Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Summary

In deze video laten we zien hoe te labelen en te visualiseren enkele synaptische blaasjes exocytose en handel in goudvissen het netvlies bipolaire cellen met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.

Abstract

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een techniek die de studie van de gebeurtenissen op het celmembraan kunnen door selectieve beeldvorming van fluorescerende moleculen die het dichtst bij een hoge brekingsindex stof zoals glas

Protocol

Deel 1: Dissection en bipolaire celisolatie

1. Bereid oplossingen opgenomen in tabel 2; De pH van Ringers '(extern) oplossingen moeten worden aangepast aan de 7.4 met NaOH en de pH van de interne oplossing dient te worden aangepast tot 7,2 met CsOH. Bescherm de interne oplossing tegen licht af met aluminiumfolie en houd het bij 4 ° C tot gebruik;
2. Dark-aan te passen een goudvis minstens 30 minuten voor dissectie;
3. Terwijl het dier donker past, voor te bereiden 5 ml van de hyaluronidase (type V hyaluronidase, 1100 eenheden / ml in lage Ca ^{2 +} beltoon's; Sigma, St. Louis, MO) en 10 ml van de L-cysteïne (0,5 mg / ml in lage Ca ^{2 +} Ringer's) oplossingen en wegen van de papaïne (gevriesdroogd poeder, 40 eenheden / ml; Sigma, St. Louis, MO) voor 5 ml van de spijsvertering oplossing;
4. Euthanaseren de goudvis door een snelle onthoofding met chirurgische schaar en vernietigen van de hersenen en het ruggenmerg met een # 11 scalpel;
5. Verwijder de ogen door de vernietiging van de extra-oculaire spieren met behulp van een # 7 gebogen Dumont pincet en snijden van de oogzenuw met iris schaar;
6. Plaats een oog lamp op een stuk filtreerpapier en prik de sclerale limbus met de punt van een # 11 scalpel;
7. Introduceer het blad van een paar van vannas schaar in de lekke geheel en weggesneden het hele voorste segment;
8. Leg een klein stukje filtreerpapier op de top van de resterende optische kop en oefenen een zekere druk om het papier nat met glasvocht;
9. Til het filter papier met het netvlies die eraan verbonden zijn en snijd de optische zenuw met een par van vannas scharen;
10. Plaats het filter met het netvlies in een 35 mm kunststof cultuur schotel met hyaluronidase oplossing en loslaten van het netvlies van het filter papier met behulp van de # 7 Dumont pincet;
11. Snijd het netvlies in 4-6 stukken met de helft van een industrieel koolstofstaal single-edged mes en laat het zitten in de hyaluronidase oplossing gedurende 20 minuten;
12. Tijdens het wachten voor hyaluronidase door te voeren, voeg 5 ml van de L-cysteïne oplossing voor de papaïne en laat hem gaan zitten totdat de vloeistof transparant (ongeveer 5-10 minuten);
13. Was de stukjes netvlies 3x in lage Ca ^{2 +} Ringer's en laat ze in de papaïne oplossing zitten voor 30-35 minuten;
14. Was de stukjes netvlies 3x in lage Ca ^{2 +} Ringer's en ze tot gebruik op te slaan 4 ° C in een 35 mm plastic cultuur schotel met een lage Ca ^{2 +} Ringer's;
15. Te dissociëren van de cellen, zet een stuk van het netvlies in een microcentrifugebuis met 500 ml van een lage Ca ^{2 +} Ringer's en langzaam het netvlies vermaal door pipetteren op en neer met een glas dissociatie pipet voorzichtig om geen luchtbellen te produceren. Dissociatie pipetten zijn vervaardigd door het opwarmen van de tip van een glas Pasteur pipet met een bunsenbrander en licht te buigen met behulp van anatomische pincet;
16. Het bord van de geïsoleerde cellen door het toevoegen van een daling van de retinale schorsing voor een home-made opname kamer voorheen gevuld met 2 ml van een lage Ca ^{2 +} beltoon's. De kamer bestaat uit de onderste helft van een 35-mm kunststof cultuur schotel met een ronde geheel in het midden en een cirkelvormige dekglaasje van 1,78 brekingsindex glas (PlanOptik, Duitsland) vastgelijmd aan de bodem met een siliconen elastomeer (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI).

