Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Summary

In diesem Video zeigen wir, wie Label und visualisieren einzelne synaptische Vesikel Exozytose und Menschenhandel in Goldfische Netzhaut bipolaren Zellen mit insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie.

Abstract

Insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie ist eine Technik, dass die Studie die Geschehnisse an der Zellmembran ermöglicht, durch selektive Darstellung von fluoreszierenden Molekülen, die zu einem hohen Brechungsindex Substanz wie Glas am nächsten sind,

Protocol

Teil 1: Dissection und Bipolar Zellisolation

1. Bereiten Sie Lösungen in Tabelle 2 aufgeführt; Der pH-Wert von Beringer "(extern)-Lösungen sollten mit NaOH auf 7,4 eingestellt und der pH-Wert der internen Lösung sollte auf 7,2 mit CsOH eingestellt werden. Schützen interne Lösung vor Licht mit Alufolie und halten Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung;
2. Dark-Anpassung einen Goldfisch für mindestens 30 Minuten vor der Dissektion;
3. Während das Tier dunkel passt, bereiten 5 mL der Hyaluronidase (Typ V Hyaluronidase, 1100 Einheiten / ml in niedrigen Ca ^{2 +} Ringer; Sigma, St. Louis, MO) und 10 ml der L-Cystein (0,5 mg / mL in niedrigen Ca ^{2 +} Ringer-) Lösungen und wiegen das Papain (gefriergetrocknetes Pulver, 40 Einheiten / ml, Sigma, St. Louis, MO) für 5 ml der Verdauung Lösung;
4. Euthanize die Goldfische durch schnelle Enthauptung mit chirurgischer Schere und zerstören das Gehirn und das Rückenmark mit einem # 11 Skalpell;
5. Entfernen Sie die Augen durch die Zerstörung der extra-Augenmuskeln mit Hilfe eines # 7 gebogenen Pinzette Dumont und Schneiden des Sehnervs mit Iris Schere;
6. Legen Sie ein Auge Glühbirne auf einem Stück Filterpapier und Punktion der Sclerallimbus mit der Spitze eines Nr. 11 Skalpell;
7. Führen Sie die Klinge aus einem Paar von Vannas Schere innerhalb der punktierten ganzen und schneiden Sie die ganze vordere Segment entfernt;
8. Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier auf der Oberseite des restlichen Augenbecher und üben einen gewissen Druck, um das Papier mit Glaskörper einweichen;
9. Heben Sie das Filterpapier mit der Netzhaut verbunden ist und schneiden Sie den Sehnerv mit einem Nennwert von Vannas Schere;
10. Legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut in einem 35 mm Kunststoff-Kulturschale mit Hyaluronidase-Lösung und Abziehen der Netzhaut vom Filterpapier mit Hilfe von # 7 Dumont Pinzetten;
11. Cut der Netzhaut in 4-6 Stücke mit der Hälfte der industriellen Stahl einseitig geschliffene Klinge und ließ es in die Hyaluronidase-Lösung für 20 Minuten zu sitzen;
12. Während des Wartens auf Hyaluronidase in Kraft treten, 5 ml der L-Cystein-Lösung, die Papain und lassen Sie es sich, bis die Flüssigkeit transparent (ca. 5-10 Minuten);
13. Waschen Sie die Teile der Netzhaut 3x in niedrigen Ca ^{2 +} Ringer und ließ sie in der Papain-Lösung setzen sie für 30-35 Minuten;
14. Waschen Sie die Teile der Netzhaut 3x in niedrigen Ca ^{2 +} Ringer und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 ° C in einer 35 mm Kunststoff-Kulturschale mit niedrigem Ca ^{2 +} Ringer;
15. Um distanzieren die Zellen, legen Sie ein Stück der Netzhaut in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 ml niedrige Ca ^{2 +} Ringer und langsam verreiben der Netzhaut durch Pipettieren es rauf und runter mit einem Glas Dissoziation Pipette vorsichtig, keine Luftblasen zu produzieren. Dissoziation Pipetten werden durch Aufheizen der Spitze einer Glas-Pasteurpipette mit einem Bunsenbrenner und leicht verbiegen mit Hilfe der anatomischen Pinzette hergestellt;
16. Platte die isolierten Zellen durch Zugabe von einem Tropfen des retinalen Suspension auf eine hausgemachte Aufnahme Kammer zuvor mit 2 ml niedrige Ca ^{2 +} Ringer gefüllt. Die Kammer besteht aus der unteren Hälfte eines 35-mm-Kunststoff-Kulturschale mit einem kreisrunden Loch in der Mitte und einem runden Deckglas von 1,78 Brechungsindex Glas (PlanOptik, Deutschland) geklebt, um den Boden mit einem Silizium-Elastomer (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI).

