Summary
Shidham של שיטה להכנת קוביות תא עם סמן-AV מתוך דגימות ציטולוגיה המכיל תאים מפוזרים באופן פרטני ובקבוצות תאים קטנים.
Abstract
וידאו זה מדגים שיטה של Shidham להכנת קוביות התא מבוסס דגימות נוזל המכיל תאים ציטולוגיה cervicovaginal מפוזרים באופן פרטני ובקבוצות תאים קטנים. טכניקה זו משתמשת HistoGel (Thermo Scientific) עם ציוד מעבדה קונבנציונאלי.
השימוש בסעיפים לחסום התא הוא כלי עזר רב ערך לצורך הערכה של אי - גניקולוגיים ציטולוגיה. הם מאפשרים cytopathologist ללמוד הדגימה נוספים פרט מורפולוגיים כולל הארכיטקטורה של הנגע. והכי חשוב, הם מאפשרים הערכה של מחקרים נלווים כגון immunocytochemistry, ב-situ הכלאה בדיקות (דגים / CISH) ו-situ שרשרת פולימראז התגובה (PCR). מסורתית לחסום תא טכניקות הכנה יש בעיקר הוחל הלא גניקולוגיים דגימות ציטולוגיה, בדרך כלל נוזל השתפכויות הגוף בסדר השאיפה ביופסיות מחט.
דגימות נוזל cervicovaginal מבוססות יחסית הסלולר פחות מאשר עמיתיהם הלא גניקולוגיים שלהם עם הרבה תאים מפוזרים בודדים. בגלל זה, תאיות הולם בתוך התא לחסום חלקים קשה להשיג. בנוסף, histotechnologist חתך את גוש לא יכול לדמיין את הרמה שבה התאים הם בריכוז הגבוה ביותר. לכן, קשה לפקח על רמת המתאים שבו ניתן לזהות קטעים נבחרים שיועברו השקופיות זכוכית לבדיקה. כתוצאה מכך, באזור גוש תא עם התאים של עניין עלול לפספס, או על ידי חיתוך בעבר או לא לחתוך עמוק מספיק. פרוטוקול נוכחי השיטה של Shidham כתובות בנושאים אלה. אף על פי פרוטוקול זה טופל ודווח על גניקולוגיים דגימות נוזלי המבוסס ציטולוגיה, זה יכול להיות מיושם גם לא גניקולוגיים דגימות כגון נוזלים תפליט, FNA, כמברשות, תוכן וכו 'ציסטה עבור שיפור איכות החומר אבחון בסעיפים לחסום התא.
Protocol
מבוא:
זהו וידאו המתאר שיטה של Shidham להכנת תא לחסום מנוזל הדגימה מבוסס (LBC) ציטולוגיה באמצעות HistoGelTM (Thermo Scientific) (ג'). בהשוואה לגישות אחרות אקראי, להלן שתי תכונות קריטיות של פרוטוקול זה להכנת קוביות התא דגימות hypocellular יחסית רופף עם תאים מפוזרים ביחידות (1-5).
- פרוטוקול זה כולל צעדים כדי לרכז את התאים במישור המקביל לפני החנית של לחסום את התא.
- זה כולל גם הכללת מגדלור כמו האפל של AV-הסמן (איור 1b), אשר משרתת שתי המטרות הבאות:
- כדי להמחיש את הרמה שבה התאים מרוכזים. שטח לחסום את התא עם התאים של עניין עכשיו יכול להיות דמיינו ידי histotechnologist כאשר המשואה כהה נחשף במהלך החיתוך. זו היכולת לפקח שימנע אחד מן חיתוך דרך ברמה עם רוב התאים, או לא גזירה שטחית מדי את רמת עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים המדגם.
- כדי לשמש כנקודת התייחסות לאיתור בסעיף לחסום סדרתי תא בשקופיות שונים. זו נקודת ייחוס מעשים כמו מגדלור כדי לאתר תאים מסוימים או קבוצות של תאים להערכת דפוס immunoreactivity לתאם עם הגישה SCIP (6,7).
Protocol (איור 2)
הכנת המדגם.
- מעבירים את הדגימה שיורית LBC צוואר הרחם ציטולוגיה אל צינור זכוכית שטוחה בתחתית (בקוטר 15mm x 45mm) (איור 2.1 עד 2.4). מניחים את שפופרת זכוכית לתוך צינור פלסטיק גדול המוביל (28 x 85mm) ו צנטריפוגות. הסר את הצינור התחתון זכוכית מהצינור המוביל ויוצקים את supernatant.
