Cellule preparazione del blocco da campioni Citologia con predominanza di cellule sparse individualmente

Summary

Shidham metodo per la preparazione di blocchi di celle con AV-marker da campioni citologici contenenti cellule individuali e gruppi sparsi a piccole cellule.

Abstract

Questo video dimostra metodo Shidham per la preparazione di blocchi di celle da campioni di liquido a base di citologia cervico-vaginali contenenti cellule individuali e gruppi sparsi a piccole cellule. Questa tecnica utilizza HistoGel (Thermo Scientific) con attrezzature di laboratorio convenzionali.

L'uso di sezioni di blocco cellulare è uno strumento prezioso accessorio per la valutazione della non-ginecologiche citologia. Esse permettono di studiare citopatologo ulteriori dettagli morfologici campione compresa l'architettura della lesione. Più importante, consentono per la valutazione degli studi ancillari, quali immunocitochimica, in prove di ibridazione in situ (FISH / CISH) e in situ di reazione a catena della polimerasi (PCR). Tradizionali tecniche di preparazione delle cellule blocco sono stati per lo più applicate ai vettori non ginecologica campioni citologici, di solito per effusioni liquidi corporei e aspirazione con ago sottile biopsie.

I campioni di liquido a base cervico-vaginali sono relativamente meno rispetto ai loro cellulari non-ginecologica controparti con molte singole celle sparse. Per questo motivo, cellularità adeguata all'interno delle sezioni blocco di celle è difficile da raggiungere. Inoltre, il histotechnologist sezionamento del blocco non è possibile visualizzare il livello al quale le cellule sono a più alta concentrazione. Pertanto, è difficile monitorare il livello appropriato in cui le sezioni possono essere selezionati per essere trasferito al vetrini per il test. Di conseguenza, l'area del blocco di celle con le cellule di interesse può mancare, sia per il taglio del passato o non taglio abbastanza profondo. Attuale protocollo per il metodo Shidham affronta questi temi. Anche se questo protocollo è standardizzato e riportato per ginecologiche campioni citologici liquido a base, può essere applicato anche ai non-ginecologiche esemplari, come i fluidi effusione, FNA, brushings, cisti ecc contenuti per una migliore qualità del materiale diagnostico nelle sezioni blocco di celle.

Protocol

Introduzione:

Questo è un video che descrive il metodo Shidham per la preparazione del blocco delle cellule da liquido a base di citologia (LBC) campione usando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Rispetto ad altri approcci casuali, i seguenti sono le due caratteristiche fondamentali di questo protocollo per la preparazione di blocchi di celle da campioni relativamente ipocellulare singolarmente con cellule sparse sciolti (1-5).

1. Questo protocollo prevede passi per concentrare le cellule lungo il piano parallelo alla superficie di taglio del blocco di celle.
2. Esso include anche un faro, quali l'inserimento oscuro della AV-marker (Figura 1b), che serve due delle seguenti finalità:
   1. Per visualizzare il livello al quale si concentrano le cellule. L'area del blocco di celle con le cellule di interesse ora possono essere visualizzate dal histotechnologist quando il faro di colore scuro è esposto durante il taglio. Questa capacità di monitorare impedirvi dal taglio attraverso il livello con la maggior parte delle cellule, o non tagliare troppo superficiale nel livello con più alta concentrazione di cellule del campione.
   2. Per servire come punto di riferimento localizzatore nella sezione seriale blocco di celle su diverse diapositive. Questo punto di riferimento agisce come un faro per aiutare a localizzare le cellule o gruppi di cellule per la valutazione di un modello di immunoreattività coordinare con l'approccio SCIP (6,7).

PROTOCOLLO (Figura 2)

Preparazione del campione.

