Preparação Cell Block da amostra citologia com predomínio de células individualmente Scattered

Summary

Shidham método para a preparação de blocos de células com marcador de AV partir de amostras de citologia com células individualmente dispersos e grupos de células pequenas.

Abstract

Este vídeo demonstra método Shidham para a preparação de blocos de células de líquidos à base espécimes citologia cérvico-vaginal contendo células individualmente dispersos e grupos de células pequenas. Esta técnica utiliza HistoGel (Thermo Scientific) com equipamentos convencionais de laboratório.

A utilização de secções bloco de células é uma valiosa ferramenta auxiliar para avaliação da não-ginecológicas citologia. Eles permitem que o citopatologista para estudar detalhes morfológicos adicionais espécime, incluindo a arquitetura da lesão. Mais importante, eles permitem a avaliação de estudos auxiliares, tais como imunocitoquímica, os testes de hibridização in-situ (FISH / CISH) e in-situ reação em cadeia da polimerase (PCR). Tradicionais técnicas de preparação de blocos de células, têm sido aplicadas a amostras não-ginecológicas citologia, tipicamente para derrame de fluido corporal e biópsias aspirativa por agulha fina.

Líquidos à base espécimes cervicovaginais são relativamente menos do que seus celulares não-ginecológicas homólogos com muitas células individuais dispersos. Devido a isso, celularidade adequada dentro das seções bloco de células é difícil de conseguir. Além disso, o corte histotechnologist o bloco não pode visualizar o nível em que as células estão em maior concentração. Portanto, é difícil monitorar o nível adequado em que as seções pode ser selecionado para ser transferido para a lâminas de vidro para testes. Como resultado, a área do bloco de células com as células de interesse podem ser perdidas, seja por corte ou não corte passado profundo o suficiente. Protocolo atual para o método Shidham aborda estas questões. Embora este protocolo é padronizada e relatados para amostras de líquido ginecológico de citologia com base, também pode ser aplicada a não-ginecológicas, tais como amostras de fluidos efusão, FNA, escovações, etc o conteúdo da lesão para melhorar a qualidade de material de diagnóstico em seções bloco de células.

Protocol

Introdução:

Este é um vídeo que descreve o método Shidham para a preparação de células bloco de líquidos à base de amostra citologia (LBC), utilizando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Em comparação com outras abordagens aleatórias, são as duas características essenciais deste protocolo para a preparação de blocos de células a partir de amostras relativamente hipocelular com células isoladas espalhadas soltas (1-5).

1. Este protocolo envolve as etapas de concentrar as células ao longo do plano paralelo à superfície de corte do bloco de células.
2. Também inclui uma inclusão beacon-like escuro da AV-marcador (Figura 1b), que serve duas das seguintes finalidades:
   1. Para visualizar o nível em que as células estão concentradas. A área do bloco de células com as células de interesse agora pode ser visualizado pelo histotechnologist quando o farol de cor escura é exposto durante o corte. Esta capacidade de monitorar o impediriam de corte através do nível com a maioria das células, ou não cortar demasiado superficial para o nível com maior concentração de células da amostra.
   2. Para servir como um ponto de referência de localização na seção de série célula bloco em slides diferentes. Este ponto de referência atua como um farol para ajudar a localizar células ou grupos específicos de células para avaliação de um padrão de imunorreatividade coordenar com a abordagem SCIP (6,7).

PROTOCOLO (Figura 2)

Preparação da amostra.

1. Transferir a amostra residual LBC citologia cervical para um tubo com fundo de vidro planas (15mm de diâmetro x 45mm) (Figura 2.1 a 2.4). Coloque o tubo de vidro em uma grande tubo plástico transportadora (28 x 85 milímetros) e centrifugar. Retire o tubo com fundo de vidro do tubo transportador e despeje o sobrenadante.
2. O tubo de vidro é então tampado (para evitar derramamento de aquecimento de água na próxima etapa) e colocado de volta dentro de um flat tubo maior fundo de plástico transportadora
3. O tubo de plástico contendo transportadora o tubo de vidro é então tampado, colocados em uma centrífuga (com xícaras giratórias e não copos ângulo fixo para que as células incidem perpendicularmente ao fundo plano do tubo de vidro), e girou em 1805 G (3000 rpms, raio-17cm rotor) por cinco minutos (Figura 2.5).
4. Os tubos são então removidas verticalmente a partir da centrifugação e do tubo de vidro menor é retirado com uma pinça a partir do maior tubo de plástico sem perturbar o sedimento sedimentada com as células.
5. O tubo de vidro com a amostra é destampado eo sobrenadante é decantado tomando cuidado para não perturbar a camada plana de células de sedimentos no fundo (Figura 2.6).