- צינור הזכוכית הוא הכתיר אז (כדי למנוע דליפה של מים לחימום בשלב הבא) והניח פנימה הספק גדול יותר שטוח הצינור התחתון מפלסטיק
- פלסטיק המוביל צינור המכיל את שפופרת זכוכית הוא הכתיר אז, להציב צנטריפוגה (מסתובב עם כוסות ולא כוסות זווית קבועה כך התאים ליפול בניצב לתחתית שטוחה של צינור זכוכית), וסובב ב 1805 G (3000 rpms, רדיוס-17cm הרוטור) במשך חמש דקות (איור 2.5).
- צינורות יוסרו אז אנכית צנטריפוגה ואת שפופרת זכוכית קטנה יוסר עם מלקחיים של צינור פלסטיק גדול המוביל מבלי להפריע גלולה משקעים עם תאים.
- שפופרת זכוכית עם הדגימה הוא הסיר את המיכסה ואת supernatant היא ניגרה נזהרת שלא להפריע שכבה שטוחה של תאים משקעים בתחתית (איור 2.6).
הכללה של לתאם התייחסות AV-סמן והוספת ג'ל
- מגדלור כהה AV-הסמן (כ 2 מ"מ x 2 גודל מ"מ, על פני השטח שטוח, שבר של חומר אפל, בצבע sectionable) (איור 3) מתווסף כמו תמרור על צינור זכוכית (איור 2.7).
- לנזל aliquot של HG על ידי המסת אותו במיקרוגל למשך 10 שניות בהספק בינוני.
- הוסף 0.5 מ"ל של HG מותכת לערבב את הצינור, עם המשקע במהירות, לסכם אותו (איור 2.8) (המשך לשלב הבא מהר מבלי לאפשר HG להתחיל לחיזוק).
- הוסף על 2.5 מ"ל של חמה (45 ° C) מים בצינור פלסטיק המוביל (איור 2.9).
- שפופרת זכוכית קטנה כתרים ממוקם בתוך צינור פלסטיק עם מים חמים. (שלב זה הוא הכרחי כדי לשמור על HG מן לחיזוק במהלך הצעדים הבאים) (איור 2.9).
- צינור הפלסטיק המוביל ממוקם בצנטריפוגה (עם כוסות מסתובב ולא כוסות זווית קבועה כך התאים ליפול בניצב לתחתית שטוחה של צינור זכוכית), וסובב ב 1805 G (3000 rpms, רדיוס-17cm הרוטור) במשך חמש דקות. מטרת צעד זה צנטריפוגה היא לדחוף את הסמן AV-ולרכז את התאים בשכבה קרוב לפני השטח חיתוך של בלוק התא הסופי מוטבע פרפין (איור 1d).
- צינורות יוסרו ואז בעדינות אנכית בצנטריפוגה נזהרת שלא להפריע שכבה דקה משקעים עם תאים מדגם בתחתית.
- צינור פלסטיק גדול הוא הסיר את המיכסה ואת שפופרת זכוכית קטנה מוסר אנכית מבלי להפריע את שכבת משקעים של תאים הדגימה על ידי מלקחיים.
- שפופרת זכוכית קטנה בקירור במצב אנכי למשך 15 דקות להתקרר לחזק את HG (איור 2.11).
הסרת לחסום את התא כלחצן של ג'ל עם הדגימה לעיבוד הסופי
- הדיסק HG הקרושה, עם שכבה של הדגימה מרוכז / משקעים בתחתית הוא סולק מן הצינור התחתון שטוח זכוכית על ידי התזת 10% פורמלין באמצעות מחט מד 23 עם מזרק (איור 2.12).
- המחט מוחדרת בצד של הצינור בשולי הדיסק HG הקרושה עם הדגימה (איור 2.12).
- Needlדואר הוא הסתובב לצד של הצינור תוך פורמלין הוא דחף לאט דרך המזרק. התוצאה היא הפרדה של הלחצן HG יחד עם משואה כהה AV-סמן את הדגימה מרוכז בו מלמטה השטוח של צינור זכוכית (איור 2.12).
