Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

Summary

Shidham la méthode de préparation des blocs de cellules avec AV-marqueurs dans les échantillons de cytologie contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules.

Abstract

Cette vidéo montre la méthode Shidham pour préparation des blocs de cellules de liquide à base de spécimens de cytologie cervico contenant des cellules dispersées individuellement et les groupes à petites cellules. Cette technique utilise HistoGel (Thermo Scientific) avec un équipement de laboratoire conventionnels.

L'utilisation de sections de bloc cellulaire est un outil précieux auxiliaires pour l'évaluation de la non-cytologie gynécologique. Ils permettent d'étudier l'cytopathologiste supplémentaires détails morphologiques spécimen, y compris l'architecture de la lésion. Surtout, ils permettent l'évaluation des études auxiliaires tels que l'immunocytochimie, tests d'hybridation in situ (FISH / CISH) et in situ la réaction en chaîne polymérase (PCR). Les techniques traditionnelles de préparation des blocs cellulaires ont surtout été appliquée aux non-échantillons de cytologie gynécologique, typiquement pour des épanchements de liquide corporel et cytoponctions.

Liquide à base de spécimens cervico sont relativement moins cellulaire que leurs homologues non-gynécologique avec de nombreuses cellules individuelles dispersées. Pour cette raison, la cellularité adéquate dans les sections bloc cellulaire est difficile à réaliser. En outre, le sectionnement histotechnologist le bloc ne peut pas visualiser le niveau auquel les cellules sont à la concentration maximale. Par conséquent, il est difficile de contrôler le niveau approprié au cours de laquelle des sections peuvent être sélectionnés pour être transférés à des lames de verre pour les tests. En conséquence, la zone du bloc de cellules avec les cellules d'intérêt peut être manqué, soit en coupant passé ou ne pas couper assez profond. Protocole actuel pour la méthode Shidham aborde ces questions. Bien que ce protocole est normalisé et rapportées pour des échantillons liquides cytologie gynécologique base, il peut également être appliquée aux non-gynécologiques spécimens tels que des fluides épanchement, FNA, brossages, kyste etc contenus pour une meilleure qualité de matériel de diagnostic dans les sections de bloc cellulaire.

Protocol

Introduction:

Ceci est une vidéo décrivant la méthode pour la préparation Shidham bloc cellulaire du liquide à base de cytologie (LBC) spécimen à l'aide HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Par rapport à d'autres approches aléatoires, les suivantes sont les deux caractéristiques essentielles de ce protocole pour la préparation de blocs de cellules à partir de spécimens relativement aux seules hypocellulaires dispersés cellules perdent (1-5).

1. Ce protocole comporte des mesures pour concentrer les cellules le long du plan parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire.
2. Il inclut également une intégration comme une balise sombre de AV-marqueur (figure 1b), qui sert à deux fins suivantes:
   1. Pour visualiser le niveau auquel les cellules sont concentrées. La zone du bloc de cellules avec les cellules d'intérêt aujourd'hui pourrait être visualisé par l'histotechnologist lorsque la balise de couleur foncée est exposé pendant la coupe. Cette capacité à surveiller les empêche de couper à travers le niveau avec la plupart des cellules, ou ne pas couper trop superficielle dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l'échantillon.
   2. Pour servir comme point de référence de localisation dans la section du bloc cellulaire de série sur les différentes diapositives. Ce point de référence agit comme un phare pour aider à localiser les cellules ou groupes de cellules pour l'évaluation d'un modèle immunoréactivité coordonner avec l'approche SCIP (6,7).

PROTOCOLE (figure 2)

Préparation de l'échantillon.

1. Transférer le spécimen résiduelle LBC cytologie cervicale à un tube de verre à fond plat (15mm de diamètre x 45mm) (figure 2.1 à 2.4). Placez le tube de verre dans un tube en plastique plus grand transporteur (28 x 85mm) et centrifugeuse. Retirer le tube à fond de verre du tube transporteur et éliminer le surnageant.
2. Le tube de verre est alors plafonné (pour éviter les déversements d'eau de chauffage dans l'étape suivante) et replacé dans un grand tube à fond plat en plastique porteuse
3. Le tube en plastique support contenant le tube de verre est alors plafonné, placé dans une centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, Rayon-17cm de rotor) pendant cinq minutes (figure 2.5).
4. Les tubes sont ensuite retirés à la verticale de la centrifugeuse et le tube de verre plus petit est retiré avec une pince à partir du tube en plastique plus grand transporteur, sans perturber le culot de cellules sédimentées.
5. Le tube en verre avec spécimen est non plafonnés et le surnageant est vidé en prenant soin de ne pas perturber la couche plane de cellules sédimentent au fond (figure 2.6).