Inclusão das coordenadas de referência AV marcador e adição de gel

1. Um farol escuro AV-marcador (cerca de 2 mm X 2 mm de tamanho, superfície plana, fragmento de material escuro, colorido sectionable) (Figura 3) é adicionado como um sinal para o tubo de vidro (Figura 2.7).
2. Liquefazer uma alíquota de HG pelo derretimento em microondas por 10 segundos na potência média.
3. Adicionar 0,5 ml de HG fundido ao tubo de mistura, com o sedimento rapidamente, e recap-lo (Figura 2.8) (Vá para o próximo passo rapidamente, sem permitir que o HG para começar a solidificar).
4. Adicionar cerca de 2,5 ml de água morna (45 ° C) de água para o tubo de plástico transportadora (Figura 2.9).
5. O tubo de vidro tampado menor é colocado dentro do tubo de plástico com água morna. (Este passo é necessário para manter o HG de solidificar durante os próximos passos) (Figura 2.9).
6. O tubo de plástico transportadora é colocada na centrífuga (com xícaras giratórias e não copos ângulo fixo para que as células incidem perpendicularmente ao fundo plano do tubo de vidro), e girou em 1805 G (3000 rpms, raio-17cm rotor) por cinco minutos. O objetivo desta etapa de centrifugação é para empurrar o marcador AV-e concentrar as células em uma camada mais próxima da superfície de corte do último bloco de celas incluído em parafina (Figura 1d).
7. Os tubos são então removidas com cuidado e verticalmente a partir da centrífuga tomando cuidado para não perturbar a camada sedimentada fina com células da amostra na parte inferior.
8. O tubo plástico é maior sem tampa eo tubo de vidro menor é removido verticalmente por uma pinça, sem perturbar a camada de sedimento de células da amostra.
9. O tubo de vidro pequeno é refrigerado na posição vertical por 15 minutos para esfriar e solidificar o HG (Figura 2.11).

Remoção dos blocos de células como um botão de gel com a amostra para o processamento final

1. O disco HG solidificado, com a camada de concentrado / sedimento amostra no fundo é desalojado do tubo plana com fundo de vidro por esguichando formalina a 10% através de uma agulha de calibre 23 com a seringa (Figura 2.12).
2. A agulha é inserida ao longo da lateral do tubo na periferia do disco solidificou HG com a amostra (Figura 2.12).
3. O needle é rodado ao longo do lado do tubo, enquanto formol está lentamente empurrado através da seringa. Isso resulta na separação do botão HG junto com farol de cor escura AV-marcador e da amostra concentrada nele desde o fundo plano do tubo de vidro (Figura 2.12).
4. O bloco de células (botão gel com células amostra) é então colocada em um cassete rotulado e submetido a processamento de tecidos para preparar blocos parafinados de células (Figura 2.13).

Incorporação e corte do espécime

1. O disco está embebido em parafina com o lado escuro farol marcador para baixo como superfície de corte (Figura 1).
2. O bloco é seccionada até a cor escura marcador de AV como um farol é exposto e claramente visíveis.
3. Três a quatro seções micron são cortados a partir deste nível que deve conter a maioria das células isoladas espalhadas a partir do espécime.
4. As seções são coletados na lâmina de vidro para coloração mais, coloração imuno-histoquímica, ou outros testes, como indicado. Os protocolos para estes testes, incluindo o tipo de slides para utilizar para a montagem das seções pode variar. Geralmente para imunomarcação, slides revestidos são usados ​​para prevenir flutuante e perda de seções do slides durante as etapas de imunocoloração.

Abreviaturas utilizadas (em ordem alfabética): CISH, cromogênico testes de hibridização in-situ; FISH, Fluorescente testes de hibridização in-situ; FFPE, parafina fixadas em formalina; FNA, aspirativa por agulha fina; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, citologia líquida baseada; PCR reação em cadeia da polimerase;

Figura 1. A estrutura do bloco de celas preparado pelo protocolo de Shidham.

Figura 2. O resumo das diferentes etapas para a preparação de blocos de células de uma amostra LBC por protocolo de Shidham.

Figura 3. Preparação de AV-marcador de cascas de banana.

Figura 4. Comparação de blocos de células e seções com e sem AV-marcador.

Figura 5. Comparação de celularidade das seções do bloco de células com e sem AV marcador.

Discussion

Blocos de células são uma ferramenta valiosa para avaliação das amostras de citologia diversos (1). Mais importante, além de os detalhes arquitetônicos do espécime, blocos de células permitir uma avaliação dos estudos auxiliares, tais como imunocitoquímica, fluorescente / cromogênico testes in-situ (FISH / CISH) e in-situ PCR. Uma variedade de métodos para a preparação do bloco de celas são descritos. No entanto, a maioria destes são adequados para amostras não-ginecológicas citologia que contêm células relativamente muitos e com microfragmentos tecido como em FNA aspirados e alguns fluidos serosos, tais como derrames (1,3,4,5).

