Biology

सेल कोशिका विज्ञान नमूना से व्यक्तिगत रूप से बादलमय कक्ष की प्रबलता के साथ ब्लॉक तैयार

Published: July 21, 2009 doi: 10.3791/1316

¹Department of Pathology, University of Wisconsin - Milwaukee

Summary

Shidham ए.वी. मार्कर के साथ व्यक्तिगत रूप से बिखरे हुए कोशिकाओं और छोटे सेल समूहों युक्त कोशिका विज्ञान के नमूनों से सेल ब्लॉकों की तैयारी के लिए विधि.

Abstract

यह वीडियो Shidham तरल आधारित cervicovaginal कोशिका विज्ञान व्यक्तिगत रूप से बिखरे हुए कोशिकाओं और छोटे सेल समूहों युक्त नमूनों से सेल ब्लॉक की तैयारी के लिए विधि को दर्शाता है. यह तकनीक पारंपरिक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ HistoGel (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग करता है.

सेल ब्लॉक वर्गों के प्रयोग के गैर gynecologic कोशिका विज्ञान के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान सहायक उपकरण है. वे अतिरिक्त शब्द के भागों नमूना विस्तार से घाव की वास्तुकला सहित अध्ययन cytopathologist सक्षम. सबसे महत्वपूर्ण बात, वे immunocytochemistry के रूप में सहायक के अध्ययन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, में स्वस्थानी संकरण (मछली CISH /) परीक्षण और यथास्थान पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर). पारंपरिक सेल ब्लॉक तैयारी तकनीकों ज्यादातर गैर gynecologic कोशिका विज्ञान नमूनों को लागू किया गया है, आम तौर पर शरीर के तरल पदार्थ के बहाव और ठीक सुई आकांक्षा बायोप्सी के लिए.

तरल आधारित cervicovaginal नमूनों अपेक्षाकृत कम कई अलग अलग बिखरे हुए कोशिकाओं के साथ अपने गैर gynecologic समकक्षों की तुलना में सेलुलर रहे हैं. इस वजह से, सेल ब्लॉक वर्गों के भीतर पर्याप्त cellularity को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. इसके अलावा, सेक्शनिंग histotechnologist ब्लॉक स्तर पर जो कोशिकाओं के सर्वोच्च एकाग्रता में हैं कल्पना नहीं कर सकते हैं. इसलिए, यह उचित स्तर पर जो वर्गों को परीक्षण के लिए गिलास स्लाइड के लिए हस्तांतरित किया जा चयनित किया जा सकता है है की निगरानी करने के लिए मुश्किल है. एक परिणाम के रूप में, ब्याज की कोशिकाओं के साथ सेल ब्लॉक के क्षेत्र में पिछले काटने या काटने गहरी पर्याप्त नहीं द्वारा या तो, याद हो सकता है. Shidham विधि के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल इन मुद्दों के पते. हालांकि इस प्रोटोकॉल मानकीकृत और gynecologic तरल आधारित कोशिका विज्ञान के नमूनों के लिए सूचना दी है, यह भी बहाव तरल पदार्थ, FNA, brushings सेल ब्लॉक वर्गों में नैदानिक सामग्री की गुणवत्ता में सुधार के लिए, पुटी सामग्री आदि जैसे गैर gynecologic नमूनों को लागू किया जा सकता है.

Protocol

परिचय:

यह एक वीडियो सेल ब्लॉक तैयार करने के लिए तरल आधारित कोशिका विज्ञान (LBC) नमूना (थर्मो वैज्ञानिक) HistoGelTM (पारा) का उपयोग कर से Shidham विधि का वर्णन है. के रूप में अन्य यादृच्छिक दृष्टिकोण की तुलना में, निम्नलिखित अकेले बिखरे हुए ढीला कोशिकाओं (1-5) के साथ अपेक्षाकृत hypocellular नमूनों में से एक सेल ब्लॉक तैयार करने के लिए इस प्रोटोकॉल के दो महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं.