Deel 2: Bipolaire Cel Laden en Wash Out

TIRF beeldvorming van synaptische blaasjes het beste uitgevoerd met behulp van een objectieve-type TIRFM microscoop met een zeer hoge NA doelstelling en een gevoelige camera. Voor onze experimenten, kiezen we ervoor om een ​​1,65 NA doelstelling (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japan) met een EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ) te gebruiken. Het gebruik van de zeer hoge NA doel is het gebruik van hoge refractieve dekglaasjes en onderdompeling vloeistof (di-joodmethaan met zwavel). Onder onze voorwaarden, is het excitatie licht beperkt tot een exponentieel afvallende veld met een lengte constante van ongeveer 50 nm.

1. Voeg een druppel hoge brekingsindex vloeistof (M-serie, brekingsindex = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) om de microscoop doel;
2. Zorgvuldig plaats de opname kamer op de top van de microscoop objectief en zorgvuldig te monteren massa-elektrode en superfusie exit pijp kamer;
3. Laat kamer op microscoop te zitten gedurende 10-20 minuten, zodat cellen te zinken en naar de bodem kleven;
4. In de tussentijd, voor te bereiden 5 ml van een 1 mM trolox ® ((±)- 6-hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbonzuur; Sigma, St. Louis, MO) oplossing in een hoge K ⁺ Ringer's . Ultrasone trillingen totdat het is opgelost;
5. Bereid 15 ml ADVASEP-7 wassen oplossing: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) in lage Ca ^{2 +} beltoon's. Merk op dat ADVASEP-7 gebruik is optioneel en kan worden weggelaten indien gewenst;
6. Spoel de superfusie lines en voeg ADVASEP-7 wasoplossing, lage Ca ^{2 +} beltoon-en controlesysteem van beltoon aan de superfusie systeem;
7. Trek de laden van pipetten van dunwandige borosilicaatglas (Kwik-Fil ® TW150-3, WPI, Sarasota, FL). Puffer pipet weerstanden zijn in de 1,5-2,5 MΩ bereik;
8. Bereid de FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styrylkleurstoffen) pyridinium dibromide, "speciale verpakking", Invitrogen, Carlsbad, CA) oplossingen. Maak eerst een een mM voorraad door de toevoeging van 160 pi gedestilleerd water tot een flacon (100 mg) van FM1-43 ®. Deze voorraad kan worden gehouden op 4 ° C gedurende maximaal een week. Dan, voeg 5 ul FM1-43 ® tot en met 1 mL hoge K ⁺ beltoon's + 1 mM trolox ®. Bescherm de oplossing tegen licht af met aluminiumfolie en houd het bij 4 ° C tot gebruik;
9. Draai de microscoop helderveld licht op en zoek naar intacte bipolaire cellen. Iets tik op de microscoop om ervoor te zorgen dat de neuronen stevig zijn bevestigd aan de bodem van de kamer;
10. Plaats de superfusie pen dicht bij de cel van belang en continu de voorbereiding perfuseren met een lage Ca ^{2 +} beltoon's;
11. Schakel verlichting in de kamer en voeg een rode lange pass filter (dat wil zeggen RG630, Schott, Duitsland) om de optische pad naar excitatie van de FM-kleurstof minimum te beperken;
12. Vul een laad-pipet met 10 pi van de FM-kleurstof oplossing, monteert u de pipet in de micromanipulator en laat de pipet op de voorbereiding, zonder overdruk tot het op dezelfde focal plane als de bipolaire cel die u wilt laden. Zorg ervoor dat u ten minste twee elektroden houders: de een wordt gebruikt voor de FM-kleurstof kan niet gebruikt worden voor patch klemmen, of anders kan de intracellulaire oplossing verontreinigen;
13. Plaats de puffer opening op een afstand van ongeveer 10 micrometer van het axon terminal, schakelt u de superfusie systeem uit en trek de kleurstof oplossing gedurende 10 seconden door het draaien van de pipet overdruk op;
14. Schakel de overdruk uit en, zonder het verplaatsen van de pipet, wacht 30 seconden;
15. Schakel de superfusie aan en baden de kamer in ADVASEP-7-oplossing gedurende 5 minuten. In de tussentijd, verwijder de puffer pipet uit het bad;
16. Na 5 minuten, overschakeling naar een lage Ca ^{2 +} beltoon en perfuseren de kamer voor 25-30 minuten tot het verwijderen van overtollige kleurstof toe te staan.

