Cell Block Beredning av Cytologi Prov med en övervikt av individuellt Spridda celler

Summary

Shidham metod för beredning av cell block med AV-markör från cytologi prover innehållande individuellt utspridda celler och små grupper cell.

Abstract

Denna video visar Shidham metod för beredning av cell block från flytande baserat livmoderhals och cytologi prover innehållande individuellt utspridda celler och små grupper cell. Denna teknik använder HistoGel (Thermo Scientific) med konventionell laboratorieutrustning.

Användningen av avsnitten Cell Block är ett värdefullt kompletterande verktyg för utvärdering av icke-gynekologisk cytologi. De gör det möjligt cytopathologist att studera ytterligare morfologiska exemplar detalj inklusive arkitektur lesionen. Viktigast av allt, gör de för utvärdering av kompletterande studier som immuncytokemi, in situ hybridisering tester (FISH / CISH) och in situ polymeraskedjereaktion (PCR). Traditionella Cell Block förberedelse tekniker har främst använts till icke-gynekologisk cytologi prover, typiskt för utgjutningar kroppsvätska och fin nål biopsier aspiration.

Flytande baserade livmoderhals och prover är relativt sett mindre cellulär än deras icke-gynekologisk motparter med många individuella utspridda celler. På grund av detta är adekvat cellularitet i cellen blocket avsnitten svårt att uppnå. Dessutom kan histotechnologist sektionering blocket visualisera inte på vilken nivå cellerna med den högsta koncentrationen. Därför är det svårt att övervaka en lämplig nivå där sektioner kan väljas att överföras till glaset bilderna för testning. Som ett resultat kan den del av cellen block med celler av intresse missas, antingen genom att skära tidigare eller inte skära tillräckligt djupt. Aktuella protokoll för Shidham metod behandlar dessa frågor. Även om detta protokoll är standardiserat och rapporteras för gynekologisk flytande cytologi exemplar, den kan också tillämpas på icke-gynekologiska prover som utgjutning vätskor, FNA, borstningar, innehåll cysta etc för förbättrad kvalitet i diagnostiskt material i avsnitt cell block.

Protocol

Inledning:

Detta är en video som beskriver Shidham metod för Cell Block preparation från flytande cytologi (LBC) prov med HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Jämfört med andra slumpmässiga metoder, följande är de två kritiska funktioner i detta protokoll för att förbereda cell kvarter från relativt hypocellular prover med enstaka spridda lösa celler (1-5).

1. Det här protokollet handlar om åtgärder för att koncentrera cellerna längs planet parallellt med den skärande cellytan blocket.
2. Den innehåller också en fyr-liknande mörka införande av AV-markör (Figur 1b), som tjänar två av följande syften:
   1. Att visualisera den nivå där cellerna är koncentrerade. Det område av cell block med celler av intresse nu kan visualiseras genom histotechnologist när mörka fyren utsätts under bearbetning. Denna förmåga att övervaka skulle hindra en från att skära genom den nivå med de flesta av cellerna, eller inte skära alltför ytligt i nivå med högsta koncentrationen av provkuvetterna.
   2. Att fungera som en locator referenspunkt i serieproduktion Cell Block avsnitt om olika sidor. Denna referenspunkt fungerar som en ledstjärna att hitta vissa celler eller grupper av celler för utvärdering av ett koordinatsystem immunreaktivitet mönster med SCIP metod (6,7).

PROTOKOLL (Figur 2)

Beredning av provet.

1. Överför kvarvarande LBC cervixcytologi prov på en platt botten glasrör (15mm diameter x 45mm) (Figur 2,1 via 2,4). Placera glasröret i ett större plast bärare rör (28 x 85mm) och centrifugera. Ta bort röret glasbotten från lastplanet rör och häll bort supernatanten.
2. Glasröret är då maximerad (för att förhindra spill av uppvärmning av vatten i nästa steg) och placeras tillbaka i en större plan botten bärare plaströr
3. Transportören plaströr som innehåller glasröret är då tak, placeras i en centrifug (med svängbar koppar och inte fasta koppar vinkel så att cellerna faller vinkelrätt mot den plana botten av glasrör), och snurrade på 1805 G (3000 RPM, Rotorn radie-17cm) i fem minuter (Figur 2,5).
4. Rören är då bort vertikalt från centrifugen och de mindre glasrör tas bort med pincett från de större bärare plaströret utan att störa den sedimenterade pellets med celler.
5. Den glasrör med provet uncapped och supernatanten hälls bort noggrann med att inte störa den plana lager av sediment cellerna i botten (Figur 2,6).