इस प्रोटोकॉल सेल ब्लॉक के काटने की सतह के समानांतर विमान के साथ कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करने के लिए कदम शामिल है.
यह भी बीकन की तरह ए वी (चित्रा 1b) मार्कर, एक अंधेरे शामिल किए जाने है जो निम्नलिखित उद्देश्यों के दो कार्य करता है शामिल हैं:
1. किस स्तर पर कोशिकाओं केंद्रित कर रहे हैं कल्पना करने के लिए. ब्याज की कोशिकाओं के साथ सेल ब्लॉक के क्षेत्र में अब histotechnologist द्वारा visualized किया जा सकता है जब काले रंग बीकन काटने के दौरान उजागर हो रहा है. यह क्षमता की निगरानी कोशिकाओं के अधिकांश के साथ स्तर के माध्यम से काटने, या नमूना कोशिकाओं के सर्वोच्च एकाग्रता के साथ नहीं काटने के स्तर में भी सतही से रोका जा सके.
2. विभिन्न स्लाइड्स पर धारावाहिक सेल ब्लॉक अनुभाग में लोकेटर संदर्भ बिंदु के रूप में सेवा करते हैं. इस संदर्भ बिंदु SCIP दृष्टिकोण (6,7) के साथ एक समन्वय immunoreactivity पैटर्न के मूल्यांकन के लिए कक्षों की विशेष कोशिकाओं या समूहों का पता लगाने में मदद करने के लिए एक बीकन के रूप में कार्य करता है.

(चित्रा 2) प्रोटोकोल

नमूने की तैयारी.

एक फ्लैट नीचे ग्लास ट्यूब (15mm व्यास 45mm x) (2.1 2.4 के माध्यम से चित्रा) अवशिष्ट LBC ग्रीवा कोशिका विज्ञान नमूना स्थानांतरण. एक बड़े प्लास्टिक वाहक (28 x 85mm) ट्यूब और अपकेंद्रित्र में ग्लास ट्यूब प्लेस. गिलास नीचे ट्यूब वाहक ट्यूब से निकालें और बंद सतह पर तैरनेवाला डाल.
ग्लास ट्यूब तो छाया हुआ है (अगले कदम में गर्म पानी के spillage को रोकने के) और एक बड़ा फ्लैट नीचे वाहक प्लास्टिक ट्यूब के अंदर वापस रखा
वाहक प्लास्टिक ग्लास ट्यूब युक्त ट्यूब तो छाया हुआ है, एक अपकेंद्रित्र में रखा (swiveling कप और नहीं तय कोण कप ग्लास ट्यूब के फ्लैट नीचे ताकि कोशिकाओं लंबरूप में गिर के साथ), और 1805 में जी (3000 rpms काता, रोटर पांच मिनट (2.5 चित्रा) के लिए 17cm त्रिज्या).
ट्यूबों अपकेंद्रित्र से तो खड़ी हटाया और छोटे ग्लास ट्यूब बड़ा वाहक प्लास्टिक ट्यूब से संदंश के साथ कोशिकाओं के साथ sedimented गोली परेशान बिना हटा दिया जाता है.
नमूना के साथ ग्लास ट्यूब uncapped और सतह पर तैरनेवाला बंद डाला ख्याल रख रही तलछट कोशिकाओं के तल पर फ्लैट परत (2.6 चित्रा) परेशान नहीं है.

संदर्भ ए.वी. मार्कर समन्वय के समावेश और जेल के अलावा

एक अंधेरे बीकन AV-मार्कर (के बारे में 2 मिमी एक्स 2 मिमी आकार, फ्लैट सतह, काले रंग sectionable सामग्री का टुकड़ा) (चित्रा 3) ग्लास ट्यूब के लिए एक पताका का स्तंभ (2.7 चित्रा) के रूप में जोड़ा जाता है.
यह 10 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में मध्यम शक्ति पर पिघलने से पारा के एक विभाज्य दव्र बनाना.
तलछट के साथ ट्यूब मिश्रण, जल्दी पिघला हुआ पारा के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और यह संक्षिप्त (2.8 चित्रा) (पारा solidifying शुरू करने के लिए अनुमति के बिना जल्दी से अगले कदम के लिए आगे बढ़ें).
के बारे में 2.5 मिलीलीटर जोड़ें गर्म (45 डिग्री सेल्सियस) पानी वाहक प्लास्टिक ट्यूब (2.9 चित्रा).
छोटे छाया ग्लास ट्यूब के गर्म पानी के साथ प्लास्टिक की ट्यूब के अंदर रखा गया है. (यह कदम करने के लिए अगले चरणों के दौरान solidifying से पारा रखने के लिए आवश्यक है) (2.9 चित्रा).
वाहक प्लास्टिक ट्यूब अपकेंद्रित्र में रखा गया है (swiveling कप और नहीं तय कोण कप ग्लास ट्यूब के फ्लैट नीचे ताकि कोशिकाओं लंबरूप में गिर के साथ), और 1805 में पांच जी (3000 rpms, रोटर त्रिज्या-17cm) काता मिनट. इस centrifugation कदम के प्रयोजन के लिए मार्कर ए.वी. धक्का और एक परत में कोशिकाओं को अंतिम आयल एम्बेडेड सेल ब्लॉक (चित्रा 1 दिन) के काटने की सतह के करीब ध्यान केंद्रित है.
ट्यूब तो ख्याल रख रही sedimented पतली परत नीचे में नमूना कोशिकाओं के साथ परेशान नहीं अपकेंद्रित्र से धीरे हटा दिया और खड़ी है.
बड़े प्लास्टिक ट्यूब uncapped है और छोटे ग्लास ट्यूब खड़ी एक संदंश द्वारा नमूना कोशिकाओं की तलछट परत परेशान के बिना हटा दिया जाता है.
15 मिनट के लिए शांत और पारा (2.11 चित्रा) जमना ऊर्ध्वाधर स्थिति में छोटे ग्लास ट्यूब प्रशीतित है.