1. Trasferire il residuo LBC campione citologia cervicale ad un tubo di vetro piano inferiore (15mm x 45mm di diametro) (Figura 2.1 a 2.4). Posizionare il tubo di vetro in un tubo di plastica più grandi carrier (28 x 85 millimetri) e centrifugare. Rimuovere il tubo fondo di vetro dal tubo portante e versare il sopranatante.
2. Il tubo di vetro viene poi ridotta (per evitare la fuoriuscita di acqua di riscaldamento nel passaggio successivo) e rimesso all'interno di un più ampio piatto tubo di plastica vettore fondo
3. Il tubo di plastica vettore contenente il tubo di vetro sono state limitate, posto in una centrifuga (con coppe girevole e non tazze angolo fisso in modo che le cellule cadono perpendicolarmente al fondo piatto del tubo di vetro), e mi sono girato a 1805 g (3000 rpm, rotore raggio-17cm) per cinque minuti (Figura 2.5).
4. I tubi vengono poi rimossi verticalmente dalla centrifuga e il tubo di vetro più piccolo viene rimosso con una pinza dal tubo portante più grandi di plastica senza disturbare il pellet sedimentato con le cellule.
5. Il tubo di vetro con il campione è non ridotti e il sopranatante è versata via facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule piatte sedimento sul fondo (Figura 2.6).

Inserimento delle coordinate di riferimento AV-marker e l'aggiunta di gel

1. Un faro scuro AV-marker (circa 2 mm x 2 mm di diametro, superficie piana, frammento di colore scuro, materiale sezionabili) (Figura 3) si aggiunge come indicatore di percorso per il tubo di vetro (Figura 2.7).
2. Liquefare una aliquota di HG dalla fusione in forno a microonde per 10 secondi a media potenza.
3. Aggiungere 0,5 ml di HG fuso al mix tubo, con il sedimento in fretta, e ricapitolare (Figura 2.8) (Procedere alla fase successiva in fretta senza che il HG per iniziare la solidificazione).
4. Aggiungere circa 2,5 ml di caldo (45 ° C) per il tubo di plastica vettore (Figura 2.9).
5. Il tubo più piccolo di vetro con tappo viene inserito all'interno del tubo di plastica con acqua calda. (Questo passaggio è necessario per mantenere il HG dalla solidificazione durante le fasi successive) (Figura 2.9).
6. Il tubo di plastica vettore è posizionato nella centrifuga (con coppe girevole e non tazze angolo fisso in modo che le cellule cadono perpendicolarmente al fondo piatto del tubo di vetro), e mi sono girato a 1805 g (3000 rpm, raggio di 17 centimetri-rotore) per cinque minuti. Lo scopo di questa fase di centrifugazione è quello di spingere l'AV-marker e di concentrare le cellule in uno strato più vicino alla superficie di taglio della finale blocco di celle paraffina (Figura 1d).
7. I tubi vengono poi rimossi con delicatezza e verticalmente dalla centrifuga facendo attenzione a non disturbare il sottile strato sedimentato con le cellule del campione in basso.
8. Il tubo di plastica più grande è non ridotti e il tubo di vetro più piccolo viene rimosso verticalmente da una pinza senza disturbare lo strato di sedimento di cellule campione.
9. Il piccolo tubo di vetro viene refrigerato in posizione verticale per 15 minuti per raffreddare e solidificare la HG (Figura 2.11).

La rimozione del blocco di celle come un pulsante di gel con il campione per l'elaborazione finale

1. Il disco HG solidificato, con lo strato di concentrato / sedimento del campione in basso è staccata dal tubo di vetro piano inferiore da spruzzando formalina al 10% attraverso un ago 23 gauge con la siringa (Figura 2.12).
2. L'ago viene inserito lungo il lato del tubo alla periferia del disco solidificato HG con il campione (Figura 2.12).
3. Il needle viene ruotato lungo il lato del tubo mentre formalina sta lentamente spinto attraverso la siringa. Il risultato è la separazione del pulsante HG insieme a faro di colore scuro AV-marker e il campione concentrato in essa dal fondo piatto del tubo di vetro (Figura 2.12).
4. Il blocco di celle (tasto gel con le cellule del campione) è poi messo in una cassetta etichettati e presentati per la lavorazione dei tessuti per preparare blocchi di celle paraffina (Figura 2.13).

