Summary
이 비디오에서는, 우리는 총 내부 반사율의 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 금붕어 망막 바이폴라 세포에서 단일 시냅스 소포의 exocytosis와 인신 매매를 라벨 및 시각화하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
총 내부 반사율 형광 (TIRF) 현미경은 유리 같은 높은 굴절률 물질에 가까운 형광 분자의 선택적 이미징에 의해 세포막에서 일어나는 사건의 연구를 수있게 해주는 기술입니다
Protocol
1 부 : 해부 및 바이폴라 셀 절연
- 표 2에 나열된 솔루션을 준비, 링거스 '의 산도는 (외부) 솔루션은 NaOH와 7.4으로 조정되어야하며 내부 솔루션의 산도는 7.2 CsOH로 조정해야합니다. 알루미늄 호일과 빛으로부터 내부 솔루션을 보호하고 4를 유지 ° C를 사용까지;
- 해부하기 전에 적어도 30 분 금붕어를 어두운 적응;
- (; 시그마, 세인트 루이스, MO 낮은 칼슘 2 + 링거스 입력 V의 hyaluronidase, 1100 단위 / ML)과 L - 시스테인 (0.5 MG / ML 10 ML 동물이 어두운 적응하지만, hyaluronidase 5 ML 준비 낮은 칼슘 2 + 링거스) 솔루션과 papain (동결 건조된 분말, 40 단위 / ML 무게, 소화 솔루션의 5 ML 위해를 시그마, 세인트 루이스, MO);
- 수술 가위로 빠르게 잘린하여 금붕어를 안락사와 11 # 메스 블레이드와 두뇌 및 척수를 파괴;
- # 7 곡선 더몬트 집게의 도움으로 추가 - 안구 근육을 파괴하고 홍채 가위로 시신경을 절단하여 눈을 제거;
- 필터 종이 찔린 11 # 메스 블레이드의 팁과 scleral limbus의 조각에 올려 놓으 아이 전구;
- 구멍 전체가 내부 vannas의 가위의 칼날을 소개하고 거리 전체 앞쪽에 세그먼트를 잘라;
- 나머지 광학 컵 위에 종이 필터의 작은 조각을 놓고 종이가 유리 유머와 흠뻑 젖어있는 권한을 부여하기 위해 압력 좀 넣으;
- 그것에 연결된 망막과 필터 종이를 들고 vannas 가위 파와 시신경을 잘라;
- # 7 더몬트 핀셋의 도움으로 여과지에서 망막에서 hyaluronidase 솔루션과 껍질이있는 35mm 플라스틱 문화 접시에있는 망막을 포함하는 필터 용지를 놓습니다;
- 산업 소강 단일 깨끗 블레이드의 절반과 4-6 조각으로 망막 컷과 20 분 동안 hyaluronidase 용액에 앉아 보자;
- 을 적용하려면 hyaluronidase를 기다리는 동안, papain으로 L - 시스테인 솔루션의 5 ML을 추가하고 액체가 투명하게 될 때까지 (약 50~10분) 앉아 보자;
- 낮은 칼슘 2 + 링거스에 배 망막의 조각을 씻고 그들 30~35분에 대한 papain 솔루션에 앉히지;
- 낮은 칼슘 2 + 링거스에 배 망막의 조각을 씻어 4에서 사용하기 전까지 그들을 저장할 ° 낮은 칼슘 2 포함 35mm 플라스틱 문화 접시에있는 C + 링거스;
- 세포를 떼어 놓다하려면, 낮은 칼슘 2 + 링어의 500 ML를 포함하는 microcentrifuge 관에서 망막의 한 조각을 넣고 천천히 모든 공기 방울을 생산하지 않는 신중하게, 유리 분리 피펫으로 위아래로 pipetting하여 망막을 씹다. 분리의 pipettes은 알콜 램프와 유리 파스퇴르 피펫의 팁을 가열하고 약간 해부 집게의 도움으로 그것을 절곡하여 가공되며
- 이전에 적은 칼슘 2 + 링거스 2 ML 가득한 집에서 만든 녹화 실로 망막 정지 한 방울을 추가하여 플레이트 분리된 세포를. 챔버는 중앙에 원형 전체와 35 mm 플라스틱 문화 요리와 실리콘 엘라스토머 (Sylgard 184와 함께 바닥에 붙어 1.78 굴절률 유리 (PlanOptik, 독일)의 원형 coverslip의 아래쪽 절반으로 구성되어, 다우 코닝 , 미들랜드, MI).