Deel 3: Patch klem-en TIRFM Imaging

1. Terwijl de voorbereiding is het wassen, trek patch pipetten van dikwandige borosilicaatglas (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch pipet weerstanden zijn in de 8-10 MΩ bereik;
2. Na het wassen is voltooid, plaatst u het axon terminal in het centrum van het gezichtsveld;
3. Vul een patch pipet met 7μL van interne oplossing, tikt u op het pipet om zich te ontdoen van luchtbellen, de vacht van de pipet met gesmolten tandartsen (Sticky Wax, Kerr Corporation, Orange, CA) en het monteren in de micromanipulator;
4. Zet de pipet overdruk op en langzaam lager de pipet op de voorbereiding. Controleer pipet weerstand in de versterker en de juiste pipet offsets en capaciteit met de respectieve versterker controles;
5. Schakel de superfusie te beltoon controle. Voor het maken van een gigaseal tussen de pipet en de cel, licht raakt de punt van de elektrode tegen het cellichaam en zet de pipet overdruk uit terwijl zachtjes het toepassen van negatieve druk op de elektrode;
6. Terwijl gesloten, kies "whole cell"-modus in de versterker en zet de cel met potentie tot -60 mV;
7. Kies een regio van belang met de imaging-software die de hele axon terminal omvat, draait u de helderveld licht uit en door kort bloot te stellen (30 ms) de terminal naar de 488 nm laser, vinden van de juiste focal plane voor TIRF beeldvorming;
8. Breken in de cel met behulp van de "zap"-commando van de versterker, terwijl het toepassen van licht negatieve druk op de pipet;
9. Corrigeren voor cel-capaciteit en de serie weerstand, en pas vervolgens de spanning protocol van belang, terwijl de beeldvorming van de beweging van synaptische blaasjes. Het is in deze fase belangrijk om de spanning protocol gesynchroniseerd met de camera frame rate. In ons geval, elk frame is 30 ms lang, dus de spanning veranderingen optreden in veelvouden van deze waarde (dat wil zeggen, elke 300 ms of 10 frames);
10. Wacht ten minste 40 seconden tussen de trials te zorgen voor herstel;
11. Het controleren van de positie van synaptische linten, foto's maken terwijl u de 561 nm laser op.

Figuur 1: De experimentele opstelling. Een 488 nm laser (blauw) is gericht naar de periferie van de rug brandvlak van de objectieve en lijdt totale interne reflectie wanneer zij tot de glas-waterig medium interface. Het elektromagnetische veld gegenereerd door de gereflecteerde bundel prikkelt de fluorofoor geladen in de synaptische blaasjes het dichtst bij de bottOM van de glazen kamer, die vervolgens lichten (groen). De TL-licht wordt vervolgens geleid naar het oog van de waarnemer (afgebeeld) of een CCD-camera. Het membraan potentieel van de verbeelde cellen wordt tegelijkertijd gecontroleerd door patch-klemmen ze. Deze aanpak laat de studie van de relatie tussen de binnenkomende signalen (het membraan spanning) en de neuronale output (exocytose).

Figuur 2: Typische gevolgen. Links: helderveld beeld van een geïsoleerde goudvissen bipolaire cel. Rechts boven: TIRF beeld van de synaptische blaasjes in de bipolaire cel axon terminal geladen met FM 1-43 ® en afgebeeld met de 488 nm laser (FM kleurstof). Rechtsonder: beeld van dezelfde terminal na het patchen van de cel en beeldvorming van de axon terminal met de 561 nm laser. Synaptische linten zijn gelabeld door de rhodamine-gebaseerde ribeye-bindende peptide (Rpep_rhod).

Tabel 1: Specifieke Reagentia en apparatuur.

