Biology

Cell Block Bereiden uit Cytologie Model met overwegend Individueel verspreide cellen

Published: July 21, 2009 doi: 10.3791/1316

¹Department of Pathology, University of Wisconsin - Milwaukee

Summary

Shidham de methode voor de bereiding van cel blokken met AV-marker van cytologie exemplaren, die elk verspreid cellen en kleine celgroepen.

Abstract

Deze video toont Shidham de methode voor de bereiding van de cel blokken van vloeistof op basis cervicovaginal cytologie exemplaren, die elk verspreid cellen en kleine celgroepen. Deze techniek maakt gebruik van HistoGel (Thermo Scientific) met conventionele laboratorium apparatuur.

Het gebruik van cell block secties is een waardevolle aanvullende instrument voor evaluatie van de niet-gynaecologische cytologie. Ze stellen de cytopathologist om extra morfologische exemplaar details waaronder de architectuur van de laesie studie. Het belangrijkste is dat ze zorgen voor de evaluatie van de bijkomende studies als immunocytochemie, in-situ hybridisatie test (FISH / CISH) en in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditionele cellenblok bereidingstechnieken zijn meestal toegepast op de niet-gynaecologische cytologie preparaten, typisch voor lichaamsvocht effusies en fijne naald aspiratie biopsie.

Vloeistof op basis cervicovaginal exemplaren zijn relatief minder mobiel dan hun niet-gynaecologische tegenhangers met vele individuele verspreide cellen. Vanwege dit, adequate cellulariteit binnen de cel blok onderdelen is moeilijk te bereiken. Daarnaast kan de histotechnologist snijden het blok niet te visualiseren het niveau waarop de cellen worden bij de hoogste concentratie. Daarom is het moeilijk te controleren het juiste niveau waarop secties kunnen worden geselecteerd om te worden overgebracht naar de glazen dia's voor het testen. Als gevolg daarvan kan de oppervlakte van de cel blok met de cellen van belang worden gemist, hetzij door te snijden verleden of niet snijden diep genoeg. Huidige protocol voor de methode Shidham adressen van deze problemen. Hoewel dit protocol is gestandaardiseerd en gerapporteerd voor gynaecologische vloeistof op basis cytologie exemplaren, kan het ook worden toegepast op niet-gynaecologisch exemplaren, zoals effusie vloeistoffen, FNA, poetsen, cyste inhoud etc voor betere kwaliteit van diagnostisch materiaal in de cel te blokkeren secties.

Protocol

Inleiding:

Dit is een video beschrijft Shidham de methode voor het celblok voorbereiding op basis van vloeibare cytologie (LBC) specimen met HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). In vergelijking met andere willekeurige benaderingen, de volgende zijn de twee belangrijkste kenmerken van dit protocol voor het bereiden van celblokken van relatief hypocellular exemplaren met afzonderlijk verspreide losse cellen (1-5).

Dit protocol gaat stappen ondernemen om de cellen te concentreren langs het vlak evenwijdig aan het snijvlak van de cel te blokkeren.
Het bevat ook een baken-achtige donkere opnemen van AV-marker (Figuur 1b), die twee van de volgende doeleinden dient:
1. Te visualiseren het niveau waarop de cellen worden geconcentreerd. De oppervlakte van de cel blok met de cellen van belang nu kan worden gevisualiseerd door de histotechnologist wanneer het donker gekleurde baken wordt blootgesteld tijdens het snijden. Dit vermogen om toezicht te houden zou voorkomen dat een uit te snijden door het niveau met de meeste van de cellen, of niet snijden te oppervlakkig naar het niveau met de hoogste concentratie van het monster cellen.
2. Om te dienen als een locator referentiepunt in serie celblok gedeelte over verschillende dia's. Dit referentiepunt fungeert als een baken te helpen lokaliseren bepaalde cellen of groepen van cellen voor de evaluatie van een coördinaat immunoreactiviteit patroon met het SCIP aanpak (6,7).

PROTOCOL (figuur 2)

Voorbereiding van het monster.