2 부 : 바이폴라 셀 로딩과 와시 아웃
시냅스 vesicles의 TIRF 이미지는 최상의 매우 높은 NA의 객관적이고 민감한 카메라 객관적인 타입 TIRFM 현미경을 사용하여 수행됩니다. 실험을 위해, 우리는 EMCCD (캐스케이드 512B, 로퍼 과학, 투싼, AZ)로 1.65 NA 목표 (APO x100 O HR, NA 1.65, 올림푸스, 일본)를 사용하여 선택합니다. 매우 높은 NA의 목적의 사용은 높은 굴절률 유리 coverslips 및 침지 유체 (유황과 디 - 이오도 메탄)의 사용을 요구. 우리의 조건에서, 여기 라이트는 약 50 nm의의 일정한 길이가 기하 급수적으로 부패 분야로 제한됩니다.
- 현미경 목표 높은 굴절률 액체 (M 시리즈, 굴절률 = 1.7800, Cargille 연구소 시더 그로브, NJ)의 한 방울을 추가합니다;
- 현미경 목표 위에 조심스럽게 기록 챔버를 놓고 신중하게 접지 전극과 실로 superfusion 출구 파이프를 탑재;
- 챔버는 세포가 싱크대와 바닥을 준수하도록 10~20분에 대한 현미경에 앉아 보자;
- 그 동안에, 1mM trolox ® ((±)- 6 - 히드록시 -2 ,5,7,8 - tetramethylchromane - 2 - 카르복실산 5 ML 준비, 시그마, 세인트 루이스, 높은 K + 링거스에 MO) 솔루션 . 녹아까지 Sonicate;
- 낮은 칼슘 2 + 링거스 1 MM ADVASEP - 7 (시그마, 세인트 루이스, MO) : ADVASEP - 7 세척 솔루션 15 ML을 준비합니다. ADVASEP - 7 사용 선택하고 원하는 경우 생략할 수 있습니다;
- superfusion의 리튬을 정화NES 및 추가 ADVASEP - 7 세척 솔루션, 낮은 칼슘 2 + 링거스 및 제어 대타가 superfusion 시스템의;
- 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 유리 (; WPI, 사라소타, 플로리다 퀵 - Fil ® TW150 - 3)에서 pipettes를 로드할 당겨. 퍼퍼 피펫 resistances는 1.5-2.5 MΩ 범위에;
- 솔루션, FM1 - 43 ® (Invitrogen, 칼스 배드, CA - - (4 (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide, "특별한 포장을"N - (3 - triethylammoniumpropyl) -4) 준비. 첫째, FM1 - 43 중 하나를 유리병 (100 MG) ® 160 μL 증류수를 추가하여 1 ㎜의 주식을합니다. 이 주식은 최대 일주일 4 ° C에 보관하실 수 있습니다. 그런 다음, FM1 - 43 5 μL를 추가 ® 1 ML 높은 K + 링거스 + 1mM trolox ® 수 있습니다. 알루미늄 호일과 빛으로부터 보호 솔루션을 4에서 보관 ° C를 사용까지;
- 에 대한 현미경 명시야 조명을 켜고 그대로 바이폴라 세포에 대한 검색합니다. 약간 신경이 단단히 챔버 하단에 첨부되어 있는지 확인하기 위해 현미경 탭;
- 가까운 관심 세포에 superfusion 펜을 위치하고 지속적으로 낮은 칼슘 2 + 링거스으로 준비를 perfuse;