Teil 2: Bipolarzelle Be-und Wash Out

TIRF Bildgebung von synaptischen Vesikeln erfolgt am besten mit Hilfe einer objektiven Typ TIRFM Mikroskop mit einer sehr hohen NA objektive und einer empfindlichen Kamera durchgeführt. Für unsere Experimente, wählen wir ein 1,65 NA Objektiv (Apo x100 O HR, NA 1,65, Olympus, Japan) mit einem EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ) zu verwenden. Die Verwendung der sehr hohen NA Ziel erfordert den Einsatz von hohem Brechungsindex Deckgläser und Immersionsflüssigkeit (di-Iodmethan mit Schwefel). Unter unseren Bedingungen ist Anregungslicht zu einer exponentiell abklingenden Feld mit einer Länge konstant von ca. 50 nm beschränkt.

1. Fügen Sie einen Tropfen Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex (M-Serie, Brechungsindex = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ), die Mikroskop-Objektiv;
2. Legen Sie die Aufnahme Kammer vorsichtig auf der Oberseite des Mikroskop-Objektivs und vorsichtig montieren Masseelektrode und Superfusion Ausfahrt Rohr Kammer;
3. Lassen Kammer Mikroskop sitzen für 10-20 Minuten, damit Zellen zu sinken und sich an der Unterseite;
4. In der Zwischenzeit bereiten 5 ml einer 1 mM Trolox ® ((±)- 6-Hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbonsäure; Sigma, St. Louis, MO)-Lösung in hoher K ⁺ Ringer- . Beschallen, bis es gelöst;
5. Bereiten Sie 15 ml ADVASEP-7 Waschlösung: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) in niedrigen Ca ^{2 +} Ringer. Beachten Sie, dass ADVASEP-7 Verwendung optional ist und kann bei Bedarf unterdrückt werden;
6. Spülen Sie die Superfusion lines und fügen ADVASEP-7 Waschlösung, niedrige Ca ^{2 +} Ringer und Ringer-Kontrolle der Superfusion System;
7. Pull loading Pipetten aus dünnwandigen Borosilikatglas (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Puffer Pipette Widerstände sind in den 1,5-2,5 MOhm-Bereich;
8. Bereiten Sie den FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) Styryl) pyridinium Dibromid ", eine spezielle Verpackung"; Invitrogen, Carlsbad, CA)-Lösungen. Stellen Sie zunächst eine 1 mM Lager von zusätzlich 160 ul destilliertem Wasser auf ein Fläschchen (100 mg) des FM1-43 ®. Diese Aktie kann bei 4 ° C aufbewahrt werden bis zu einer Woche. Anschließend 5 ul des FM1-43 ® bis 1 mL hohen K ⁺ Ringer + 1mM Trolox ®. Protect-Lösung von Licht mit Aluminiumfolie und halten Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung;
9. Schalten Sie das Mikroskop Hellfeld Licht auf und die Suche nach intakter bipolaren Zellen. Leicht tippen Sie auf das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Neuronen fest an den Boden der Kammer angebracht ist;
10. Positionieren Sie die Superfusion Stift in der Nähe der Zelle von Interesse und kontinuierlich versorgen die Vorbereitung mit niedrigen Ca ^{2 +} Ringer;
11. Schalten Sie die Raumbeleuchtung und fügen Sie einen roten langen Pass Filter (dh RG630, Schott, Deutschland), um den optischen Pfad zur Anregung des FM Farbstoff zu minimieren;
12. Füllen Sie einen Laden Pipette mit 10 ul der FM Farbstofflösung, montieren Sie die Pipette in den Mikromanipulator und senken Sie die Pipette auf die Vorbereitung ohne Überdruck, bis sie an der gleichen Bildebene als die bipolare Zelle, die Sie laden möchten, ist. Vergewissern Sie sich, mindestens zwei Elektrodenhalter: die eine für den FM-Farbstoff kann nicht für Patch-Clamp verwendet werden, oder es kann die intrazelluläre Lösung verunreinigen;
13. Position der Puffer Öffnung in einem Abstand von etwa 10 pm aus der Axonterminal, drehen Sie die Superfusion System aus und puff der Farbstoff-Lösung für 10 Sekunden durch Drehen der Pipette Überdruck auf;
14. Drehen Sie den Überdruck ab und, ohne Bewegung der Pipette, 30 Sekunden warten;
15. Schalten Sie die Superfusion auf und tauchen den Raum in ADVASEP-7-Lösung für 5 Minuten. In der Zwischenzeit, entfernen Sie den Puffer Pipette aus dem Bad;
16. Nach 5 Minuten zu niedrigen Ca ^{2 +} Ringer-Schalter und versorgen die Kammer für 25-30 Minuten, um das Entfernen von überschüssigem Farbstoff zu ermöglichen.