Breng de resterende LBC cervicale cytologie monster aan een vlakke bodem glazen buis (15mm diameter x 45mm) (Figuur 2.1 tot en met 2.4). Plaats de glazen buis in een grotere plastic buis (28 x 85mm) en gecentrifugeerd. Verwijder de glazen bodem los van de drager buis en giet het supernatant.
De glazen buis wordt vervolgens afgedekt (het morsen van het verwarmen van water te voorkomen in de volgende stap) en weer terug geplaatst in een groter vlakke bodem drager plastic tube
De vervoerder plastic buisje met de glazen buis wordt vervolgens afgedekt, geplaatst in een centrifuge (met draaibare koppen en geen vaste hoek cups zodat de cellen loodrecht vallen op de vlakke bodem van de glazen buis), en gesponnen bij 1805 G (3000 RPM, rotor radius-17cm) gedurende vijf minuten (Figuur 2.5).
De buisjes worden vervolgens verticaal uit de centrifuge en de kleinere glazen buis wordt verwijderd met een pincet uit de grotere carrier plastic tube zonder verstoring van de gesedimenteerde pellet met cellen.
De glazen buis met het monster is de niet-afgetopte en het supernatant wordt afgegoten zorg ervoor dat u de platte laag van sediment-cellen op de bodem (Figuur 2.6) verstoren.

Opname van de referentie te coördineren AV-marker en toevoeging van gel

Een donkere baken AV-marker (ongeveer 2 mm X 2 mm groot, plat opgedoken, fragment van donker gekleurde, sectionable materiaal) (figuur 3) wordt toegevoegd als een wegwijzer naar de glazen buis (figuur 2.7).
Vloeibaar een aliquot van HG door smelten in magnetron 10 seconden bij gemiddeld vermogen.
Voeg 0,5 ml gesmolten HG op de buis, mengen met het sediment snel, en samen te vatten is (Figuur 2.8) (Ga verder naar de volgende stap snel zonder dat de HG om te beginnen met stollen).
Voeg ongeveer 2,5 ml warm (45 ° C) water aan de vervoerder plastic buis (figuur 2.9).
De kleinere bedekte glazen buis is geplaatst in de plastic buis met warm water. (Deze stap is nodig om de HG te houden van stollen tijdens de volgende stappen) (Figuur 2.9).
De vervoerder plastic buisje wordt geplaatst in de centrifuge (met draaibare koppen en niet vaste hoek cups zodat de cellen loodrecht vallen op de vlakke bodem van de glazen buis), en gesponnen bij 1805 G (3000 rpms, rotor radius-17cm) voor vijf minuten. Het doel van deze centrifugatie stap is om de AV-marker duwen en om de cellen te concentreren in een laag dichter bij het snijvlak van de uiteindelijke paraffine ingebedde celblok (Figuur 1d).
De buizen worden vervolgens voorzichtig en verticaal uit de centrifuge zorg ervoor dat u de gesedimenteerd dunne laag met het monster cellen op de bodem te verstoren.
De grotere plastic buis is de niet-afgetopte en de kleinere glazen buis verticaal is verwijderd door een pincet zonder de sedimentlaag van het monster cellen.
De kleine glazen buis wordt gekoeld in een verticale positie gedurende 15 minuten afkoelen en stollen van de HG (Figuur 2.11).

Verwijdering van de cel te blokkeren als een knop van de gel met het monster voor eindverwerking

De gestolde HG schijf, met de laag van geconcentreerde / sediment monster op de bodem wordt verdreven uit het vlakke bodem glazen buis door spuiten 10% formaline door middel van een 23 gauge naald met de spuit (figuur 2.12).
De naald wordt ingebracht langs de zijkant van de buis aan de rand van gestolde HG schijf met het monster (zie figuur 2.12).
De needle wordt gedraaid langs de zijkant van de buis, terwijl formaline langzaam geduwd door de spuit. Dit resulteert in de scheiding van de HG-toets samen met donker gekleurde baken AV-marker en de geconcentreerde model in het van de platte bodem van de glazen buis (figuur 2.12).
De cel blok (gel-knop met het monster cellen) wordt dan geplaatst in een label cassette en ter weefsel verwerking paraffine ingebedde celblokken (Figuur 2.13) voor te bereiden.