Porque os blocos de células principalmente proporcionar a oportunidade para a avaliação imunocitoquímicos, seu processamento deve preferencialmente ser semelhante ao da fixadas em formalina parafina (FFPE) tecidos. Em última análise, os resultados obtidos após a avaliação imunocitoquímica de seções bloco de celas são comparados com aqueles com a literatura feita predominantemente em secções de tecido FFPE. Quaisquer alterações no protocolo potencialmente comprometer e anular a validade dos resultados obtidos em blocos de células processadas através fixadores diferentes e seqüências de reagente que não seja usado para FFPE rotina. Algumas técnicas comerciais pode ter o inconveniente de processamento através de um protocolo de exposição à exposição fixador reagentes outros.

Vários métodos de preparação de blocos de células estão disponíveis para amostras com uma quantidade significativa de sedimentos e fragmentos de tecido. Principalmente, os sedimentos concentrados são suportados por um pouco de gel ou princípio de coagulação. O botão manobrável é, então, incluídos em parafina após processamento, como os espécimes cirúrgicos patologia / biópsias.

Os géis usados ​​incluem gelatina, agar, fibrinogênio / plasma-trombina, e outros géis comerciais, tais como HG. Os métodos de concentração variam de granulação simples do sedimento por centrifugação a concentração de células ao longo de vários tipos de membranas. Os exemplos incluem: Milipore, collodin (celóidina) sacos ou raspagem das células do esfregaço citológico em lâminas de vidro (1). Avaliamos também uma variedade de géis, tentando combinações diferentes de agar e de gelatina. Nenhuma das combinações alcançado a consistência um firme o suficiente para obter um disco facilmente manobrável de gel solidificado com células incorporado a partir da amostra em uma única peça. HG mostrou consistência adequada e em nossa experiência os resultados imunocoloração em seções HG bloco de células têm sido excelentes.

Líquidos à base de citologia (LBC) amostras para citologia cérvico-vaginal são geralmente menos celulares que os não-ginecológicas espécimes como mencionado acima. Além disso, as amostras ginecológicas LBC predominantemente conter individuais espalhados esfoliada células superficiais da mucosa cervicovaginal. Devido a isto, celularidade adequada dentro das seções de bloco de células não podem ser alcançados sem uma abordagem especial. Como estes isoladamente espalhados componentes celulares no bloco do não pode ser visto pelo histotechnologist durante o corte seção, o nível em que as células começam a aparecer nas seções não podem ser apreciadas e podem ser perdidas, seja por corte passado o nível com a maioria das células ou não corte profundo o suficiente para o nível com maior concentração de células da amostra (Figura 4). Protocolo Shidham aborda estas duas questões utilizando HG como a incorporação de equipamentos de laboratório de médio e convencional (2) (Figura 2).

Este protocolo envolve duas seguintes características principais (Figura 1):

1. Concentração e alinhamento de células isoladas espalhadas em um plano estreito adjacente e paralelo à superfície de corte do bloco de células (Figura 5).
2. Inclusão de um farol do tipo escuro AV marcador, como um poste de sinalização. Isto é crítico para atingir seguintes características:
   1. Identificar e monitorar o nível em que as células estão concentradas no bloco de células. A exposição da placa de sinalização de cor escura ressalta o nível em que a maioria das células isoladas espalhadas no bloco de celas deverão ser localizados (Figura 4). Isso evita que o overcutting (corte passado o nível com a maioria das células) ou subcotação (não corte profundo o suficiente para o nível com maior concentração de células da amostra) para o bloco de células e permitir a seleção das seções do nível do bloco célula correspondente com maior concentração de células.
   2. A sinalização de cor escura nas seções também serve como um ponto de referência para o levantamento e identificar exatamente as mesmas células em diferentes seções de série do bloco de celas em slides diferentes (Figura 4). Isto é crítico ao interpretar e avaliar as propriedades de coordenadas de células, tais immunoprofile especial, pela abordagem SCIP de seguir as mesmas células em diferentes seções (6,7).

Apesar de UOr protocolo é padronizada e relatados para amostras de líquidos à base de citologia cervical, também pode ser usado para aumentar o rendimento diagnóstico de muitos outros não-ginecológicas, tais como amostras de fluidos efusão, FNA, escovações, o conteúdo da lesão, etc Além disso, o marcador AV facilitaria melhorou aplicação da abordagem SCIP durante a avaliação imuno-histoquímica de seções bloco de células desses espécimes. O meio de incorporação podem ser substituídos por outros reagentes com as modificações apropriadas nas etapas relevantes. HG pode ser substituído por plasma (fibrinogênio), a ser gelificado por trombina à temperatura ambiente (1).