L'inclusion de la coordonnée de référence AV-marqueur et plus de gel

1. Une balise noire AV-marqueur (environ 2 mm x 2 mm taille, plane surface, fragment de couleur foncée, le matériel sectionnable) (figure 3) est ajouté comme un poteau indicateur sur le tube de verre (Figure 2.7).
2. Liquéfier une aliquote de HG en le fondant au micro-ondes pendant 10 secondes à puissance moyenne.
3. Ajouter 0,5 ml de HG fondu pour le tube, mélanger avec le sédiment rapidement, et il récapitulation (figure 2.8) (Passez à l'étape suivante rapidement sans laisser le HG pour commencer à se solidifier).
4. Ajoutez environ 2,5 ml d'eau tiède (45 ° C) de l'eau dans le tube en plastique de support (Figure 2.9).
5. Le tube de verre plus petit plafonné est placé à l'intérieur du tube en plastique avec de l'eau tiède. (Cette étape est nécessaire pour garder le HG de se solidifier au cours des prochaines étapes) (Figure 2.9).
6. Le tube en plastique transporteur est placé dans la centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, le rayon-17cm de rotor) pour cinq minutes. Le but de cette étape de centrifugation est de pousser le marqueur AV et pour concentrer les cellules dans une couche proche de la surface de coupe du bloc cellulaire de paraffine finale embarqués (figure 1d).
7. Les tubes sont ensuite retirés doucement et verticalement à partir de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber la couche sédimentée mince avec des cellules de l'échantillon dans le fond.
8. Le tube en plastique est plus non plafonnés et le tube de verre plus petit est retiré verticalement par une pince sans déranger la couche de sédiments de cellules spécimen.
9. Le petit tube de verre est réfrigéré en position verticale pendant 15 minutes pour refroidir et se solidifier l'HG (figure 2.11).

Retrait du bloc cellulaire comme un bouton de gel avec un spécimen pour le traitement final

1. Le disque HG solidifié, avec la couche de concentré / sédiments spécimens au fond est délogé du tube de verre à fond plat en injectant formol à 10% grâce à une aiguille de calibre 23 avec la seringue (figure 2.12).
2. L'aiguille est insérée sur le côté du tube à la périphérie du disque de HG solidifié avec éprouvette (figure 2.12).
3. Le needle est tournée sur le côté du tube tout en formol est lentement poussé par la seringue. Il en résulte la séparation de la touche HG avec balise de couleur foncée AV-marqueur et le spécimen concentré dans ce fond plat de la du tube de verre (figure 2.12).
4. Le bloc de cellules (bouton de gel avec des cellules spécimen) est ensuite placé dans une cassette étiquetés et soumis pour le traitement des tissus à préparer des blocs de paraffine cellulaire embarqué (figure 2.13).

Intégration et la coupe de l'échantillon

1. Le disque est inclus dans la paraffine avec le côté sombre de marqueur balise bas que la surface de coupe (figure 1).
2. Le bloc est sectionné jusqu'à ce que la couleur foncée AV-marqueur comme un phare est exposée et visible.
3. Trois à quatre sections microns sont coupés de ce niveau qui devrait contenir la plupart des cellules dispersées individuellement à partir du spécimen.
4. Les coupes sont recueillies sur la lame de verre pour la coloration de loin, la coloration immunohistochimique, ou d'autres tests comme indiqué. Les protocoles de ces essais, y compris le type de diapositives à utiliser pour le montage des sections peuvent varier. Généralement pour immunocoloration, des lames recouvertes sont utilisés pour l'empêcher de flotter et de perte de sections de la glisse lors des étapes immunomarquage.

Abréviations utilisées (par ordre alphabétique): CISH, chromogène tests d'hybridation in situ; FISH, fluorescent tests d'hybridation in situ; FFPE, fixés au formol et inclus en paraffine; FNA, aspiration à l'aiguille fine; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, liquide cytologie; réaction PCR polymerase chain;

Figure 1. La structure du bloc cellulaire préparé par le protocole de Shidham.

Figure 2. Le résumé des différentes étapes de préparation du bloc cellulaire spécimen LBC par le protocole de Shidham.

Figure 3. Préparation d'AV-marqueur de pelures de banane.

Figure 4. Comparaison des blocs de cellules et sections, avec et sans AV-marqueur.

Figure 5. Comparaison des cellularité des sections du bloc cellulaire avec et sans AV-marqueur.

Discussion

Blocs cellulaires sont un outil précieux pour l'évaluation des différents échantillons de cytologie (1). Surtout, en plus des détails architecturaux de l'échantillon, les blocs cellulaires permettent l'évaluation des études auxiliaires tels que l'immunocytochimie, fluorescent / chromogène tests d'hybridation in situ (FISH / CISH) et in-situ de PCR. Une variété de méthodes pour la préparation du bloc cellulaire sont décrites. Cependant, la plupart d'entre eux sont adaptés pour les échantillons de cytologie non gynécologique qui contiennent des cellules relativement nombreuses et avec microfragments tissus tels que dans les aspirations FNA et certaines sérosités tels que les épanchements (1,3,4,5).

