Biology

خلية إعداد كتلة من العينة مع غلبة علم الخلايا من خلايا منفردة غيوم

Published: July 21, 2009 doi: 10.3791/1316

¹Department of Pathology, University of Wisconsin - Milwaukee

Summary

Shidham في طريقة لإعداد كتل الخلية مع AV - علامة من عينات الخلايا التي تحتوي على خلايا متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة.

Abstract

هذا الفيديو يوضح طريقة Shidham لإعداد كتل خلية من خلايا السائل على العينات التي تحتوي على الخلايا العنقية متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة. هذا الأسلوب يستخدم HistoGel (الحرارية العلمية) مع المعدات المختبرية التقليدية.

استخدام أبواب الزنزانات هو أداة قيمة المساعدة لتقييم الجهاز التناسلي للمرأة غير علم الخلايا. أنها تمكن اختصاصي الباثولوجيا الخلوية لدراسة تفاصيل إضافية عينة المورفولوجي بما في ذلك بنية الآفة. الأهم من ذلك ، فهي تسمح لتقييم دراسات ثانوية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية ، واختبارات التهجين في الموضع (FISH / CISH) في الموقع وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وقد تم معظمها التقنيات التقليدية لإعداد كتلة الخلية المطبقة على عينات الخلايا غير الجهاز التناسلي للمرأة ، وعادة لالانصبابات السوائل في الجسم والغرامة الخزعات إبرة الطموح.

عينات السائل العنقية القائمة على أقل نسبيا من نظرائهم الخلوية غير الجهاز التناسلي للمرأة مع العديد من الخلايا الفردية المتناثرة. وبسبب هذا ، الخلوية كافية داخل زنزانة المقاطع من الصعب تحقيقه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للكتلة histotechnologist sectioning لا تصور المستوى الذي كانت الخلايا في أعلى تركيز. وبالتالي ، فمن الصعب رصد المستوى المناسب الذي يمكن اختيار المقاطع التي ستنقل إلى الشرائح الزجاجية للاختبار. ونتيجة لذلك ، قد يكون غاب عن المنطقة من كتلة الخلايا مع الخلايا في المصالح ، سواء في الماضي أو عن طريق قطع لا قطع عميقة بما فيه الكفاية. البروتوكول الحالي لأسلوب Shidham عناوين هذه المسائل. على الرغم من هذا البروتوكول هو موحد وذكرت لعينات السائل الجهاز التناسلي للمرأة على الخلايا ، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على غير الجهاز التناسلي للمرأة عينات السوائل مثل الانصباب ، جبعة ، brushings ، الخ محتويات الكيس من أجل تحسين نوعية المواد التشخيصية في أقسام كتلة الخلية.

Protocol

مقدمة :

هذا هو شريط فيديو يصف طريقة لإعداد Shidham كتلة خلية من السائل على عينة (LBC) باستخدام الخلايا HistoGelTM (الحرارية العلمية) (HG). بالمقارنة مع النهج العشوائي الأخرى ، وفيما يلي ملامح اثنين حرجة من هذا البروتوكول لإعداد كتل الخلايا من عينات نسبيا قليل الخلايا مع الخلايا فضفاضة منفردة متناثرة (1-5).

هذا البروتوكول يتضمن خطوات لتركيز الخلايا على طول الطائرة موازية لسطح القطع من كتلة الخلية.
ويشمل أيضا إدراج مثل منارة المظلم من AV - علامة (1B الشكل) ، والتي تخدم اثنين من الأغراض التالية :
1. لتصور المستوى الذي تتركز الخلايا. المنطقة من كتلة الخلايا مع الخلايا التي تهم يمكن الآن تصور من قبل histotechnologist عندما يتعرض منارة داكنة اللون خلال القطع. هذا من شأنه أن يمنع القدرة على رصد واحد من عدة قطاعات من خلال المستوى مع معظم الخلايا ، أو عدم قطع سطحية جدا في المستوى مع أعلى تركيز من الخلايا العينة.
2. لتكون بمثابة نقطة مرجعية محدد في المسلسل المقطع كتلة الخلية على شرائح مختلفة. هذه النقطة المرجعية بمثابة منارة للمساعدة في تحديد الخلايا أو مجموعات معينة من الخلايا لتقييم نمط تفاعلية مناعية تنسيق مع النهج SCIP (6،7).

بروتوكول (الشكل 2)

إعداد العينة.