Tillägg av hänvisning samordnar AV-markör och tillägg av gel

1. En mörk ledstjärna AV-markör (ca 2 mm x 2 mm storlek, dök platt, fragment av mörk, sectionable material) (Figur 3) läggs till som en vägvisare till glasröret (figur 2,7).
2. Liquefy en alikvot av HG genom att smälta den i mikrovågsugnen i 10 sekunder vid medelhög effekt.
3. Tillsätt 0,5 ml av smält HG till röret, blanda med sediment snabbt, och sammanfatta det (figur 2.8) (Fortsätt till nästa steg snabbt utan låta HG att börja stelnar).
4. Tillsätt ca 2,5 ml varmt (45 ° C) vatten till transportören plaströr (figur 2,9).
5. De mindre tak glasrör är placerad inuti plaströr med varmt vatten. (Detta steg är nödvändigt för att hålla HG från stelnar under nästa steg) (Figur 2,9).
6. Transportören plaströr placeras i centrifug (med svängbar koppar och inte fasta koppar vinkel så att cellerna faller vinkelrätt mot den plana botten av glasrör), och snurrade på 1805 G (3000 RPM, rotor radius-17cm) för fem minuter. Syftet med denna centrifugering steg är att trycka på AV-markör och att koncentrera celler i ett lager närmare den skärande ytan av den slutliga inbäddade paraffin Cell Block (figur 1d).
7. Rören är då bort försiktigt och vertikalt från centrifugen noga med att inte störa den sedimenterade tunt lager med provkuvetterna längst ner.
8. Den större plaströret är icke-begränsade och de mindre glasrör tas bort vertikalt med en tång utan att störa sedimentlager av prov celler.
9. Den lilla glasröret är kylda i vertikalt läge i 15 minuter för att svalna och stelna HG (Figur 2.11).

Borttagning av cellen blocket som en knapp gel med prov för slutlig bearbetning

1. Den stelnade HG disken, med lager av koncentrerat / sediment exemplar i botten är lossnat från den platta botten glasröret genom att spruta 10% formalin genom en 23 gauge nål med sprutan (Figur 2.12).
2. Nålen sätts längs sidan av röret i utkanten av stelnat HG skiva med prov (Figur 2.12).
3. Den needle roteras längs sidan av röret medan formalin sakta drivit igenom sprutan. Detta resulterar i separation av HG knappen tillsammans med mörk ledstjärna AV-markör och den koncentrerade förlagan i det från den plana botten av glasrör (figur 2.12).
4. Cellen blocket (gel knappen med provet celler) placeras sedan i en märkt kassett och lämnas in för vävnadsbehandling att förbereda paraffininbäddad cell block (Figur 2.13).

Inbäddning och kapning av provet

1. Disken är inbäddad i paraffin med den mörka fyren markör nedåt som att skära ytan (figur 1).
2. Blocket är uppställd tills mörk AV-markör som en ledstjärna är utsatt och tydligt.
3. Tre till fyra mikron delar skärs ut från denna nivå, som bör innehålla de flesta av de spridda enstaka celler från provet.
4. Sektionerna samlas på glaset bilden för ytterligare färgning, immunhistokemisk färgning eller andra tester som anges. Protokollen för dessa tester, inklusive vilken typ av bilder som ska användas för montering av delarna kan variera. Generellt för immunfärgning, är belagda bilderna används för att förhindra flytande och förlust av sektioner från bilderna under immunfärgning steg.

Förkortningar som används (i bokstavsordning): CISH, kromogen in situ hybridisering tester, FISK, Fluorescent in situ hybridisering tester, FFPE, formalinfixerade paraffininbäddade, FNA, fin nål aspiration, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, flytande cytologi, PCR Polymerase chain reaction;

Figur 1. Struktur Cell Block utarbetats av Shidham s protokoll.

Figur 2. Sammanställning av olika stegen för att förbereda Cell Block från LBC prov genom Shidham s protokoll.

Figur 3. Förberedelse av AV-markör från bananskal.

Figur 4. Jämförelse av cell block och sektioner med och utan AV-markör.

Figur 5. Jämförelse av cellularitet av delar av cell block med och utan AV-markör.

Discussion

Cell block är ett värdefullt verktyg för utvärdering av olika cytologi prover (1). Viktigast av allt, förutom den arkitektoniska detaljer i provet, cell block möjliggöra utvärdering av kompletterande studier som immuncytokemi, lysrör / kromogen in situ hybridisering tester (FISH / CISH) och in situ PCR. En rad olika metoder för beredning av Cell Block beskrivs. De flesta av dessa är lämplig för icke-gynekologisk cytologi prover som innehåller relativt många celler och vävnader microfragments såsom i FNA aspirat och några serös vätska som vätska (1,3,4,5).