Naam	Type	Fabrikant	Catalogus	Commentaar
-	Lucht Tabel	Newport Corporation	-	-
IX70	Omkeermicroscoop	Olympus	-	Uitgerust met een wolfraam lamp voor helderveld en een zijdelingse opening poort voor TIRF
TH4-100	Lamp Power Source	Olympus	-	-
FF498_581-DI01	Dichroic Filter	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	Emissie Filter	Semrock	-	-
Apo x100 O HR	Objectief	Olympus	-	NA 1,65
RG630	Rode glasfilter	Schott	-	-
-	488 nm Laser	Samenhangend	-	Gebruik op minimaal vermogen
-	Sluiter	Uniblitz	-	-
VMM-D1	Sluiter Driver	Uniblitz	-	-
-	561 nm Laser	Melles Griot	-	-
-	Sluiter	Uniblitz	-	-
VMM-D3	Sluiter Driver	Uniblitz	-	-
Perfusiedruk Kit	Superfusie System	Automatiseer Wetenschappelijke	09-04	-
Perfusie Pen	Superfusie System	Automatiseer Wetenschappelijke	-	-
Valvelink 8	Superfusie System Controller	Automatiseer Wetenschappelijke	-	-
Cascade 512B	EM CCD Camera	Roper Scientific	-	-
Metamorph 7.1	Imaging Software	Molecular Devices	-	-
EPC-9	Patch Clamp Versterker	HEKA Elektronik	-	-
Pols	Versterker Software	HEKA Elektronik	-	-
MP-285	Micromanipulator	Sutter Instrument	-	-
-	Electrode Holder	HEKA Elektronik	-	Voor 1,5 mm OD glas, 2 stuks
Kwik-Fil ® TW150-3	Borosilicaat Capillaire Glas	WPI	-	Zonder filament
B150-86-10	Borosilicaat Capillaire Glas	Sutter Instrument	-	Voor gloeilampen en
P-97	Micro-elektrode Puller	Sutter Instrument	-	Uitgerust met 3x3 box filament en milieu-kamer
-	Druk Vacuüm Air Pump	Thomas Wetenschappelijke	7893B05	Maakt vacuüm om vloeistoffen te verwijderen uit kamer-en overdruk voor pipetten
MatLab R2008a	Analyse Software	MathWorks	-	-
353001	35 mm Plastic Cultuur Dishes	Valk	-	-
-	High Refractive Index Glass	PlanOptik	-	Brekingsindex 488 nm = 1,78
Serie M	High Refractive Index Liquid	Cargille Labs	-	Brekingsindex = 1,78
Sylgard 184	Silicium Elastomeer Kit	Dow Corning	-	-
Glutathion	Tripeptide	Merck Chemicals		Gratis Radical scavenger
Hyaluronidase	Enzym	Sigma	H6254	Type V
L-cysteïne	Amino Acid	Fluka	30090	Activeert papaïne
Papaïne	Enzym	Fluka	76220	Van Carica papaya
Trolox ®	Oplosbare vitamine E	Sigma	56510	Vrije radicalen
ADVASEP-7	Gesulfoneerde B-cyclodextrinederivaat	Sigma	A3723	Vermindert FM 1-43 ® achtergrond fluorescentie
FM 1-43 ®	Fluorescerende kleurstof	Invitrogen	T35356	"Speciale verpakking"
Sticky Wax	Pipet Coating Agent	Kerr Corporation	-	Verlaagt pipet capaciteit

Tabel 2: fysiologische oplossingen gebruikt in deze studie.

Stof	Lage Ca 2 + Ringer's	Controle Ringer's	Hoge K + Ringer's	Interne oplossing
NaCl	120 mM	120 mM	97,5 mM	-
KCl	2.5 mM	2.5 mM	25 mM	-
MgCl 2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mM
CaCl 2	0.5 mM	2.5 mM	2.5 mM	-
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0,75 mM	-	-	0.5 mM
Glucose	10 mM	10 mM	-	-
Glutathion	2 mM	2 mM	-	1 mM
CH 3 CSO 3 S *	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-Rhod **	-	-	-	5 mM
Volume	200 ml	100 ml	5 microliter	100 ul

* Cesium methaansulfonaat.
** Ribeye-bindend peptide: rhodamine + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

Discussion

De voordelen van objectieve-type TIRF microscopie zijn dat 1) het uitstekende optische sectie biedt door het beperken van excitatie licht naar een smal gebied in het brandvlak van de doelstelling, waardoor het minimaliseren van out-of-focus licht, 2) omdat het licht daalt exponentieel met de afstand kan beweging in een verticale richting worden gevolgd als een verandering in de fluorescentie-intensiteit, 3) efficiënte licht collectie door de hoge numerieke apertuur doel ^1,5.

Het belangrijkste nadeel van de techniek is dat het beperkt is tot imaging gebeurtenissen binnen 100 nm en van het celoppervlak, wat ongeveer overeenkomt met een ultradunne sectie in elektronenmicroscopie. Daarom is visualisatie van deze gebeurtenissen hangt sterk van de cellen wordt stevig gehandeld op grond van het glas, op de aanwezigheid van synaptische linten dicht bij de patch van membraan gehandeld op grond van het glas en op de succesvolle laden van blaasjes. Ons protocol maakt het laden van slechts 1-2% van het totale aantal van blaasjes in de bipolaire cel synaptische terminal ^2,6. Met dat gezegd, is het duidelijk dat er veel meer gebeurtenissen op het celoppervlak dan degene die we in staat om beeld.