نقل بقايا خلايا عنق الرحم LBC العينة إلى أنبوب أسفل الزجاج المسطح (15mm X 45mm قطرها) (الشكل 2.1 من خلال 2.4). وضع أنبوب زجاجي في أنبوب من البلاستيك أكبر الناقل (28 × 85mm و) والطرد المركزي. إزالة أنبوب أسفل الزجاج من الانبوب الناقل وتخلصي من طاف.
ومن ثم توج أنبوب زجاجي (لمنع تسرب المياه من التدفئة في الخطوة التالية) ووضعها مرة أخرى داخل أكبر أنبوب من البلاستيك مسطحة القاع الناقل
وتوج ثم الأنبوب الناقل البلاستيك يحتوي على أنبوب زجاجي ، وضعت في جهاز للطرد المركزي (مع أكواب الدوران وليس أكواب زاوية ثابتة بحيث تقع الخلايا عموديا إلى أسفل شقة من أنبوب زجاجي) ، ونسج في 1805 G (3000 RPMS ، الدوار قطرها - 17cm) لمدة خمس دقائق (الشكل 2.5).
ثم تتم إزالة الأنابيب عموديا من أجهزة الطرد المركزي ويتم إزالة أنبوب أصغر الزجاج مع ملقط من الأنبوب الناقل أكبر من البلاستيك من دون إزعاج بيليه الرسوبية مع الخلايا.
هو لم يسبق لهم اللعب في أنبوب زجاجي مع العينة ويتم صب قبالة طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة من الخلايا المسطحة الرواسب في قاع (الشكل 2.6).

إدراج مرجع تنسيق AV - علامة وبالإضافة إلى ذلك من هلام

يضاف منارة الظلام AV - علامة (حوالي 2 مم X مم 2 ، شقة على السطح ، جزء من الظلام المواد الملونة sectionable) (الشكل 3) ومعلما للأنبوب زجاجي (الشكل 2.7).
تسييل an قسامة من قبل نيافة ذوبان في الميكروويف لمدة 10 ثانية في السلطة المتوسط.
إضافة 0.5 مل من نيافة المنصهر الى هذا المزيج ، وأنبوب مع الرواسب بسرعة ، وخلاصة ذلك الشكل (2.8) (انتقل إلى الخطوة التالية بسرعة دون السماح للبدء في ترسيخ HG).
إضافة حوالي 2.5 مل من الحارة (45 درجة مئوية) إلى الناقل للمياه أنابيب بلاستيكية (الشكل 2.9).
يوضع أصغر أنبوب زجاجي توج داخل أنبوب من البلاستيك مع المياه الدافئة. (هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على HG من خلال ترسيخ الخطوات القادمة) (الشكل 2.9).
يتم وضع أنبوب بلاستيكي الناقل في جهاز الطرد المركزي (مع أكواب الدوران وليس أكواب زاوية ثابتة بحيث تقع الخلايا عموديا إلى أسفل شقة من أنبوب زجاجي) ، ونسج في 1805 G (3000 RPMS ، نصف قطرها 17cm - الدوار) لمدة خمس دقائق. الغرض من هذه الخطوة هو الطرد المركزي لدفع علامة AV - والتركيز على الخلايا في طبقة أقرب إلى سطح القطع من كتلة الخلية النهائية جزءا لا يتجزأ من البارافين (1D الشكل).
ثم تتم إزالة أنابيب بلطف وعموديا من أجهزة الطرد المركزي مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة رقيقة الرسوبية مع عينة الخلايا في الجزء السفلي.
هو لم يسبق لهم اللعب لأكبر أنبوب من البلاستيك ويتم إزالة أنبوب زجاجي عموديا أصغر بواسطة الملقط دون إزعاج طبقة الرواسب من خلايا العينة.
أنبوب زجاجي صغير المبردة في وضع رأسي لمدة 15 دقائق حتى يبرد ويصلب HG (الشكل 2.11).

إزالة كتلة الخلية كزر من هلام مع عينة للتجهيز النهائي

وطردت القرص HG طدت ، مع طبقة من تتركز / الرواسب في قاع العينة من أنبوب أسفل الزجاج المسطح من خلال دفق الفورمالين 10 ٪ من خلال إبرة قياس 23 مع المحقنة (الشكل 2.12).
يتم إدخال الإبرة على طول الجانب من الأنبوب في محيط القرص HG طدت مع العينة (الشكل 2.12).
وneedlيتم استدارة ه على طول الجانب من الأنبوب في حين يتم دفع ببطء الفورمالين من خلال حقنة. هذه النتائج في فصل الزر HG مع منارة قاتم اللون وعلامة AV - العينة تتركز في أنه من القاع المسطح من أنبوب زجاجي الشكل (2.12).
ثم يتم وضع كتلة الخلية (زر هلام مع الخلايا عينة) في كاسيت وصفت وقدمت لمعالجة الأنسجة لإعداد كتل البارافين الخلية المدمجة (الشكل 2.13).

