Cell Block Vorbereitung von Zytologie Probe mit Vorherrschaft von Individuell verstreuten Zellen

Summary

Shidham das Verfahren zur Herstellung von Zell-Blöcke mit AV-Markierung von Zellproben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen.

Abstract

Dieses Video zeigt Shidham die Verfahren zur Herstellung von Zell-Blocks von Flüssigkeit basiert zervikovaginalen Zytologie Proben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen. Diese Technik verwendet HistoGel (Thermo Scientific) mit konventionellen Laborgeräten.

Die Verwendung von Zellen blockieren Abschnitten ist ein wertvolles Hilfswerkzeug für die Bewertung von nicht-gynäkologischen Zytologie. Sie ermöglichen die Zytopathologen zusätzliche morphologische Muster Detail, einschließlich der Architektur der Läsion zu studieren. Vor allem sorgen sie für die Auswertung der ergänzenden Studien wie Immunzytochemie, in-situ-Hybridisierung Tests (FISH / CISH) und in-situ-Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Traditionelle Zellenblock Vorbereitung Techniken meist nicht-gynäkologischen Zytologie Proben angewendet wurde, in der Regel für Körperflüssigkeit Ergüssen und Feinnadelpunktion Biopsie.

Flüssiges Basis zervikovaginalen Exemplare sind relativ weniger zelluläre als ihre nicht-gynäkologischen Kollegen mit vielen einzelnen verstreuten Zellen. Aus diesem Grund ist eine ausreichende Zelldichte innerhalb der Zelle blockieren Abschnitte schwer zu erreichen. Darüber hinaus können die histotechnologist Schneiden des Blocks nicht vorstellen, auf welcher Ebene werden die Zellen bei der höchsten Konzentration. Daher ist es schwierig, die geeignete Ebene, welche Abschnitte ausgewählt, um den Glasträger für die Prüfung übertragen werden können, werden überwacht. Als Ergebnis kann die Fläche der Zelle Block mit den Zellen von Interesse verpasst haben, entweder durch Schneiden Vergangenheit oder schneidet nicht tief genug sein. Aktuelle Protokoll für Shidham Methode behebt diese Probleme. Obwohl dieses Protokoll standardisiert ist und berichtet für gynäkologische flüssige Zytologie Proben kann es auch zu nicht-gynäkologische Proben wie Erguss Flüssigkeiten, FNA, Bürsten, Zysteninhalts etc für eine verbesserte Diagnose-Material in der Zelle blockieren Abschnitte angewendet werden.

Protocol

Einleitung:

Dies ist ein Video beschreibt Shidham Methode für Zellenblock Vorbereitung von flüssigen Zytologie (LBC) Probe mit HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Im Gegensatz zu anderen zufälligen Ansätze verglichen, die folgenden sind die beiden kritischen Merkmale dieses Protokoll für die Vorbereitung Zellblöcke von relativ hypozellulären Proben mit einzeln verstreuten lose Zellen (1-5).

1. Dieses Protokoll umfasst die Schritte, um die Zellen entlang der Ebene parallel zur Schnittfläche der Zelle blockieren konzentrieren.
2. Es enthält auch ein Leuchtturm-wie dunkle Aufnahme von AV-Markierung (Abbildung 1b), die zwei der folgenden Zwecken dient:
   1. Zur Visualisierung der Ebene, auf der die Zellen konzentriert. Die Fläche der Zelle blockieren mit den Zellen von Interesse konnte nun durch die histotechnologist visualisiert werden, wenn die dunkle Leuchtturm während des Schneidens ausgesetzt ist. Diese Fähigkeit zur Überwachung würde man beim Schneiden durch die Ebene mit den meisten der Zellen, oder schneidet nicht zu oberflächlich in die Ebene mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen zu verhindern.
   2. Um als Locator Bezugspunkt in serielle Zellenblock Abschnitt über verschiedene Folien dienen. Dieser Referenzpunkt fungiert als ein Leuchtfeuer zum Auffinden bestimmter Zellen oder Gruppen von Zellen für die Auswertung eines Koordinatensystems Immunreaktivität Muster mit dem SCIP-Ansatz (6,7).

PROTOKOLL (Abbildung 2)

Vorbereitung der Probe.