- 객실 조명을 끄고 빨간색 긴 패스 필터 (즉, RG630, 쇼트, 독일)을 추가 FM 염료 여기를 최소화하기 위해 광 경로;
- FM 염료 용액 10 μL와 로딩 피펫을 채우기 micromanipulator에 피펫을 탑재하고 당신이 부하하려는 바이폴라 세포와 같은 초점 비행기에까지 압력없이 준비에 피펫을 낮추십시오. 당신은 적어도 두 전극 홀더를 확인하십시오 : FM 염색에 사용되는 한 그것은 세포 용액을 오염시킬 수 있습니다 다른 패치 클램핑 사용하거나, 수 없습니다;
- 축삭 터미널에서 약 10 μm의의 거리에서 퍼퍼 오픈 위치, superfusion 시스템을 해제 및 피펫 과압을 설정하여 10 초 동안 염료 솔루션을 퍼프;
- 30 초 동안 기다, 피펫을 움직이지 않고, 압력을 끄고;
- 에 superfusion을 켜고 5 분 ADVASEP - 7 솔루션 챔버 목욕. 그 동안에, 목욕탕에서 호흡기의 피펫을 제거;
- 5 분 후에, 낮은 칼슘 2 + 링거스로 전환하고 초과 염료의 제거를 허용하도록 25~30분 위해 챔버를 perfuse.
3 부 : 패치 클램핑 및 TIRFM 이미징
- 준비가 세척하는 동안 두꺼운 벽의 borosilicate 유리 (; 서터 악기 회사 노바토, CA B150 - 86 - 10)에서 패치 pipettes를 가져옵니다. 패치 피펫 resistances은 80-10 MΩ 범위에;
- 씻어가 완료되면,보기의 필드의 중앙에 축삭 터미널 장소;
- 그리고 micromanipulator에 장착, 내부 솔루션 7μL와 패치 피펫을 채우기, 공기 방울, 코트 용융 치과 왁스 (커 주식 회사, 오렌지, CA 끈적 왁스)와 피펫을 없애기 위해 피펫을 탭;
- 에 피펫 과압을 켜고 준비에 서서히 피펫을 낮추십시오. 앰프의 피펫 저항 정확한 피펫의 오프셋과 각 앰프 컨트롤과 함께 용량을 확인하십시오;
- 링거스를 제어할 수 superfusion 스위치. 피펫과 세포 사이 gigaseal를 만들려면, 약간 세포 기관에 대한 전극의 끝부분을 터치하고 부드럽게 전극에 부정적인 압력을 적용하는 동안 피펫 과압을 해제;
- 봉인 반면, 앰프에서 "전체 셀"모드를 선택하고 -60 MV하는 잠재력을 가지고있는 세포를 설정;
- , 전체 축삭 터미널을 포함한 이미징 소프트웨어와 관심 영역을 선택 명시야 조명을 끄고, 짧게 488 nm의 레이저로 (30 MS) 터미널을 노출하여 TIRF 영상에 맞는 초점 비행기를 찾으면;
- 피펫에 약간 부정적인 압력을 적용하는 동안 앰프의 "기력"명령을 사용하여 세포에 침투;
- 셀 커패시턴스와 직렬 저항에 대한 정정하고있는 동안 관심의 전압 프로토콜을 적용 시냅스 vesicles의 영상 움직임. 이것은 전압 프로토콜 카메라 프레임 속도에 동기가이 단계에서 중요하다. 우리의 경우, 각 프레임은 30 MS 길이, 전압 변경이 값 (즉, 모든 300 MS 또는 10 프레임)의 배수에서 발생하므로,
- 복구 수 있도록 재판을 사이에 최소한 40 초 정도 기다리십시오;
- 에서 561 nm의 레이저를 돌려 동안 시냅스 리본의 위치를 확인하려면, 사진을 찍는.