Parce que les blocs de cellules surtout l'occasion pour l'évaluation immunocytochimiques, leur traitement doit être de préférence similaire à celle de l'fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) des tissus. Finalement, les résultats obtenus après évaluation immunocytochimique de sections bloc cellulaire sont comparés à ceux de la littérature publiée réalisée principalement sur des coupes de tissus FFPE. Toute modification dans le protocole potentiellement compromettre et d'annuler la validité des résultats obtenus sur des blocs de cellules traitées par fixateurs différents et des séquences de réactifs autres que ceux utilisés pour la FFPE routine. Certaines techniques commerciales peuvent avoir l'inconvénient de traitement à travers un protocole d'exposition à d'autres fixateur-réactif exposition.

Diverses méthodes de préparation des blocs de cellules sont disponibles pour les spécimens avec une quantité importante de sédiments et de fragments de tissus. Principalement, les sédiments sont concentrées soutenu par un peu de gel ou d'un principe de coagulation. Le bouton manoeuvrable est alors inclus dans la paraffine après traitement, comme les spécimens de pathologie chirurgicale / biopsies.

Les gels utilisés comprennent la gélatine, l'agar, le fibrinogène / plasma-thrombine, et autres gels commerciaux tels que HG. Les méthodes de concentration varient de granulation simple des sédiments par centrifugation à la concentration de cellules le long de divers types de membranes. Les exemples incluent: Milipore, collodin (celloïdine) sacs ou racler les cellules du frottis cytologique sur lames de verre (1). Nous avons aussi évalué une variété de gels en essayant différentes combinaisons d'agar-agar et la gélatine. Aucune des combinaisons atteint la consistance d'une entreprise assez pour obtenir un disque facile à manœuvrer de gel solidifié avec des cellules intégrées de l'échantillon en un seul morceau. HG a montré une cohérence appropriée et dans notre expérience les résultats immunomarquage sur des sections de HG bloc cellulaire ont été excellents.

La cytologie liquide (LBC) pour la cytologie cervico spécimens sont généralement moins cellulaires que les non-gynécologiques spécimens comme mentionné plus haut. En outre, les spécimens gynécologiques LBC contiennent majoritairement individuels dispersés exfoliée cellules superficielles de la muqueuse cervico. Pour cette raison, la cellularité appropriées dans les sections bloc cellulaire ne peut être atteint sans une approche particulière. Comme ces seules éparpillées composants cellulaires dans le bloc de la ne peut pas être vu par le histotechnologist lors de la coupe la section, le niveau auquel les cellules commencent à apparaître dans les sections ne peuvent pas être appréciés et peuvent être oubliées, soit en coupant passé le niveau avec la plupart des cellules ou non couper assez profondément dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l'échantillon (figure 4). Protocole Shidham de traite à la fois de ces questions en utilisant HG que l'intégration des équipements de laboratoire moyen et conventionnelles (2) (figure 2).

Ce protocole comporte deux caractéristiques principales suivantes (figure 1):

1. Concentration et l'alignement des seules cellules dispersées dans un plan étroite adjacente et parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire (figure 5).
2. L'inclusion d'une balise de type sombres AV-marqueur comme un poteau indicateur. Cela est essentiel pour atteindre les caractéristiques suivantes:
   1. Identifier et surveiller le niveau auquel les cellules sont concentrées dans le bloc cellulaire. L'exposition du panneau de couleur foncée souligne le niveau auquel la plupart des cellules seules éparpillées dans le bloc cellulaire devraient être situés (figure 4). Cela empêche la surexploitation (découpe passé le niveau avec la plupart des cellules) ou une sous-cotation (ne pas couper assez profondément dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l'échantillon) dans le bloc cellulaire et permettre la sélection des sections du niveau dans le bloc cellulaire correspondant à la plus forte concentration des cellules.
   2. Le panneau de couleur foncée dans les sections sert aussi de point de référence pour l'enquête et identifier exactement les mêmes cellules dans les différentes sections de série du bloc cellulaire sur des lames différentes (figure 4). Cela est essentiel tout interpréter et évaluer les propriétés de coordonner immunoprofile telles des cellules notamment par l'approche SCIP à suivre les mêmes cellules dans les différentes sections (6,7).

Bien que ousr le protocole est normalisé et signalés pour liquide à base de spécimens cytologie cervicale, il peut également être utilisé pour améliorer le rendement diagnostique de nombreuses autres non gynécologique spécimens tels que des fluides épanchement, FNA, brossages, contenu du kyste etc En outre, le marqueur AV serait de faciliter l'amélioration application de l'approche SCIP lors de l'évaluation immunohistochimique de sections de bloc cellulaire de ces spécimens. Le milieu d'inclusion peuvent être remplacés par d'autres réactifs avec les modifications appropriées aux étapes pertinentes. HG peut être remplacée par du plasma (fibrinogène) pour être gélifiée par la thrombine à la température ambiante (1).