Cell Block получение из цитологии образцов с преобладанием индивидуально отдельные клетки

Summary

Shidham это метод получения клеточных блоков с AV-маркер из образцов, содержащих цитологии индивидуально рассеянных элементов и малых группах клеток.

Abstract

Это видео демонстрирует метод Shidham для подготовки клеточных блоков из жидкости на основе образцов цервиковагинальных цитологии содержащие индивидуально рассеянных элементов и малых группах клеток. Эта техника использует HistoGel (Thermo Scientific) с обычным лабораторным оборудованием.

Использование разделов ячейки блока ценным вспомогательным инструментом для оценки не-гинекологической цитологии. Они позволяют cytopathologist изучать дополнительные морфологические подробно образца в том числе архитектура поражения. Самое главное, они позволяют оценка вспомогательных исследований, таких как иммуноцитохимия, на месте гибридизация тесты (FISH / CISH) и на месте полимеразной цепной реакции (ПЦР). Традиционные методы подготовки блока ячейки в основном были применены к не-гинекологической цитологии образцов, как правило, для излияния жидкости организма и тонкой биопсия аспирационная биопсия.

Жидкостная цервиковагинальных образцов относительно менее сотовые, чем их не-гинекологической коллеги с большим количеством отдельных рассеянных клеток. Из-за этого, адекватное клеточности внутри клетки разделах блока трудно достичь. Кроме того, histotechnologist секционирования блок не может визуализировать уровня, при котором клетки находятся на самом высоком концентрации. В связи с этим трудно контролировать соответствующего уровня, на какие разделы могут быть выбраны для быть переданы стеклах для тестирования. В результате, площадь ячейки блока с клетками проценты могут быть упущены, либо за счет сокращения прошлом или не резки достаточно глубоко. Текущий протокол для метода Shidham уделяется внимание этим вопросам. Хотя этот протокол является стандартным и сообщил для гинекологических жидкости на основе образцов цитологии, он может быть применен и к не-гинекологической образцов, таких как выпот жидкости, FNA, щеткой и т.д. содержимое кисты для улучшения качества диагностических материалов в разделах ячейки блока.

Protocol

Введение:

Это видео описании метода Shidham для ячейки блока препарат из жидкого цитология (LBC) образец использования HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). По сравнению с другими случайными подходы, следующие два важнейших особенностей этого протокола для приготовления клеточных блоков из относительно hypocellular образцов с однократно рассеянного свободные клетки (1-5).

1. Этот протокол включает в себя шаги, чтобы сосредоточиться ячеек по плоскости, параллельной резки поверхности клетки блока.
2. Она также включает маяк, как темные включения AV-маркер (рис. 1б), который служит двум из следующих целей:
   1. Чтобы представить себе уровень, при котором клетки сосредоточены. Площадь ячейки блока с клетками интерес в настоящее время могут быть визуализированы histotechnologist когда темные маяк подвергается в процессе резки. Эта способность контролировать бы предотвратить один из прорезая уровне с большинством клеток, или не разрезая слишком поверхностно на уровне с высокой концентрацией образец клеток.
   2. Чтобы служить в качестве отправной точки локатор ссылки в разделе серийного блока ячейки на разных слайдах. Эта контрольная точка действует как маяк, чтобы помочь найти конкретный клетки или группы клеток для оценки картины координировать иммунореактивности с СКИП подход (6,7).

ПРОТОКОЛ (рис. 2)

Подготовка образца.

1. Передача остаточной LBC цитология шейки матки образца к плоской трубки со стеклянным дном (15 мм диаметр х 45 мм) (Рисунок 2.1 по 2.4). Место стеклянной трубки в большую пластиковую трубку носитель (28 х 85 мм) и центрифуги. Снимите трубку со стеклянным дном от несущей трубой и слить супернатант.
2. Стеклянная трубка, то ограничен (для предотвращения утечки горячей воды в следующем шаге) и поместили обратно в большую плоскую трубку перевозчика пластиковым дном
3. Трубки перевозчик пластиковых содержащие стеклянную трубку, затем ограничен, размещенных в центрифуге (с поворотным чашки, а не фиксированной чашки так, чтобы угол падения клетки перпендикулярно к плоской нижней части стеклянной трубки) и центрифугировали при 1805 G (3000 RPM, радиуса ротора-17см) в течение пяти минут (рис. 2.5).
4. Трубы затем удаляются вертикально от центрифуги и меньше стеклянной трубки удаляется пинцетом из больших пластиковую трубку перевозчика, не нарушая осевших гранул с ячейками.
5. Стеклянную трубку с образца без колпачков и супернатант сливают осторожно, чтобы не мешать плоский слой осадка клетки в нижней части (рис. 2.6).