Inbedding en snijden van het monster

De schijf is ingebed in paraffine met de donkere baken marker naar beneden als snij-oppervlak (figuur 1).
Het blok is doorsnede tot aan het donker gekleurde AV-marker als een baken wordt blootgesteld en duidelijk zichtbaar.
Drie tot vier micron delen worden gesneden van dit niveau die moet bevatten de meeste van de afzonderlijk verspreide cellen van het monster.
De secties worden verzameld op het glaasje voor verdere kleuring, immunohistochemische kleuring, of andere tests zoals aangegeven. De protocollen voor deze tests waaronder het type van dia's te gebruiken voor montage van de onderdelen kan variëren. In het algemeen voor immunokleuring, zijn gecoat slides gebruikt om zwevende en het verlies van secties van de dia's te voorkomen tijdens de immunokleuring stappen.

Afkortingen (in alfabetische volgorde): CISH, chromogene in-situ hybridisatie tests; FISH, TL-in-situ hybridisatie tests; FFPE, formaline gefixeerde in paraffine ingebedde, FNA, fijne naald aspiratie, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, op basis van vloeibare cytologie; PCR polymerase chain reaction;

Figuur 1. De structuur van de cel te blokkeren voorbereid door het protocol Shidham's.

Figuur 2. De samenvatting van de verschillende stappen voor het bereiden van celblok van LBC monster door het protocol Shidham's.

Figuur 3. Voorbereiding van de AV-marker van bananenschillen.

Figuur 4. Vergelijking van de cel-blokken en secties met en zonder AV-marker.

Figuur 5. Vergelijking van de celeigenschappen van delen van de cel te blokkeren met en zonder AV-marker.

Discussion

Cel blokken zijn een waardevol instrument voor de evaluatie van de verschillende cytologie specimens (1). Het belangrijkste is, in aanvulling op de architecturale details van het model, cel-blokken zorgen voor de evaluatie van bijkomende studies als immunocytochemie, fluorescerende / chromogene in-situ hybridisatie test (FISH / CISH) en de in-situ PCR. Een verscheidenheid van methoden voor de voorbereiding van cellenblok worden beschreven. Echter, de meeste van deze zijn geschikt voor niet-gynaecologische cytologie monsters, die relatief veel cellen bevatten, en met weefsel microfragments zoals in FNA zuigt en een aantal sereuze vloeistoffen zoals ontboezemingen (1,3,4,5).

Omdat de cel blokkeert in de eerste plaats de mogelijkheid van een immunocytochemische evaluatie, moet de verwerking bij voorkeur vergelijkbaar met die van de formaline-gefixeerd paraffine-ingebed (FFPE) weefsels. Uiteindelijk de resultaten die zijn verkregen na immunocytochemische evaluatie van de cel te blokkeren secties worden vergeleken met die van de gepubliceerde literatuur voornamelijk uitgevoerd op FFPE weefselcoupes. Eventuele wijzigingen in het protocol mogelijk compromis en teniet te doen de geldigheid van de resultaten verkregen op celblokken worden verwerkt door middel van verschillende fixatieven en reagens sequenties andere dan die wordt gebruikt voor routine FFPE. Enkele commerciële technieken kunnen hebben het nadeel van de verwerking door middel van een protocol van de blootstelling aan andere fixatief-reagens blootstelling.

Verschillende methoden van de cel te blokkeren voorbereiding zijn beschikbaar voor exemplaren met een aanzienlijke hoeveelheid sediment en weefsel fragmenten. In principe worden de sedimenten geconcentreerd wordt ondersteund door een gel of coagulatie principe. De wendbaar knop is dan ingebed in paraffine na verwerking, zoals de chirurgische pathologie exemplaren / biopten.