नमूना के साथ जेल के एक बटन के रूप में सेल ब्लॉक के अंतिम प्रसंस्करण के लिए निकालना

जम तल पर ध्यान केंद्रित / तलछट नमूना की परत के साथ पारा डिस्क, फ्लैट नीचे ग्लास ट्यूब से सिरिंज (2.12 चित्रा) के साथ एक 23 गेज सुई के माध्यम से 10 formalin% squirting से उखाड़ फेंकना है.
सुई नमूना (2.12 चित्रा) के साथ जम पारा डिस्क की परिधि में ट्यूब के पक्ष के साथ डाला जाता है.
needlई ट्यूब के पक्ष के साथ घुमाया गया है जबकि formalin धीरे सिरिंज के माध्यम से धक्का दिया है. काले रंग AV-मार्कर बीकन और फ्लैट ग्लास ट्यूब के नीचे (चित्रा 2.12) से यह केंद्रित नमूना के साथ पारा बटन की जुदाई में यह परिणाम है.
सेल ब्लॉक (नमूना कोशिकाओं के साथ जेल बटन) तो एक लेबल कैसेट में रखा जाता है और ऊतक प्रसंस्करण के लिए प्रस्तुत करने के लिए आयल एम्बेडेड सेल ब्लॉक (चित्रा 2.13) तैयार है.

एम्बेड और नमूना के काटने

डिस्क काटने की सतह के रूप में अंधेरे बीकन मार्कर के नीचे की ओर (चित्रा 1) के साथ आयल में एम्बेडेड है.
ब्लॉक काले रंग ए.वी. मार्कर तक sectioned एक बीकन के रूप में उजागर किया है और स्पष्ट रूप से दिखाई दे.
तीन से चार माइक्रोन वर्गों जो नमूना से अकेले बिखरे हुए कोशिकाओं की सबसे शामिल करना चाहिए इस स्तर से काट रहे हैं.
वर्गों आगे धुंधला हो जाना, immunohistochemical धुंधला हो जाना, या अन्य परीक्षण के रूप में संकेत के लिए गिलास स्लाइड पर एकत्र कर रहे हैं. स्लाइड्स बढ़ते वर्गों के लिए उपयोग के प्रकार सहित इन परीक्षणों के लिए प्रोटोकॉल भिन्न हो सकते हैं. आम तौर पर immunostaining के लिए, लेपित स्लाइड्स immunostaining चरणों के दौरान स्लाइड्स से वर्गों के अस्थायी और हानि को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है.

लघुरूप (वर्णमाला क्रम में): CISH, में स्वस्थानी संकरण परीक्षण chromogenic, मछली, प्रतिदीप्त में स्वस्थानी संकरण परीक्षण; FFPE, formalin-तय आयल एम्बेडेड; FNA, ठीक सुई आकांक्षा, पारा, HistoGel ™ (थर्मो वैज्ञानिक); पीसीआर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, LBC, तरल आधारित कोशिका विज्ञान;

1 आंकड़ा
चित्रा 1 सेल ब्लॉक की संरचना Shidham प्रोटोकॉल द्वारा तैयार की.

चित्रा 2. LBC नमूना से Shidham प्रोटोकॉल द्वारा सेल ब्लॉक तैयार करने के लिए विभिन्न चरणों का सारांश.