Teil 3: Patch-Clamp-und TIRFM Imaging

1. Während der Vorbereitung ist das Auswaschen, ziehen Patch-Pipetten aus dickwandigem Borosilikatglas (B150-86 bis 10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch-Pipette Widerstände sind in der 8-10 MOhm-Bereich;
2. Nach Auswaschen beendet ist, legen Sie das Axon-Terminal in der Mitte des Sichtfeldes;
3. Füllen Sie ein Patch-Pipette mit 7μL der internen Lösung, tippen Sie auf die Pipette, um loszuwerden, Luftblasen, Mantel der Pipette mit geschmolzenem Dentalwachs (Sticky Wax; Kerr Corporation, Orange, CA) und montieren Sie ihn in den Mikromanipulator;
4. Schalten Sie die Pipette Überdruck auf und senken Sie die Pipette langsam auf die Vorbereitung. Überprüfen Pipette Widerstand in den Verstärker und richtige Pipette Offsets und Kapazität mit dem jeweiligen Verstärker steuert;
5. Schalten Sie die Superfusion auf Ringer-Kontrolle. So erstellen Sie eine Gigaseal zwischen der Pipette und der Zelle, leicht berühren die Spitze der Elektrode gegen die Zellkörper und drehen Sie die Pipette Überdruck ab, während sanft Anlegen von Unterdruck an der Elektrode;
6. Während versiegelt, wählen Sie "ganze Zelle"-Modus in den Verstärker und setzen Sie die Zelle Haltepotential bis -60 mV;
7. Wählen Sie eine Region von Interesse, mit der Imaging-Software, die die ganze Axonterminal umfasst, schalten Sie das Hellfeld Licht aus und durch kurzes Aussetzen (30 ms) das Terminal mit dem 488 nm Laser, finden Sie den richtigen Brennebene für TIRF Bildgebung;
8. Pause in die Zelle, indem Sie die "zappen"-Befehl des Verstärkers während der Anwendung leicht negativen Druck auf die Pipette;
9. Richtig für die Zell-Kapazität und Vorwiderstand, und wenden Sie dann die Spannung Protokoll von Interesse, während die Abbildung der Bewegung von synaptischen Vesikeln. Es ist in dieser Phase wichtig, dass die Spannung Protokoll, um die Bildrate synchronisiert. In unserem Fall, jedes Bild 30 ms lang ist, so dass die Spannung Veränderungen in Vielfachen dieses Wertes (dh alle 300 ms oder 10 Frames);
10. Warten Sie mindestens 40 Sekunden zwischen den Prüfungen für die Wiederherstellung zu ermöglichen;
11. So überprüfen Sie die Position der synaptischen Bänder, fotografieren, während Sie den 561 nm Laser auf.