دمج وقطع العينة

تم تضمين القرص في البارافين مع الجانب المظلم منارة علامة على النحو سطح القطع (الشكل 1).
كتلة غير مقطوع حتى علامة داكنة اللون ، كما يتعرض AV منارة واضحة للعيان.
يتم قطع المقاطع ميكرون ثلاث إلى أربع من هذا المستوى الذي يجب أن يحتوي على أكثر من خلايا منفردة متناثرة من العينة.
يتم جمع المقاطع على الشريحة الزجاجية لمزيد من تلطيخ ، وتلطيخ المناعى ، أو غيرها من التجارب على النحو المبين. قد بروتوكولات لهذه التجارب بما في ذلك نوع من الشرائح لاستخدامها في تركيب أبواب تختلف. عموما لimmunostaining ، تستخدم الشرائح المغلفة لمنع العائمة وفقدان أجزاء من الشرائح خلال الخطوات immunostaining.

المختصرات المستخدمة (بالترتيب الأبجدي) : CISH ، مولد اللون اختبارات التهجين في الموقع ، والأسماك ، نيون اختبارات التهجين في الموضع ؛ FFPE ، الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البرافين ، فارس ، ودفع غرامة إبرة الطموح ؛ HG ، HistoGel ™ (الحرارية العلمية) ؛ LBC ، تقوم الخلايا السائلة ؛ تفاعل البلمرة المتسلسل PCR ؛

الشكل 1. هيكل كتلة الخلية التي أعدتها لبروتوكول Shidham.

الشكل 2. موجز من الخطوات المختلفة لإعداد كتلة الخلية من العينة LBC بواسطة بروتوكول Shidham ل.

الشكل 3. إعداد AV - علامة من قشور الموز.

الشكل 4. مقارنة بين الزنازين ، والمقاطع مع وبدون AV - علامة.

الشكل 5. مقارنة الخلوية من أبواب الزنزانات مع وبدون AV - علامة.

Discussion

كتل الخلية هي أداة قيمة لتقييم عينات من الخلايا المختلفة (1). الأهم من ذلك ، بالإضافة إلى التفاصيل المعمارية للعينة ، وكتل الخلية تسمح لتقييم دراسات ثانوية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية ، فلوري / مولد اللون اختبارات التهجين في الموضع (FISH / CISH) وPCR في الموقع. ووصف مجموعة متنوعة من الأساليب لإعداد كتلة الخلية. ومع ذلك ، فإن معظم هذه هي مناسبة لعينات الخلايا غير الجهاز التناسلي للمرأة والتي تحتوي على العديد من الخلايا نسبيا وmicrofragments مع الأنسجة مثل aspirates FNA وبعض السوائل المصلية مثل الانصبابات (1،3،4،5).

لأن كتل الخلايا في المقام الأول توفير الفرصة لتقييم immunocytochemical ، ينبغي تجهيزها يفضل أن يكون مشابهة لتلك الأنسجة الفورمالين الثابتة (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البرافين. في النهاية تتم مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بعد تقييم immunocytochemical من أبواب الزنزانات لذوي الكتابات المنشورة في الغالب على أداء الفروع FFPE الأنسجة. أي تعديلات في البروتوكول تسوية محتملة ، وتبطل صحة النتائج التي تم الحصول عليها على معالجتها من خلال كتل الخلية مثبتات مختلفة وتسلسل كاشف أخرى من تلك المستخدمة لFFPE الروتينية. قد تكون بعض التقنيات التجارية لديها عيب في معالجة عن طريق بروتوكول التعرض لتثبيتي التعرض كاشف الأخرى.

أساليب مختلفة لإعداد كتلة الخلية متاحة للعينات مع كمية كبيرة من الرواسب وشظايا الأنسجة. أساسا ، ودعمت من قبل بعض الرواسب يتركز جل أو مبدأ التخثر. مضمن ثم الزر المناورة في مثل البارافين بعد تجهيز العينات الأمراض الجراحية / الخزعات.