1. Übertragen Sie die verbleibende LBC Zervixzytologie Probe einen flachen Boden Glasrohr (Durchmesser 15mm x 45mm) (Abb. 2.1 bis 2.4). Legen Sie das Glasrohr in ein größeres Kunststoff Trägerrohr (28 x 85mm) und Zentrifuge. Entfernen Sie den Glasboden Rohr aus dem Trägerrohr und giesst die überstehende.
2. Das Glasrohr wird dann verschlossen (um das Auslaufen von Heizungswasser in den nächsten Schritt zu verhindern) und wieder in eine größere Wohnung unteren Träger Kunststoffrohr gelegt
3. Der Träger Kunststoffrohr mit dem Glasrohr wird dann verschlossen, platziert in einer Zentrifuge (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotorradius-17cm) für 5 Minuten (Abbildung 2,5).
4. Die Rohre werden dann senkrecht aus der Zentrifuge entfernt und die kleinere Glasröhre ist mit einer Pinzette aus der größeren Träger Kunststoffrohr, ohne die sedimentierte Pellet mit Zellen entfernt.
5. Das Glasrohr mit der Probe ist nicht begrenzten und der Überstand wird dabei nicht auf die flache Schicht von Sedimenten Zellen am Boden (Abb. 2.6) stören gegossen.

Die Einbeziehung der Bezugskoordinatensystem AV-Marker und die Zugabe von Gel-

1. Ein dunkler Leuchtturm AV-Markierung (ca. 2 mm x 2 mm Größe, die Oberfläche flach, Fragment des dunkel gefärbten, sectionable Material) (Abbildung 3) ist als Wegweiser zu dem Glasrohr (Abbildung 2,7) aufgenommen.
2. Verflüssigen ein Aliquot von HG durch Schmelzen in der Mikrowelle für 10 Sekunden bei mittlerer Leistung.
3. 0,5 ml des geschmolzenen HG an das Rohr, vermischen sich mit dem Sediment schnell und rekapitulieren sie (Abb. 2.8) (Fahren Sie mit dem nächsten Schritt schnell, ohne dass die HG zu beginnen Verfestigung).
4. Fügen Sie ca. 2,5 ml warmem (45 ° C) Wasser an den Frachtführer Kunststoffrohr (Abbildung 2,9).
5. Die kleineren capped Glasröhre ist innerhalb der Kunststoffrohr mit warmem Wasser gestellt. (Dieser Schritt ist notwendig, um die HG ein Erstarren in den nächsten Schritten zu halten) (Abbildung 2,9).
6. Der Träger Kunststoffschlauch wird in die Zentrifuge eingesetzt (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotor-Radius-17cm) für fünf Minuten. Der Zweck dieser Zentrifugation wird der AV-Markierung zu schieben und die Zellen in einer Schicht näher an der Schnittfläche der endgültigen Paraffin eingebetteten Zellen blockieren (Abbildung 1d) zu konzentrieren.
7. Die Rohre werden dann sanft und vertikal aus der Zentrifuge dabei nicht um die sedimentierten dünne Schicht mit der Probe Zellen am Boden stören entfernt.
8. Je größer Kunststoffrohr ist unverschlossen und die kleineren Glasröhre ist vertikal mit einer Pinzette, ohne die Sedimentschicht der Probe Zellen entfernt.
9. Das Glasröhrchen wird gekühlt in vertikaler Position für 15 Minuten zu kühlen und zu verfestigen sich die HG (Abbildung 2.11).

Entfernung von der Zelle blockieren, wie eine Taste des Gels mit Proben für die Endbearbeitung

1. Die verfestigte HG Festplatte, mit der Schicht aus konzentrierten / Sediment Probe an der Unterseite ist aus dem flachen Boden Glasröhre durch spritzende 10% Formalin durch eine 23-Gauge-Nadel mit der Spritze (Abb. 2,12) verdrängt.
2. Die Nadel wird an der Seite des Rohres an der Peripherie des erstarrten HG Scheibe mit Probe (Abbildung 2.12) eingesetzt.
3. Die needle ist an der Seite der Röhre gedreht, während Formalin wird langsam durch die Spritze geschoben. Daraus ergibt sich die Trennung der HG-Taste zusammen mit dunkel gefärbten Beacon AV-Marker und die konzentrierte Probe in sie aus dem flachen Boden des Glasrohres (Abbildung 2.12).
4. Der Zellenblock (Gel-Taste mit Probe-Zellen) wird dann in eine markierte Kassette gelegt und legte für die Gewebe-Verarbeitung in Paraffin eingebetteten Zellen blockiert (Abbildung 2.13) vorzubereiten.