그림 1 : 실험 설정. 488 nm의 레이저 (파란색)은 목표의 뒤에 초점 비행기의 주변에 집중하고 유리 수성 매체 인터페이스에 도달하면 총 내부 반사를 앓고있다. 반사 빔에 의해 생성된 전자기장은 봇 가장 가까운 시냅스 vesicles에 로드된 형광단을 자극다음 (녹색) 형광 유리 챔버 톰. 형광등은 다음 관찰자의 눈 (묘사) 또는 CCD 카메라로 안내합니다. 몇 군데 세포의 막 잠재력은 그들을 패치 - 클램핑하여 동시 제어됩니다. 이러한 접근 방식은 수신 신호 (막 전압)와 출력의 연결 (exocytosis) 사이의 관계의 연구를 수 있습니다.
그림 2 : 일반적인 결과입니다. 왼쪽 절연 금붕어 바이폴라 세포의 명시야 이미지. 오른쪽 상단 : 바이폴라 세포 축삭 터미널에서 시냅스 vesicles의 TIRF 이미지가 1-43 FM 탑재 ® 및 488 nm의 레이저 (FM 염색)와 몇 군데. 오른쪽 하단 : 561 NM 레이저와 패치 세포 및 이미징 축삭 터미널 후 동일한 터미널 이미지. 시냅스 리본은 rhodamine 기반 RIBEYE 바인딩 펩타이드 (Rpep_rhod)에 의해 표시됩니다.
표 1 : 특정 시약 및 장비.
이름 | 유형 | 제조 업체 | 목록 | 논평 |
| - | 에어 테이블 | 뉴 포트 주식 회사 | - | - |
| IX70 | 거꾸로 현미경 | 올림푸스 | - | 명시야의 텅스텐 램프와 TIRF위한 측면 오프닝 포트가 장착된 |
| TH4 - 100 | 램프 전원 | 올림푸스 | - | - |
| FF498_581 - Di01 | 이색성 필터 | Semrock | - | - |
| NF01 - 405_488_568 | 배출 필터 | Semrock | - | - |
| APO x100 O HR | 목표 | 올림푸스 | - | NA 1.65 |
| RG630 | 레드 글래스 필터 | 쇼트 | - | - |
| - | 488 NM 레이저 | 응집 성의 | - | 최소 전력으로 사용 |
| - | 셔터 | Uniblitz | - | - |
| VMM - D1 | 셔터 드라이버 | Uniblitz | - | - |
| - | 561 NM 레이저 | Melles Griot | - | - |
| - | 셔터 | Uniblitz | - | - |
| VMM - D3 | 셔터 드라이버 | Uniblitz | - | - |
| 재관류 압력 키트 | Superfusion 시스템 | 과학 자동화 | 09-04 | - |
| 재관류 펜 | Superfusion 시스템 | 과학 자동화 | - | - |
| Valvelink 8 | Superfusion 시스템 컨트롤러 | 과학 자동화 | - | - |
| 캐스케이드 512B | EM CCD 카메라 | 로퍼 과학 | - | - |
| Metamorph 7.1 | 이미징 소프트웨어 | 분자 장치 | - | - |
| EPC - 9 | 패치 클램프 증폭기 | HEKA Elektronik | - | - |
| 펄스 | 앰프 소프트웨어 | HEKA Elektronik | - | - |
| MP - 285 | Micromanipulator | 서터 악기 | - | - |
| - | 전극 홀더 | HEKA Elektronik | - | 1.5 mm OD 유리, 2 단위 |
| 퀵 - Fil ® TW150 - 3 | Borosilicate 유리 모세관 | WPI | - | 필라멘트없이 |
| B150 - 86-10 | Borosilicate 유리 모세관 | 서터 악기 | - | 필라멘트와 함께 |
| P - 97 | Microelectrode의 풀러 | 서터 악기 | - | 3x3 상자 필라멘트, 환경 챔버가 장착된 |
| - | 압력 진공 공기 펌프 | 토마스 과학 | 7893B05 | pipettes을위한 챔버 및 압력에서 액체를 제거하기 위해 진공을 만듭니다 |
| MatLab R2008a | 분석 소프트웨어 | MathWorks | - | - |
| 353001 | 35mm 플라스틱 문화 요리 | 매 | - | - |