- גוש תאים (כפתור ג'ל עם תאים הדגימה) ממוקם אז קלטת שכותרתו הגיש עבור עיבוד רקמות להכין מוטבע פרפין תא אבני (איור 2.13).
הטבעה חיתוך של הדגימה
- הדיסק מוטבע פרפין עם הצד האפל סמן המשואה למטה כמו משטח חיתוך (איור 1).
- הבלוק מחולק עד הסמן-AV בצבע כהה כמו מגדלור הוא חשוף לעין.
- שלושה עד ארבעה מקטעים מיקרון נחתכים מרמה זו אשר צריכה להכיל רוב של תאים מפוזרים ביחידות מן הדגימה.
- סעיפים נאספים בשקופית זכוכית מכתים נוספת, מכתים immunohistochemical, או בדיקות אחרות כפי שצוין. הפרוטוקולים של בדיקות אלה לרבות סוג של שקופיות לשימוש הגובר בסעיפים עשוי להשתנות. בדרך כלל עבור immunostaining, מגלשות מצופה משמשים כדי למנוע הצפה ואובדן חלקים מן השקופיות במהלך השלבים immunostaining.
קיצורים המשמשים (לפי סדר אלפביתי): CISH, chromogenic ב-situ הכלאה בדיקות, דגים, פלורסנט ב-situ הכלאה בדיקות; FFPE, פורמלין, קבוע פרפין, מוטבע, FNA, השאיפה מחט דקה, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, ציטולוגיה המבוססת נוזלי; PCR תגובת שרשרת פולימרז;
באיור 1. מבנה התא לחסום שהוכן על ידי פרוטוקול של Shidham.
איור 2. סיכום של צעדים שונים להכנת לחסום התא הדגימה LBC על ידי פרוטוקול של Shidham.
איור 3. הכנת סמן-AV מן קליפות בננה.
איור 4. השוואה של בלוקים של תאים חלקים עם או בלי AV-הסמן.
איור 5. השוואה בין תאיות סעיפים של גוש תאים עם ובלי סמן-AV.
Discussion
בלוקים סלולריים הם כלי רב ערך לצורך הערכה של דגימות ציטולוגיה שונים (1). והכי חשוב, בנוסף את הפרטים האדריכליים של הדגימה, בלוקים תא לאפשר הערכה של מחקרים נלווים כגון immunocytochemistry, ניאון / chromogenic ב-situ הכלאה בדיקות (דגים / CISH) ו-situ PCR. מגוון שיטות להכנת לחסום התא מתוארים. עם זאת, רוב אלה מתאימים לא גניקולוגיים דגימות ציטולוגיה אשר מכילים תאים רבים יחסית עם microfragments רקמות כגון FNA aspirates וכמה נוזלים כגון השתפכויות הצפק (1,3,4,5).
מכיוון רחובות התא בעיקר לספק הזדמנות להערכה immunocytochemical, עיבוד שלהם רצוי להיות דומה לזה של פורמלין-קבוע פרפין, מוטבע (FFPE) ברקמות. בסופו של דבר התוצאות שהתקבלו לאחר הערכה immunocytochemical סעיפים לחסום סלולריים הם בהשוואה לאלו עם שפורסמו בספרות המדעית ובהם מבוצע בעיקר על קטעי רקמה FFPE. כל השינויים בפרוטוקול פוטנציאל פשרה לבטל את תוקפו של התוצאות שהושגו על בלוקים תא מעובד באמצעות fixatives שונים רצפים מגיב אחרת מזו המשמש FFPE שגרתית. כמה טכניקות מסחרי יכול להיות החיסרון של עיבוד באמצעות פרוטוקול החשיפה חשיפה מקבע, מגיב אחרת.
שיטות שונות של הכנה לחסום תא זמינים עבור דגימות עם כמות משמעותית של משקעים ושברי רקמות. בעיקר, במשקעים מרוכז נתמכים על ידי ג'ל חלק או עקרון קרישה. כפתור תמרון מוטבע אז לאחר עיבוד כמו דגימות לפתולוגיה / ביופסיה כירורגית פרפין.