Einbetten und Schneiden der Probe

1. Die Scheibe ist in Paraffin mit dem dunklen Leuchtturm Marker nach unten als Schnittfläche (Abb. 1) eingebettet.
2. Der Block wird bis zum dunklen AV-Markierung geschnitten wie ein Leuchtfeuer ausgesetzt ist und deutlich sichtbar sein.
3. Drei bis vier Mikrometer Abschnitte sind von dieser Ebene die meisten der einzeln verstreuten Zellen aus der Probe enthalten sollte geschnitten.
4. Die Abschnitte werden auf dem Objektträger zur weiteren Färbung, immunhistochemische Färbung oder andere Tests wie angegeben gesammelt. Die Protokolle für diese Tests einschließlich der Art der Folien für die Montage der Teile verwenden können variieren. Generell gilt für Immunfärbung werden beschichtete Folien verwendet werden, um Schwimm-und Verlust von Abschnitten aus den Folien während der Immunfärbung Schritte zu verhindern.

Abkürzungen verwendet werden (in alphabetischer Reihenfolge): CISH, chromogene in situ Hybridisierung Tests; FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Tests; FFPE, Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten, FNA, Feinnadelpunktion; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, flüssige Zytologie, PCR Polymerase-Kettenreaktion;

Abbildung 1. Die Struktur der Zelle blockieren, indem Shidham-Protokoll vorbereitet.

Abbildung 2. Die Zusammenfassung der verschiedenen Schritte zur Vorbereitung Zellenblock von LBC Probe durch Shidham-Protokoll.

Abbildung 3. Erstellung von AV-Marker aus Bananenschalen.

Abbildung 4. Vergleich der Zell-Blöcke und Sektionen mit und ohne AV-Marker.

Abbildung 5. Vergleich der Zellstruktur von Teilen der Zelle blockieren mit und ohne AV-Marker.

Discussion

Zell-Blöcke sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der verschiedenen zytologischen Proben (1). Am wichtigsten ist, zusätzlich zu den architektonischen Details der Probe erlauben Zellblöcke für die Auswertung der ergänzenden Studien wie Immunzytochemie, fluoreszierend / chromogene in situ Hybridisierung Tests (FISH / CISH) und in-situ PCR. Eine Vielzahl von Methoden für die Herstellung von Zell-Block beschrieben. Allerdings sind die meisten dieser für Nicht-gynäkologischen Zytologie Proben, die relativ viele Zellen enthalten und mit dem Gewebe Mikrofragmente wie in FNA saugt und einige seröse Flüssigkeiten wie Ergüsse (1,3,4,5).

Da Zellblöcke vor allem die Möglichkeit für immunzytochemische Auswertung zu gewährleisten, sollte die Verarbeitung vorzugsweise ähnlich zu sein, dass der Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe. Letztlich sind die Ergebnisse nach immunzytochemische Auswertung der Zelle blockieren Abschnitte gewonnen werden, die mit der veröffentlichten Literatur überwiegend auf FFPE Gewebeschnitten durchgeführt verglichen. Etwaige Änderungen im Protokoll potenziell beeinträchtigen und bewirken die Gültigkeit der Ergebnisse auf Zellblöcke durch verschiedene Fixiermittel und Reagenz-Sequenzen eine andere als die Routine FFPE verwendet verarbeitet wird. Einige kommerzielle Techniken haben den Nachteil, der Verarbeitung durch ein Protokoll der Exposition gegenüber anderen Fixateur-Reagenz Exposition.

Verschiedene Methoden der Zell Satzaufbereitung sind für Proben mit einer signifikanten Menge an Sediment-und Gewebeteile zur Verfügung. Grundsätzlich sind die konzentrierte Ablagerungen von einigen Gel oder Koagulation grundsätzlich unterstützt. Das wendige Taste wird dann in Paraffin nach der Verarbeitung wie der chirurgischen Pathologie Proben / Biopsien eingebettet.