Incorporare e il taglio del campione

1. Il disco è incluso in paraffina con il lato oscuro marcatore faro giù come superficie di taglio (Figura 1).
2. Il blocco viene sezionato fino a quando il colore scuro AV-marker come un faro è esposta e ben visibile.
3. Da tre a quattro sezioni micron vengono tagliate da questo livello che dovrebbe contenere la maggior parte delle cellule singolarmente disperse dal campione.
4. Le sezioni sono raccolte sul vetrino per la colorazione ulteriormente, immunoistochimica, o altri test come indicato. I protocolli per questi test tra cui il tipo di diapositive da utilizzare per il montaggio delle sezioni possono variare. Generalmente per immunostaining, vetrini rivestiti sono utilizzati per prevenire la perdita di galleggiamento e sezioni dal diapositive durante le fasi immunocolorazione.

Abbreviazioni utilizzate (in ordine alfabetico): CISH, cromogenico in situ test di ibridazione, PESCE, fluorescente in situ test di ibridazione; FFPE, fissate in formalina e inclusi in paraffina, FNA, agoaspirato, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, citologia in fase liquida; reazione a catena della polimerasi PCR;

Figura 1. La struttura del blocco di celle preparato dal protocollo di Shidham.

Figura 2. La sintesi delle diverse fasi per la preparazione di blocco di celle da un campione LBC dal protocollo di Shidham.

Figura 3. Preparazione di AV-marker da bucce di banana.

Figura 4. Confronto di blocchi di celle e sezioni con e senza AV-marker.

Figura 5. Confronto di cellularità sezioni di blocco di celle con e senza AV-marker.

Discussion

Blocchi di cellule rappresentano un prezioso strumento per la valutazione dei campioni citologici vari (1). Ancora più importante, oltre ai particolari architettonici del campione, blocchi di celle permettere una valutazione degli studi di accessori, quali immunocitochimica, fluorescente / cromogenico in prove di ibridazione in situ (FISH / CISH) e in situ PCR. Una varietà di metodi per la preparazione del blocco di celle sono descritti. Tuttavia, la maggior parte di questi sono adatti per i non-ginecologica campioni citologici che contengono le cellule relativamente molti e con microfragments tissutale, come nel aspirati FNA e alcuni fluidi sierosi come effusioni (1,3,4,5).

Perché blocchi di celle principalmente offrono l'opportunità per la valutazione immunocitochimica, al loro trattamento dovrebbe preferibilmente essere simile a quello della paraffina fissati in formalina-embedded (FFPE) tessuti. In definitiva i risultati ottenuti dopo la valutazione immunocitochimica delle sezioni blocco di celle vengono confrontati con quelli con la letteratura pubblicata effettuato prevalentemente su sezioni di tessuto FFPE. Qualsiasi modifica nel protocollo potenzialmente compromesso e annullare la validità dei risultati ottenuti sui blocchi di celle trattati attraverso fissativi diversi e sequenze di reagenti diversi da quelli utilizzati per FFPE di routine. Alcune tecniche commerciali può avere l'inconveniente di elaborazione attraverso un protocollo di esposizione ad altri fissativo-reagente esposizione.

Vari metodi di preparazione delle cellule di blocco sono disponibili per i campioni con una quantità significativa di sedimenti e frammenti di tessuto. Principalmente, i sedimenti concentrato sono supportate da alcuni gel o principio della coagulazione. Il pulsante maneggevole è poi inclusi in paraffina dopo l'elaborazione, come i campioni di patologia chirurgica / biopsie.