Abbildung 1: Der Versuchsaufbau. A 488 nm-Laser (blau) wird an die Peripherie der hinteren Brennebene des Objektivs ausgerichtet und leidet unter Totalreflexion, wenn es das Glas-wässrigen Medium-Schnittstelle erreicht. Das elektromagnetische Feld des reflektierten Strahls erzeugt regt das Fluorophor in den synaptischen Vesikeln am nächsten an der bott geladenom des Glases Kammer, die dann fluoreszieren (grün). Das Fluoreszenzlicht wird dann auf das Auge des Beobachters (siehe Bild) oder zu einer CCD-Kamera geleitet. Das Membranpotential der abgebildeten Zellen gleichzeitig von Patch-Clamp ihnen kontrolliert. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Beziehung zwischen eingehenden Signale (die Membran-Spannung) und der neuronalen Ausgang (Exozytose).

Abbildung 2: Typische Ergebnisse. Links: Hellfeldbild eines isolierten Goldfisch bipolaren Zellen. Oben rechts: TIRF Bild von den synaptischen Vesikeln in der bipolaren Zellen Axonterminal mit FM 1-43 geladen ® und abgebildet mit der 488 nm-Laser (FM Farbstoff). Unten rechts: Bild der gleichen Klemme nach dem Patchen der Zelle und die Abbildung der Axon-Terminal mit dem 561 nm-Laser. Synaptic Bänder werden durch die Rhodamin-basierte RIBEYE-bindende Peptid (Rpep_rhod) gekennzeichnet.

Tabelle 1: Spezifische Reagenzien und Geräte.

Name	Typ	Hersteller	Katalog	Kommentar
-	Air Table	Newport Corporation	-	-
IX70	Inverses Mikroskop	Olymp	-	Ausgestattet mit einer Wolfram-Lampe für Hellfeld und eine seitliche Öffnung Port für TIRF
TH4-100	Lamp Power Source	Olymp	-	-
FF498_581-DI01	Dichroitische Filter	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	Emission Filter	Semrock	-	-
Apo x100 O HR	Ziel	Olymp	-	NA 1,65
RG630	Red Glass Filter	Schott	-	-
-	488 nm Laser	Kohärent	-	Verwenden Sie bei minimalem Stromverbrauch
-	Verschluss	Uniblitz	-	-
VMM-D1	Shutter-Treiber	Uniblitz	-	-
-	561 nm Laser	Melles Griot	-	-
-	Verschluss	Uniblitz	-	-
VMM-D3	Shutter-Treiber	Uniblitz	-	-
Perfusion Pressure Kit	Superfusion-System	Automatisieren Scientific	09-04	-
Perfusion Pen	Superfusion-System	Automatisieren Scientific	-	-
ValveLink 8	Superfusion System Controller	Automatisieren Scientific	-	-
Cascade 512B	EM-CCD-Kamera	Roper Scientific	-	-
Metamorph 7,1	Imaging Software	Molecular Devices	-	-
EPC-9	Patch-Clamp-Verstärker	HEKA Elektronik	-	-
Puls	Verstärker Software	HEKA Elektronik	-	-
MP-285	Mikromanipulator	Sutter Instrument	-	-
-	Elektrodenhalter	HEKA Elektronik	-	Für 1,5 mm OD Glas, 2 Stück
Kwik-Fil ® TW150-3	Borosilikat Capillary Glass	WPI	-	Ohne Faden
B150-86 bis 10	Borosilikat Capillary Glass	Sutter Instrument	-	Mit Filament
P-97	Mikroelektroden-Puller	Sutter Instrument	-	Ausgestattet mit 3x3 Kästchen Filament-und Klimakammer
-	Pressure Vacuum Air Pump	Thomas Scientific	7893B05	Erstellt Vakuum, Flüssigkeiten von Kammer-und Überdruck für Pipetten entfernen
MatLab R2008a	Analyse-Software	MathWorks	-	-
353001	35 mm Kunststoff-Petrischalen	Falke	-	-
-	High Refractive Index Glass	PlanOptik	-	Brechungsindex 488 nm = 1,78
Serie M	High Refractive Index Flüssigkeit	Cargille Labs	-	Brechungsindex = 1,78
Sylgard 184	Silicon-Elastomer-Kit	Dow Corning	-	-
Glutathion	Tripeptide	EMD Chemicals		Kostenlose radical scavenger
Hyaluronidase	Enzym	Sigma	H6254	Typ V
L-Cystein	Aminosäure	Fluka	30090	Aktiviert Papain
Papain	Enzym	Fluka	76220	Von Carica papaya
Trolox ®	Vitamin E	Sigma	56510	Radikalfänger
ADVASEP-7	Sulfoniertes B-Cyclodextrin-Derivat	Sigma	A3723	Reduziert FM 1-43 ® Hintergrundfluoreszenz
FM 1-43 ®	Fluoreszenzfarbstoff	Invitrogen	T35356	"Special Packaging"
Sticky Wax	Pipette Beschichtungsmittel	Kerr Corporation	-	Verringert Pipette Kapazität