| - | 높은 굴절률 유리 | PlanOptik | - | 굴절률 488 NM = 1.78 |
| 시리즈 M | 높은 굴절률의 액체 | Cargille 실험실 | - | 굴절률 = 1.78 |
| Sylgard 184 | 실리콘 엘라스토머 키트 | 다우 코닝 | - | - |
| 글루타티온 | Tripeptide | EMD 화학 | 무료 radica내 청소 | |
| Hyaluronidase | 효소 | 시그마 | H6254 | 유형 V |
| L - 시스테인 | 아미노산 | Fluka | 30,090 | papain을 활성화 |
| Papain | 효소 | Fluka | 76,220 | Carica 파파야에서 |
| Trolox ® | 수용성 비타민 E | 시그마 | 56,510 | 자유 라디칼 스캐빈저 |
| ADVASEP - 7 | Sulfonated B - 사이클로 덱스트린 유도체 | 시그마 | A3723 | FM 1-43 감소 ® 배경 형광 |
| FM 1-43 ® | 형광 염료 | Invitrogen | T35356 | "특수 포장" |
| 스티키 왁스 | 피펫 코팅 에이전트 | 커 주식 회사 | - | 피펫 커패시턴스를 감소 |
표 2 :이 연구에서 사용 생리 솔루션을 제공합니다.
물질 | 낮은 칼슘 2 + 링거스 | 제어 링거스 | 하이 K + 링거스 | 내부 솔루션 |
| NaCl | 120 MM | 120 MM | 97.5 MM | - |
| KCl | 2.5 MM | 2.5 MM | 25 MM | - |
| MgCl 2 | 1 ㎜ | 1 ㎜ | 1 ㎜ | 4 MM |
| CaCl 2 | 0.5 MM | 2.5 MM | 2.5 MM | - |
| HEPES | 10 MM | 10 MM | 10 MM | 10 MM |
| EGTA | 0.75 MM | - | - | 0.5 MM |
| 포도당 | 10 MM | 10 MM | - | - |
| 글루타티온 | 2 MM | 2 MM | - | 1 ㎜ |
| CH 3 CSO 3 S * | - | - | - | 100 MM |
| TEACl | - | - | - | 10 MM |
| ATP - MG | - | - | - | 10 MM |
| GTP - 리 | - | - | - | 1 ㎜ |
| Rpep -로드 '** | - | - | - | 5 MM |
| 음량 | 200 ML | 100 ML | 5 μL | 100 μL |
* 세슘 methanesulfonate.
** RIBEYE 바인딩 펩타이드 : rhodamine + EQTVPVDLSVARDR - cooh (MW 1997.75).
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Discussion
빛이 거리와 함께 기하 급수적으로 방울 년부터 2) 목적 형 TIRF 현미경의 장점은 1) 그함으로써 빛을 - 오브 - 초점 밖으로 최소화 목적의 초점 평면 내의 좁은 지역에 여기 광을 제한함으로써 우수한 광학 sectioning을 제공한다는 점입니다 , 수직 방향으로 움직임은 형광 강도의 변화로 모니터링할 수 있으며, 높은 수치 조리개 목적 1.5을 통해 3) 효율적인 조명 컬렉션.
기술의 주요 단점은 그것이 전자 현미경의 ultrathin 섹션와 대략적으로 비슷 세포 표면, 100 & NM 내에서 일어나는 이미징 이벤트로 제한됩니다 것입니다. 따라서 이러한 이벤트의 시각화는 유리에 준수 막의 패치에 가까운 시냅스 리본의 존재와 vesicles의 성공 로딩에 단단히 유리에 준수되는 세포에 매우 다릅니다. 우리 프로토콜은 양극성 세포 시냅스 터미널 2,6 이내 vesicles의 총 수를만이 1-2%의 로딩이 가능합니다. 그 말씀을 통해 우리가 이미지 수있는 사람보다 세포의 표면에서 일어나는 많은 이벤트가있다는 것을 분명하다.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH 그랜트 어이 14990에 의해 지원되었다.
References
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