I gel utilizzati includono gelatina, agar, fibrinogeno / plasma-trombina, e altri gel commerciali come HG. I metodi di concentrazione varia da cubettatura semplice dei sedimenti per centrifugazione della concentrazione di cellule lungo i vari tipi di membrane. Gli esempi includono: Milipore, collodin (celloidina) borse o raschiare le cellule dalla prelievi citologici su vetrini (1). Abbiamo anche valutato una serie di gel provando diverse combinazioni di agar e gelatina. Nessuna delle combinazioni raggiunto la consistenza sufficiente all'azienda di ottenere un disco facilmente manovrabile di gel solidificato con cellule incorporato dal campione in un unico pezzo. HG ha dimostrato coerenza appropriato e nella nostra esperienza i risultati immunostaining su sezioni di cellule HG blocco sono stati eccellenti.

Liquido a base di citologia (LBC) i campioni per la citologia cervico-vaginali sono generalmente meno cellulari rispetto ai non-ginecologiche i campioni di cui sopra. Inoltre, i campioni LBC ginecologico prevalentemente contenere singoli sparsi cellule di esfoliazione superficiale di mucosa cervico-vaginali. A causa di questo, cellularità appropriata nelle sezioni bloccare la cella non può essere raggiunto senza un approccio particolare. Poiché questi singolarmente disperse componenti cellulari nel blocco non può essere visto dal histotechnologist durante il taglio sezione, il livello al quale le cellule iniziano ad apparire in sezioni non può essere apprezzato e può perdere, sia per il taglio oltre il livello con la maggior parte delle cellule o no taglio abbastanza in profondità nel livello con più alta concentrazione di cellule del campione (Figura 4). Protocollo Shidham affronta entrambi questi problemi utilizzando HG come incorporare attrezzature di laboratorio di media e convenzionale (2) (Figura 2).

Questo protocollo prevede le seguenti due caratteristiche principali (Figura 1):

1. Concentrazione e l'allineamento dei singolarmente cellule sparse in un piano stretto adiacente e parallela alla superficie di taglio del blocco di celle (Figura 5).
2. L'inclusione di un faro simil-AV-scuro come un cartello indicatore. Questo è fondamentale per ottenere le seguenti caratteristiche:
   1. Identificare e monitorare il livello al quale si concentrano le cellule nel blocco celle. L'esposizione del cartello di colore scuro mette in evidenza il livello al quale ci si aspetta la maggior parte delle cellule singolarmente sparsi nel blocco delle celle di trovarsi (Figura 4). In questo modo il sovrataglio (taglio oltre il livello con la maggior parte delle cellule) o inferiori (non tagliare abbastanza in profondità nel livello con più alta concentrazione di cellule campione) per il blocco delle cellule e permettono la selezione delle sezioni dal livello nel blocco cella corrispondente con la massima concentrazione delle cellule.
   2. Il cartello di colore scuro in sezioni serve anche come punto di riferimento di indagine e di identificare esattamente le stesse cellule in diverse sezioni di serie del blocco di celle su diapositive diverse (Figura 4). Questo è fondamentale, mentre interpretare e valutare le proprietà coordinare immunoprofile tali cellule particolare l'approccio SCIP a seguire le stesse cellule in diverse sezioni (6,7).

Sebbene our protocollo è standardizzato e riportato per i campioni di liquido a base di citologia cervicale, ma può anche essere utilizzata per migliorare resa diagnostica di molti altri non-ginecologiche esemplari, come i fluidi effusione, FNA, brushings, contenuti cisti ecc Inoltre il marcatore AV faciliterebbe una migliore applicazione di approccio SCIP durante la valutazione immunoistochimica di sezioni blocco di celle di questi esemplari. Il mezzo di inclusione può essere sostituito da altri reagenti con le opportune modifiche a passi rilevanti. HG può essere sostituito da plasma (fibrinogeno) da gelificato con trombina a temperatura ambiente (1).