चित्रा 3 केले peels से ए.वी. मार्कर की तैयारी.

आंकड़ा 4
चित्रा 4 के साथ और AV-मार्कर के बिना सेल ब्लॉक और वर्गों की तुलना.

चित्रा 5 सेल ब्लॉक के वर्गों के cellularity AV-मार्कर के साथ और बिना तुलना.

Discussion

सेल ब्लॉक विभिन्न कोशिका विज्ञान नमूनों (1) के मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, नमूना के वास्तु विवरण अलावा, सेल ब्लॉक immunocytochemistry के रूप में सहायक अध्ययन, फ्लोरोसेंट / chromogenic में स्वस्थानी संकरण (मछली CISH /) परीक्षण और पीसीआर में सीटू के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं. सेल ब्लॉक की तैयारी के लिए तरीकों की एक किस्म में वर्णित हैं. हालांकि, इनमें से ज्यादातर गैर gynecologic कोशिका विज्ञान नमूनों जो अपेक्षाकृत कई कोशिकाओं होते हैं और जैसे FNA रेस्पायरेट्रस में ऊतक microfragments और बहाव (1,3,4,5) के रूप में कुछ तरल तरल पदार्थ के साथ के लिए उपयुक्त हैं.

क्योंकि सेल ब्लॉक मुख्य रूप से immunocytochemical मूल्यांकन के लिए अवसर प्रदान करते हैं, उनके प्रसंस्करण अधिमानतः formalin निर्धारित पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों के समान होना चाहिए. अंततः सेल ब्लॉक वर्गों के immunocytochemical मूल्यांकन के बाद प्राप्त परिणामों को प्रकाशित साहित्य FFPE ऊतक वर्गों पर मुख्य रूप से प्रदर्शन के साथ उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं. प्रोटोकॉल में कोई परिवर्तन संभावित समझौता और विभिन्न fixatives और अभिकर्मक दिनचर्या FFPE के लिए इस्तेमाल किया है कि तुलना में अन्य दृश्यों के माध्यम से संसाधित सेल ब्लॉक पर प्राप्त परिणामों की वैधता को उठा देना. कुछ व्यावसायिक तकनीकों अन्य जोखिम लगानेवाला - अभिकर्मक के लिए जोखिम के एक प्रोटोकॉल के माध्यम से प्रसंस्करण का दोष हो सकता है.

सेल ब्लॉक की तैयारी के विभिन्न तरीकों तलछट और ऊतक के टुकड़े के एक महत्वपूर्ण मात्रा के साथ नमूनों के लिए उपलब्ध हैं. मुख्यतः, केंद्रित अवसादों कुछ जेल या जमावट सिद्धांत के द्वारा समर्थित हैं. maneuverable बटन तब शल्य चिकित्सा विकृति नमूनों / बायोप्सी की तरह प्रसंस्करण के बाद आयल में एम्बेडेड है.

इस्तेमाल किया जैल जिलेटिन, अगर, फाइब्रिनोजेन / प्लाज्मा थ्रोम्बिन, और पारा जैसे अन्य वाणिज्यिक जैल शामिल हैं. एकाग्रता के तरीकों centrifugation द्वारा तलछट के सरल pelleting से झिल्ली के विभिन्न प्रकार के साथ कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए बदलती हैं. उदाहरणों में शामिल हैं: Milipore, collodin (Celloidin) बैग या गिलास स्लाइड (1) कोशिका विज्ञान स्मीयरों कोशिकाओं से scraping. हम भी अगर और जिलेटिन के विभिन्न संयोजनों की कोशिश कर रहा द्वारा जैल की एक किस्म का मूल्यांकन किया है. संयोजनों की कोई भी एक फर्म पर्याप्त स्थिरता हासिल नमूना से एक टुकड़ा में एम्बेडेड कोशिकाओं के साथ जम जेल के एक आसानी से maneuverable डिस्क प्राप्त करने के लिए. पारा उपयुक्त निरंतरता दिखाया और हमारे अनुभव में पारा सेल ब्लॉक वर्गों पर immunostaining परिणाम उत्कृष्ट रहा है.