وتشمل المواد الهلامية المستخدمة الجيلاتين ، أجار ، الفيبرينوجين / ثرومبين البلازما ، والمواد الهلامية التجارية الأخرى مثل الزئبق. أساليب تختلف من تركيز التكوير بسيطة من الرواسب بواسطة الطرد المركزي للتركيز على طول خلايا أنواع مختلفة من الأغشية. ومن الأمثلة على ذلك : Milipore ، collodin (سيلويدين) أكياس أو كشط الخلايا من الخلايا مسحات على شرائح زجاجية (1). قمنا بتقييم أيضا مجموعة متنوعة من المواد الهلامية التي تحاول مجموعات مختلفة من أجار والجيلاتين. تحقيق أي من المجموعات والاتساق الشركة بما فيه الكفاية للحصول على القرص المناورة بسهولة من هلام طدت مع الخلايا المدمجة من العينة في قطعة واحدة. وأظهرت HG المناسبة والتناسق في تجربتنا نتائج immunostaining HG على أبواب الزنزانات كانت ممتازة.

تقوم خلايا السائل (LBC) لعينات الخلايا العنقية عادة ما تكون أقل الخلوية من غير الجهاز التناسلي للمرأة العينات على النحو المذكور أعلاه. إضافة إلى ذلك ، LBC العينات تحتوي على الجهاز التناسلي للمرأة في الغالب فردية متناثرة تقشر الخلايا السطحية من الغشاء المخاطي العنقية. نتيجة لهذا ، قد لا الخلوية المناسبة داخل أقسام كتلة الخلية يمكن تحقيقه دون اتباع نهج خاص. وهذه منتشرة منفردة المكونات الخلوية في كتلة لا يمكن أن ينظر إليه من قبل histotechnologist خلال قطع الفرع ، لا يمكن أن المستوى الذي تبدأ الخلايا التي تظهر في المقاطع موضع تقدير ، وربما غاب عن أن يكون ، إما عن طريق خفض الماضية على المستوى مع معظم الخلايا أو لا قطع عميقة بما فيه الكفاية في المستوى مع أعلى تركيز من الخلايا العينة (الشكل 4). بروتوكول Shidham عناوين كل من هذه القضايا به نيافة تضمين أجهزة المختبرات والمتوسطة والتقليدية (2) (الشكل 2).

هذا البروتوكول يتضمن الملامح الرئيسية التالية اثنين (الشكل 1) :

التركيز والمواءمة بين خلايا منفردة متناثرة في الطائرة الضيقة المجاورة وموازية لسطح القطع من كتلة الخلية (الشكل 5).
إدراج مثل منارة الظلام AV - علامة ومعلما. هذا أمر بالغ الأهمية لتحقيق الميزات التالية :
1. تحديد ورصد المستوى الذي تتركز الخلايا في زنزانة ، والتعرض للصوة وقاتم اللون يسلط الضوء على المستوى الذي يتوقع معظم خلايا منفردة متناثرة في كتلة الخلية لتكون موجودة (الشكل 4). وهذا ما يمنع وovercutting (قطع الماضية على المستوى مع معظم الخلايا) أو تضعف (وليس قطع عميق بما فيه الكفاية في المستوى مع أعلى تركيز عينة من الخلايا) في لكتلة الخلايا وتسمح اختيار المقاطع من مستوى في زنزانة مقابلة مع أعلى تركيز من الخلايا.
2. وصوة داكنة اللون في الفروع أيضا بمثابة نقطة مرجعية لدراسة وتحديد بالضبط نفس الخلايا في أقسام مختلفة من المسلسل كتلة الخلية على الشرائح المختلفة (الشكل 4). هذا أمر بالغ الأهمية ، بينما تفسير وتقييم خصائص تنسيق immunoprofile هذه الخلايا سيما عن طريق نهج SCIP اتباع نفس الخلايا في أقسام مختلفة (6،7).

على الرغم من أووص البروتوكول الموحد والإبلاغ عن العينات السائلة على خلايا عنق الرحم ، ويمكن أيضا استخدامه لتعزيز الغلة تشخيص العديد من العينات غير الجهاز التناسلي للمرأة الأخرى مثل انصباب السوائل ، جبعة ، brushings ، الخ محتويات الكيس وبالإضافة إلى ذلك علامة AV تسهل تحسين تطبيق نهج SCIP خلال التقييم المناعى من أبواب الزنزانات من هذه العينات. ويمكن الاستعاضة عن تضمين المتوسطة بواسطة كواشف أخرى مع بعض التعديلات المناسبة على الخطوات ذات الصلة. يمكن استبدال HG بواسطة البلازما (الفبرينوجين) أن تبلور بواسطة ثرومبين في درجة حرارة الغرفة (1).

Acknowledgments

المؤلفان بالشكر كريس شارتراند ، HT (ASCP) ليدل على المقطع قطع من كتلة الخلية مع علامة AV.

References

Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.
Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).
Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens. Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).
Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy. CytoJournal. 5, 3-3 (2008).
Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study. Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).
Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).
Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).