Tabelle 2: Physiologische Lösungen in dieser Studie verwendet.

Substanz	Low Ca 2 + Ringer-	Control-Ringer-	Hohe K + Ringer-	Interne Lösung
NaCl	120 mM	120 mM	97,5 mm	-
KCl	2,5 mM	2,5 mM	25 mM	-
MgCl 2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mM
CaCl 2	0,5 mM	2,5 mM	2,5 mM	-
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0,75 mM	-	-	0,5 mM
Glucose	10 mM	10 mM	-	-
Glutathion	2 mM	2 mM	-	1 mM
CH 3 CsO 3 S *	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-rhod **	-	-	-	5 mM
Volumen	200 mL	100 mL	5 ul	100 ul

* Cäsium Methansulfonat.
** RIBEYE-bindende Peptid: Rhodamin + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

Discussion

Die Vorteile der Ziel-Typ TIRF-Mikroskopie werden, dass 1) es hervorragende optische Schnitte bietet durch die Beschränkung Anregungslicht auf einen schmalen Bereich in der Brennebene des Objektivs und minimiert dadurch out-of-focus Licht, 2), da Licht fällt exponentiell mit der Entfernung kann eine Bewegung in vertikaler Richtung als eine Änderung in der Fluoreszenz-Intensität überwacht werden; 3) effiziente Lichtausbeute durch die hohe numerische Apertur Ziel ^1,5.

Der größte Nachteil dieser Technik ist, dass es zu bildgebenden Ereignisse geschieht innerhalb von 100 nm und der Zelloberfläche, was in etwa einer ultradünnen Abschnitt in der Elektronenmikroskopie ist begrenzt. Daher hängt Visualisierung dieser Ereignisse kritisch auf die Zellen, die fest mit dem Glas und Anregungen haben, auf das Vorhandensein von synaptischen Bänder in der Nähe der Patch von Membran haftete an der Glas-und auf dem erfolgreichen Laden von Vesikeln. Unser Protokoll ermöglicht das Laden von nur 1-2% der Gesamtzahl der Vesikel innerhalb der bipolaren Zellen synaptischen Terminals ^2,6. Mit dieser sagte, ist es klar, dass es viel mehr Ereignissen an der Zelloberfläche, als wir in der Lage sind zu Bild.