Die Gele verwendet werden, umfassen Gelatine, Agar, Fibrinogen / Plasma-Thrombin und andere kommerzielle Gele, wie HG. Die Methoden der Konzentration variieren von einfachen Pelletierung des Sediments durch Zentrifugation zur Konzentration der Zellen auf verschiedenen Arten von Membranen. Beispiele hierfür sind: Milipore, Collodin (Celloidin) Taschen oder Abschaben der Zellen von der zytologische Abstriche auf Glasplättchen (1). Wir haben auch eine Vielzahl von Gelen, indem Sie versuchen verschiedene Kombinationen von Agar und Gelatine ausgewertet. Keine der Kombinationen erzielten die eine feste Konsistenz genug, um eine leicht manövrierbar Scheibe aus erstarrten Gel mit eingebetteten Zellen aus der Probe in einem Stück zu erhalten. HG zeigten entsprechende Konsistenz und nach unserer Erfahrung die Immunfärbung Ergebnisse auf HG Zellenblock Abschnitte wurden ausgezeichnet.

Flüssige Zytologie (LBC) Proben für zervikovaginalen Zytologie sind im Allgemeinen weniger zelluläre als nicht-gynäkologische Proben wie oben erwähnt. Neben der gynäkologischen LBC Proben enthalten überwiegend einzelne verstreute exfoliated oberflächlichen Zellen aus zervikovaginalen Schleimhaut. Aus diesem Grund können geeignete Zellstruktur innerhalb der Zelle blockieren Abschnitte nicht ohne einen besonderen Ansatz erreicht werden. Da diese einzeln zellulären Komponenten in der den Block verstreut kann nicht durch den histotechnologist während Abschnitt Schneiden gesehen werden kann, auf welchem ​​Niveau die Zellen beginnen, die in der Abschnitte nicht geschätzt und können übersehen werden, entweder durch Schneiden über das Niveau bei den meisten Zellen oder nicht Schneiden tief genug in die Höhe mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen (Abbildung 4). Shidham-Protokoll-Adressen diese beiden Fragen mit HG als Einbettmedium und konventioneller Laborausstattung (2) (Abbildung 2).

Dieses Protokoll umfasst die folgenden zwei wichtigen Funktionen (Abbildung 1):

1. Konzentration und Ausrichtung der einzeln verstreuten Zellen in einem engen Flugzeug benachbart und parallel zu der Schnittfläche der Zelle blockieren (Abbildung 5).
2. Aufnahme eines Beacon-wie dunkle AV-Marker als Wegweiser. Dies ist entscheidend für das Erreichen folgenden Features:
   1. Identifizierung und Überwachung der Ebene, auf der die Zellen in der Zelle blockieren konzentriert sind. Die Belichtung der dunklen Wegweiser zeigt die Ebene, auf der die meisten der einzeln verstreuten Zellen in der Zelle blockieren erwartet, dass sich (Abbildung 4) werden sollen. Damit wird verhindert, der Überschneidung (Schneiden über das Niveau bei den meisten Zellen) oder unterboten (nicht schneiden tief genug in die Höhe mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen) in der Zelle blockieren und ermöglichen die Auswahl der Abschnitte aus der Ebene in der Zelle blockieren Korrespondenz mit höchster Konzentration von Zellen.
   2. Die dunkel gefärbten Wegweiser in den Abschnitten dient auch als Bezugspunkt zu überblicken und zu identifizieren genau die gleichen Zellen in verschiedenen Schnittserien der Zelle blockieren auf verschiedenen Folien (Abbildung 4). Dies ist kritisch, während die Interpretation und Bewertung des Koordinatensystems Eigenschaften wie immunoprofile von bestimmten Zellen der SCIP-Ansatz auf die gleichen Zellen in verschiedenen Abschnitten (6,7) folgen.

Obwohl our-Protokoll standardisiert ist und berichtet für flüssige Zervixzytologie Proben, es kann auch verwendet werden, um diagnostische Ausbeute von vielen anderen nicht-gynäkologische Proben wie Erguss Flüssigkeiten, FNA, Bürsten, Zysteninhalts etc. Darüber hinaus verbessern die AV-Marker erleichtern würde verbessert Anwendung der SCIP-Ansatz bei der immunhistochemischen Auswertung der Zelle blockieren Abschnitten dieser Proben. Die Einbettung Medium kann durch andere Reagenzien mit entsprechenden Modifikationen an relevanten Schritte ersetzt werden. HG kann durch Plasma (Fibrinogen), die von Thrombin bei Raumtemperatur (1) geliert werden ersetzt werden.