Gebruikte de gels zijn gelatine, agar, fibrinogeen / plasma-trombine, en andere commerciële gels, zoals HG. De methoden van concentratie varieert van eenvoudige pelleteren van het sediment door centrifugeren om de concentratie van de cellen langs verschillende soorten membranen. Voorbeelden hiervan zijn: Milipore, collodin (Celloidin) zakken of schrapen van de cellen van de cytologie vlekken op glazen objectglaasjes (1). We hebben ook onderzocht een groot aantal gels door te proberen verschillende combinaties van agar en gelatine. Geen van de combinaties bereikte een stevig genoeg consistentie een makkelijk wendbaar schijf van gestolde gel te verkrijgen met embedded cellen van het model in een stuk. HG toonde juiste consistentie en in onze ervaring de immunokleuring resultaten op HG celblok secties zijn uitstekend.

Vloeistof op basis van cytologie (LBC) monsters voor cervicovaginal cytologie zijn over het algemeen minder mobiel dan niet-gynaecologische exemplaren zoals hierboven vermeld. Daarnaast heeft de gynaecologische LBC exemplaren voornamelijk bevatten individuele verspreide geëxfolieerde oppervlakkige cellen van cervicovaginal slijmvlies. Door deze, kunnen passende cellulariteit binnen de cel blok secties niet worden bereikt zonder een speciale aanpak. Aangezien deze afzonderlijk verspreid cellulaire componenten in de het blok kan niet worden gezien door de histotechnologist tijdens de sectie snijden, kan het niveau waarop de cellen start verschijnen in de secties niet op prijs gesteld en kunnen gemist worden, hetzij door te snijden langs het niveau met de meeste cellen of niet snijden diep genoeg in het niveau met de hoogste concentratie van het monster cellen (figuur 4). Shidham's protocol richt deze beide aspecten met behulp van HG voor de inbedding en conventionele laboratorium apparatuur (2) (figuur 2).

Dit protocol gaat volgende twee belangrijke functies (figuur 1):

Concentratie en uitlijning van afzonderlijk verspreid cellen in een smalle vlak naast en parallel aan het snijvlak van de cel blok (figuur 5).
Opname van een baken-like dark AV-marker als een wegwijzer. Dit is essentieel voor het bereiken van volgende functies:
1. Identificeren en bewaken van het niveau waarop de cellen zijn geconcentreerd in de cel te blokkeren. De belichting van de donkere gekleurde wegwijzer highlights het niveau waarop het merendeel van de singly verspreide cellen in de cel blok zullen naar verwachting worden gevestigd (figuur 4). Dit voorkomt de oversnijding (snijden langs het niveau met de meeste cellen) of prijsonderbieding (niet snijden diep genoeg in het niveau met de hoogste concentratie van het monster cellen) in de cel te blokkeren en de selectie van de secties van het niveau in de cel blok correspondeert met de hoogste concentratie staat van cellen.
2. De donker gekleurde wegwijzer in de secties dient ook als een referentiepunt te overzien en precies dezelfde cellen te identificeren in verschillende seriële secties van de cel te blokkeren op verschillende dia's (figuur 4). Dit is van cruciaal belang tijdens het interpreteren en evalueren van de te coördineren eigenschappen zoals immunoprofile van bepaalde cellen van het SCIP benadering van dezelfde cellen te volgen in verschillende secties (6,7).

Hoewel de our protocol is gestandaardiseerd en gerapporteerd voor vloeibare cervixslijm exemplaren, het kan ook gebruikt worden om diagnostische opbrengst van de vele andere niet-gynaecologische exemplaren, zoals effusie vloeistoffen, FNA, poetsen, cyste inhoud etc. Daarnaast versterken de AV marker zou vergemakkelijken verbeterd toepassing van SCIP aanpak tijdens de immunohistochemische evaluatie van de cel te blokkeren delen van deze specimens. De inbedding medium kan worden vervangen door andere reagentia met de nodige wijzigingen op relevante stappen. HG kan worden vervangen door plasma (fibrinogeen) te gegeleerd door trombine bij kamertemperatuur (1).

Acknowledgments

De auteurs danken Chris Chartrand, HT (ASCP) voor het aantonen van de sectie te snijden van de cel blok met AV marker.

References

Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.
Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).
Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens. Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).
Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy. CytoJournal. 5, 3-3 (2008).
Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study. Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).
Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).
Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).