Cervicovaginal कोशिका विज्ञान के लिए तरल आधारित कोशिका विज्ञान (LBC) नमूनों आम तौर पर कर रहे हैं गैर - gynecologic नमूनों की तुलना में कम सेलुलर उपरोक्त के रूप में. इसके अलावा, gynecologic LBC नमूनों को मुख्य रूप से अलग - अलग बिखरे हुए cervicovaginal mucosa से exfoliated सतही कोशिकाओं होते हैं. इस के कारण, सेल ब्लॉक वर्गों के भीतर उचित cellularity एक विशेष दृष्टिकोण के बिना हासिल नहीं हो सकता है. के रूप में इन अकेले ब्लॉक में सेलुलर घटकों बिखरे हुए अनुभाग काटने के दौरान histotechnologist द्वारा नहीं देखा जा सकता है, किस स्तर पर कोशिकाओं को वर्गों में प्रदर्शित होने शुरू नहीं किया जा सराहना याद किया जा सकता है सबसे कोशिकाओं के साथ स्तर पिछले काटने के द्वारा या नहीं कर सकते हैं, स्तर में काफी गहरी नमूना कोशिकाओं के सर्वोच्च एकाग्रता (चित्रा 4) के साथ काट. Shidham प्रोटोकॉल इन मध्यम और पारंपरिक प्रयोगशाला (2) उपकरणों (चित्रा 2) एम्बेडिंग के रूप में पारा उपयोग मुद्दों के दोनों पते.

इस प्रोटोकॉल दो प्रमुख विशेषताएं (चित्रा 1) के बाद शामिल हैं:

आसन्न और सेल ब्लॉक (चित्रा 5) के काटने की सतह के समानांतर एक संकीर्ण विमान में अकेले बिखरे हुए कोशिकाओं की एकाग्रता और संरेखण.
बीकन की तरह एक पताका का स्तंभ के रूप में एक अंधेरे AV-मार्कर का समावेश है. यह निम्न सुविधाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है:
1. पहचान करना और किस स्तर पर कोशिकाओं के सेल ब्लॉक में केंद्रित कर रहे हैं की निगरानी काले रंग की पताका का स्तंभ के जोखिम का स्तर है जिस पर सेल ब्लॉक में अकेले बिखरे हुए कोशिकाओं की सबसे करने के लिए (चित्रा 4) स्थित होने की उम्मीद कर रहे हैं पर प्रकाश डाला गया. रोकता overcutting (स्तर पिछले काटने सबसे कोशिकाओं के साथ) या सेल ब्लॉक में कीमतें गिरा (नमूना कोशिकाओं के सर्वोच्च एकाग्रता के साथ नहीं काटने स्तर में काफी गहरे) और सेल सर्वोच्च एकाग्रता के साथ इसी ब्लॉक में स्तर से वर्गों के चयन की अनुमति कक्षों की.
2. वर्गों में काले रंग की पताका का स्तंभ भी एक संदर्भ बिंदु के लिए सर्वेक्षण और विभिन्न स्लाइड पर सेल ब्लॉक (चित्रा 4) के विभिन्न धारावाहिक वर्गों में बिल्कुल वैसा ही कोशिकाओं की पहचान के रूप में कार्य करता है. यह महत्वपूर्ण है जबकि व्याख्या और समन्वय गुणों का मूल्यांकन SCIP दृष्टिकोण से विशेष कोशिकाओं की ऐसी immunoprofile विभिन्न वर्गों (6,7) में एक ही कोशिकाओं का पालन करने के लिए.

हालांकि कहांआर प्रोटोकॉल मानकीकृत और तरल आधारित ग्रीवा कोशिका विज्ञान के नमूनों के लिए सूचना दी है, यह भी इसके अलावा कई बहाव तरल पदार्थ, FNA, brushings, पुटी सामग्री आदि जैसे अन्य गैर gynecologic नमूनों का निदान उपज बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ए.वी. मार्कर सुधार सुविधा होगी इन नमूनों की सेल ब्लॉक वर्गों के immunohistochemical मूल्यांकन के दौरान SCIP दृष्टिकोण के आवेदन. एम्बेडिंग मध्यम प्रासंगिक कदम पर उचित संशोधनों के साथ अन्य अभिकर्मकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. पारा (फाइब्रिनोजेन) प्लाज्मा थ्रोम्बिन द्वारा कमरे के तापमान (1) gelled द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

Acknowledgments

लेखकों ए.वी. मार्कर के साथ सेल ब्लॉक के काटने अनुभाग का प्रदर्शन करने के लिए धन्यवाद क्रिस चर्त्रंद, हिंदुस्तान टाइम्स (ASCP).

References

Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.
Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).
Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens. Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).
Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy. CytoJournal. 5, 3-3 (2008).
Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study. Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).
Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).
Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).