ג'ל המשמש כוללים אגר ג'לטין, פיברינוגן / פלזמה תרומבין, וג'ל מסחריים אחרים כגון HG. שיטות ריכוז להשתנות pelleting פשוט המשקע על ידי צנטריפוגה ריכוז של תאים לאורך סוגים שונים של ממברנות. דוגמאות כוללות: Milipore, collodin (Celloidin) שקיות או מגרדים את התאים מן מריחות ציטולוגיה בשקופיות זכוכית (1). החוקרים העריכו גם מגוון רחב של ג'לים ידי מנסה שילובים שונים של אגר ואת הג'לטין. אף אחד השילובים להשיג את העקביות חברה מספיק כדי להשיג יכולת תמרון בקלות דיסק של ג'ל הקרושה עם תאים מוטבע מן הדגימה בחתיכה אחת. HG הראו עקביות המתאים בחוויה שלנו את התוצאות immunostaining על לחסום חלקים HG התא היה מעולה.
נוזלי מבוסס ציטולוגיה (LBC) דגימות עבור ציטולוגיה cervicovaginal הסלולר הם בדרך כלל פחות מאשר הלא גניקולוגיים דגימות כאמור לעיל. בנוסף, LBC דגימות גניקולוגיים בעיקר מכילים תאים בודדים פזורים שטחי מודבק מתוך רירית cervicovaginal. בגלל זה, תאיות המתאים בתוך התא לחסום חלקים לא ניתן להשיג ללא גישה מיוחדת. כמו אלה הפזורים ביחידות רכיבים סלולריים בבלוק לא ניתן לראות על ידי histotechnologist במהלך חיתוך קטע, ברמה שבה התאים יתחילו להופיע בחלקים לא יכול להיות מוערך ועלול לפספס, או על ידי חיתוך בעבר ברמה עם רוב התאים או לא חיתוך עמוק מספיק לתוך הרמה עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים מדגם (איור 4). פרוטוקול של Shidham כתובות שתי בעיות אלה באמצעות HG כמו הטבעה ציוד מעבדה בינוני קונבנציונאלי (2) (איור 2).
פרוטוקול זה כרוך הבאים שתי תכונות עיקריות (איור 1):
- ריכוז מערך של תאים מפוזרים ביחידות במטוס צר סמוך ובמקביל משטח חיתוך של גוש תא (איור 5).
- הכללה של סמן-AV מגדלור כמו כהה כמו תמרור. זה קריטי להשגת התכונות הבאות:
- זיהוי וניטור הרמה שבה התאים מרוכזים לחסום את התא. חשיפת שלט בצבע כהה מדגיש את הרמה שבה רוב התאים מפוזרים ביחידות בבלוק תא צפויים להיות ממוקם (איור 4). הדבר מונע overcutting (חיתוך בעבר ברמה עם רוב התאים) או undercutting (לא לחתוך עמוק מספיק לתוך הרמה עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים לדוגמה) כדי לחסום את התא ולאפשר מבחר קטעים מן הרמה הממוצעת של לחסום את התא המתאים עם הריכוז הגבוה ביותר של תאים.
- תמרור כהה בחלקים משמש גם כנקודת התייחסות לסקר ולזהות בדיוק את אותם תאים בחלקים שונים של סידורי לחסום את התא על שקופיות שונות (איור 4). זה קריטי תוך פרשנות והערכה של מאפייני לתאם immunoprofile כזה של תאים מסוימים על ידי הגישה SCIP לעקוב אחר תאים אותו בחלקים שונים (6,7).
למרות our הוא פרוטוקול סטנדרטי דיווח על בסיס דגימות נוזל ציטולוגיה צוואר הרחם, הוא גם יכול לשמש כדי לשפר את התשואה של אבחון רבים שאינם גניקולוגיים דגימות אחרות כגון נוזלים תפליט, FNA, כמברשות, תוכן הציסטה וכו 'בנוסף את הסמן AV יקל משופרת היישום של הגישה SCIP במהלך הערכה immunohistochemical סעיפים בלוק של דגימות תאים אלה. המדיום הטבעה עשוי להיות מוחלף על ידי חומרים כימיים אחרים עם שינויים מתאימים בכל הצעדים הרלוונטיים. HG עשוי להיות מוחלף על ידי פלזמה (פיברינוגן) להיות בג'ל על ידי טרומבין בטמפרטורת החדר (1).
Acknowledgments
המחברים מודים כריס Chartrand, HT (ASCP) עבור הוכחת את סעיף החנית של לחסום את התא עם הסמן AV.
References
- Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.
- Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).
- Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens. Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).
- Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy. CytoJournal. 5, 3-3 (2008).
- Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study. Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).
- Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).
- Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).
