس | -- | -- |
| FF498_581 - Di01 | تصفية مزدوج اللون | Semrock | -- | -- |
| NF01 - 405_488_568 | تصفية الانبعاثات | Semrock | -- | -- |
| آبو X100 O HR | هدف | اوليمبوس | -- | NA 1.65 |
| RG630 | أحمر تصفية الزجاج | شوت | -- | -- |
| -- | 488 نانومتر ليزر | متماسك | -- | استخدام القوة في الدنيا |
| -- | مصراع | Uniblitz | -- | -- |
| VMM - D1 | مصراع سائق | Uniblitz | -- | -- |
| -- | 561 نانومتر ليزر | ميليس Griot | -- | -- |
| -- | مصراع | Uniblitz | -- | -- |
| VMM - D3 | مصراع سائق | Uniblitz | -- | -- |
| ضغط التروية كيت | Superfusion النظام | أتمتة العلمية | 09-04 | -- |
| نضح القلم | Superfusion النظام | أتمتة العلمية | -- | -- |
| Valvelink 8 | Superfusion نظام تحكم | أتمتة العلمية | -- | -- |
| تتالي 512B | EM كاميرا CCD | روبر العلمية | -- | -- |
| Metamorph 7.1 | برامج التصوير | الأجهزة الجزيئية | -- | -- |
| EPC - 9 | التصحيح المشبك مكبر للصوت | HEKA الكترونيك | -- | -- |
| نبض | برمجيات مكبر للصوت | HEKA الكترونيك | -- | -- |
| MP - 285 | Micromanipulator | سوتر الصك | -- | -- |
| -- | القطب هولدر | HEKA الكترونيك | -- | مقابل 1.5 مم OD الزجاج ، 2 وحدة |
| كويك سن الفيل ® TW150 - 3 | شعرية زجاج البورسليكات | WPI | -- | دون خيوط |
| B150 - 86-10 | شعرية زجاج البورسليكات | سوتر الصك | -- | مع خيوط |
| P - 97 | Microelectrode بولير | سوتر الصك | -- | خيوط مجهزة 3x3 مربع وغرفة البيئية |
| -- | مضخة ضغط الهواء فراغ | توماس العلمية | 7893B05 | يخلق فراغا لإزالة السوائل من الغرفة والضغط الزائد عن ماصات |
| R2008a ماتلاب | تحليل البرمجيات | MathWorks | -- | -- |
| 353001 | 35 ملم صحون بلاستيكية الثقافة | صقر | -- | -- |
| -- | ارتفاع مؤشر الإنكسار للزجاج | PlanOptik | -- | معامل الانكسار 488 نانومتر = 1.78 |
| سلسلة M | ارتفاع مؤشر الإنكسار السائل | Cargille مختبرات | -- | معامل الانكسار = 1.78 |
| Sylgard 184 | السيليكون إلاستومر كيت | داو كورننغ | -- | -- |
| الجلوتاثيون | ثلاثي الببتيد | EMD كيماويات | radica مجانال زبال | |
| هيالورونيداز | انزيم | سيغما | H6254 | النوع الخامس |
| L - السيستين | حمض أميني | Fluka | 30090 | ينشط غراء |
| غراء | انزيم | Fluka | 76220 | من البابايا Carica |
| Trolox ® | ذوبان فيتامين (ه) | سيغما | 56510 | زبال الحرة الراديكالية |
| ADVASEP - 7 | المسلفنة B - Cyclodextrin المشتقة | سيغما | A3723 | يقلل FM 1-43 ® الخلفية مضان |
| FM 1-43 ® | صبغ فلوري | Invitrogen | T35356 | "التعبئة الخاصة" |
| زجة الشمع | ماصة عامل طلاء | مؤسسة كير | -- | انخفاض السعة ماصة |
الجدول 2 : حلول فسيولوجية المستخدمة في هذه الدراسة.
مادة | انخفاض كا 2 + رينغر | السيطرة رينغر | ارتفاع K + رينغر | حلول داخلية |
| كلوريد الصوديوم | 120 ملم | 120 ملم | 97.5 ملي | -- |
| بوكل | 2.5 ملم | 2.5 ملم | 25 ملم | -- |
| MgCl 2 | 1 ملم | 1 ملم | 1 ملم | 4 ملم |
| CaCl 2 | 0.5 ملم | 2.5 ملم | 2.5 ملم | -- |
| HEPES | 10 ملي | 10 ملي | 10 ملي | 10 ملي |
| EGTA | 0.75 ملي | -- | -- | 0.5 ملم |
| جلوكوز | 10 ملي | 10 ملي | -- | -- |
| الجلوتاثيون | 2 ملم | 2 ملم | -- | 1 ملم |
| CH 3 منظمات المجتمع المدني 3 S * | -- | -- | -- | 100 ملي |
| TEACl | -- | -- | -- | 10 ملي |
| ATP - MG | -- | -- | -- | 10 ملي |
| GTP لى | -- | -- | -- | 1 ملم |
| Rpep - rhod ** | -- | -- | -- | 5 ملم |
| حجم | 200 مل | 100 مل | 5 ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
* methanesulfonate السيزيوم.
** RIBEYE ملزم الببتيد : رودامين + EQTVPVDLSVARDR - COOH (1997،75 ميجاوات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مزايا المجهري TIRF الهدف من النوع هي أن 1) أنه يوفر sectioning البصرية ممتازة من خلال تقييد ضوء الإثارة إلى منطقة ضيقة داخل الطائرة البؤرية لهذا الهدف ، وبالتالي تقليل الخروج من تركيز الضوء ؛ 2) منذ قطرات الضوء بشكل كبير ، مع المسافة يمكن رصد حركة في اتجاه عمودي على أنه تغيير في كثافة مضان ، 3) جمع ضوء كفاءة من خلال الفتحة العددية الهدف 1،5 عالية.
العيب الرئيسي من هذه التقنية هو أن تقتصر على الأحداث التصوير يحدث داخل نانومتر و 100 من سطح الخلية ، وهو ما يعادل تقريبا إلى قسم سامسونج في المجهر الإلكترون. ولذلك ، تصور هذه الأحداث تعتمد بشكل حاسم على الخلايا التي انضمت بحزم على الزجاج ، على وجود أشرطة متشابك على مقربة من رقعة من الغشاء انضمت إلى الزجاج وعلى حويصلات التحميل بنجاح. بروتوكول يتيح لنا تحميل فقط 1-2 ٪ من إجمالي عدد حويصلات داخل الخلية محطة متشابك 2،6 القطبين. مع أن قال ، فمن الواضح أن هناك المزيد من الأحداث الكثير مما يجري على سطح الخلية من تلك التي نحن قادرون على الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY 14990.
References
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