Eftersom cell block i första hand att ge möjlighet till immuncytokemiska utvärdering bör deras behandling ska helst vara liknande den i formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnader. Ytterst resultat som uppnåtts efter immuncytokemiska utvärdering av avsnitten Cell Block är jämfört med de med publicerad litteratur som utförs främst på FFPE vävnadssnitt. Eventuella ändringar i protokollet kompromiss potentiellt och upphäver giltigheten av de resultat som erhållits på cell block bearbetas genom olika fixativ och sekvenser reagens än den som används för rutinmässig FFPE. Vissa kommersiella tekniker kan ha nackdelen att behandlingen genom ett protokoll av exponering för andra fixativ-reagens exponering.

Olika metoder för Cell Block förberedelser finns för prover med en betydande mängd av sediment och fragment vävnad. Huvudsakligen är de koncentrerade sedimentet med stöd av några gel eller koagulation princip. Den lättmanövrerade knappen är då inbäddad i paraffin efter bearbetning som kirurgisk patologi ark / biopsier.

Den använda geler innehåller gelatin, agar, fibrinogen / plasma-trombin, och andra kommersiella geler som HG. Metoderna koncentration varierar från enkla pelletering av sediment genom centrifugering till en koncentration av celler längs olika typer av membran. Exempel: Milipore, collodin (Celloidin) påsar eller skrapa celler från cytologi utstryk på objektglas (1). Vi utvärderade också en mängd gel genom att testa olika kombinationer av agar och gelatin. Ingen av de kombinationer som uppnått en tillräckligt fast konsistens att få en lätt lättmanövrerad skiva av stelnad gel med inbyggda celler från provet i ett stycke. HG visade lämplig konsistens och i vår uppleva immunfärgning resultaten på HG sektioner Cell Block har varit utmärkta.

Flytande cytologi (LBC) prover för livmoderhals och cytologi är i allmänhet mindre cellulär än icke-gynekologiska prover som nämnts ovan. Dessutom gynekologisk LBC proverna innehåller främst individuella utspridda exfolierad ytliga celler från livmoderhals och slemhinnor. På grund av detta kan lämpliga cellularitet inom sektionerna Cell Block inte uppnås utan en speciell strategi. Eftersom dessa enstaka spridda cellulära komponenter i blocket inte kan ses av histotechnologist under avsnittet kapning, kan den nivå där de celler börja visas i de avsnitt som inte uppskattas och kan missas, antingen genom att skära förbi nivå med de flesta celler eller inte skära tillräckligt djupt in i nivå med högsta koncentration av prov celler (Figur 4). Shidham s protokoll behandlar båda dessa frågor med hjälp av Hg som bädda medium och konventionell laboratorieutrustning (2) (Figur 2).

Detta protokoll omfattar följande två viktiga funktioner (Figur 1):

1. Koncentration och anpassning av enstaka spridda celler i ett trångt plan intill och parallellt med den skärande cellytan block (Figur 5).
2. Införande av en fyr-liknande mörk AV-markör som en vägvisare. Detta är avgörande för att nå följande funktioner:
   1. Kartlägga och övervaka den nivå där cellerna är koncentrerade i cellens blocket. Exponeringen av mörka skylten visar den nivå som de flesta av de spridda enstaka celler i Cell Block förväntas vara belägen (Figur 4). Detta förhindrar den överkapning (skär förbi nivå med de flesta celler) eller prisunderskridande (inte skära tillräckligt djupt in i nivå med högsta koncentrationen av provkuvetterna) in till cellen blockera och tillåta val av sektioner från nivån i cellen blocket motsvarar högsta koncentration av celler.
   2. Den mörka skylt i avsnitten fungerar också som en referenspunkt för att kartlägga och identifiera exakt samma celler i olika seriella delar av cellen block på olika bilder (Figur 4). Detta är viktigt vid tolkning och utvärdering samordna egenskaper såsom immunoprofile särskilda celler som SCIP tillvägagångssätt att följa samma celler i olika sektioner (6,7).

Även ouR-protokollet är standardiserat och rapporteras för flytande cervixcytologi exemplar, den kan också användas för att förbättra diagnostiska utbytet av många andra icke-gynekologiska prover som utgjutning vätskor, FNA, borstningar, innehåll cysta etc. Dessutom AV markör skulle underlätta bättre Tillämpningen av SCIP strategi under immunhistokemisk utvärdering av Cell Block delar av dessa specimen. Den bädda mediet kan ersättas av andra reagenser med lämpliga ändringar i relevant steg. HG kan ersättas med plasma (fibrinogen) att geléartad av trombin i rumstemperatur (1).