Включение ссылки координировать AV-маркер и того геля

1. Темный маяк AV-маркер (около 2 мм х 2 мм, плоская поверхность, фрагмент темного цвета, sectionable материала) (рис. 3) добавляется в качестве указателя на стеклянную трубку (рис. 2.7).
2. Liquefy аликвоту HG путем плавления его в микроволновой печи в течение 10 секунд при средней мощности.
3. Добавить 0,5 мл расплавленного HG к трубке, смешивается с осадком быстро, и повторение его (рис. 2.8) (Перейдите к следующему шагу, быстро, не позволяя HG начала затвердевания).
4. Добавить около 2,5 мл теплой (45 ° С) водой пластиковую трубку носителя (рис. 2.9).
5. Меньше ограничен стеклянной трубки находится внутри пластиковой трубки с теплой водой. (Этот шаг необходим, чтобы держать HG от затвердевания в течение следующих шагах) (рис. 2.9).
6. Трубки перевозчик пластиковых помещается в центрифугу (с поворотным чашки, а не фиксированной чашки так, чтобы угол падения клетки перпендикулярно к плоской нижней части стеклянной трубки) и центрифугировали при 1805 G (3000 оборотах ротора радиус-17см) в течение пяти минут. Цель этого центрифугирования шагом будет толкать AV-маркер и сосредоточиться клеток в слое ближе к режущей поверхности окончательного парафин ячейки блока (рис. 1г).
7. Трубы затем удаляются нежно и по вертикали от центрифуги заботясь, чтобы не мешать осаждают тонкий слой с образцами клеток на дно.
8. Большие пластиковые трубки без колпачков и меньше стеклянной трубки удаляется по вертикали щипцами, не нарушая слоя осадка образца клеток.
9. Небольшая стеклянная трубка охлаждается в вертикальном положении в течение 15 минут, чтобы охладить и укрепить HG (рис. 2.11).

Удаление ячейки блока в виде кнопки геля с образцами для окончательной обработки

1. Затвердевших HG диск, со слоем концентрированной / осадка образца на дно выбили из плоской стеклянной трубки нижней, впрыскивая 10% формалина через 23 иглы со шприцем (рис. 2.12).
2. Игла вводится вдоль боковой трубкой на периферии затвердевших HG диск с образцами (рис. 2.12).
3. Needlэлектронной поворачивается вдоль боковой трубкой в ​​то время как формалин медленно протолкнул шприц. Это приводит к разделению HG кнопку вместе с темным маяком AV-маркер и концентрированного образца в нем с плоским дном из стеклянной трубки (рис. 2.12).
4. Ячейки блока (гель кнопку с образцами клеток), затем помещается в меченых кассеты и представлены для обработки ткани для подготовки парафин ячейки блока (рис. 2.13).

Вложения и резки образца

1. Диск в парафин с темной стороной маркерного радиомаяка поста режущей поверхности (рис. 1).
2. Блок подразделяется пока темные AV-маркера в качестве маяка подвергается и четко видны.
3. От трех до четырех разделов микрон вырезаны из этого уровня, которое должно содержать большую часть однократно рассеянного клеток из образца.
4. Разделах собраны на предметное стекло для дальнейшего окрашивания, иммуногистохимического окрашивания, или другие тесты, как указано. Протоколы этих испытаний, включая тип слайды использовать для установки секций может варьироваться. В общем, для иммунной, с покрытием слайды используются для предотвращения плавающей и потере разделов из слайдов во время иммунной шагов.

Сокращения, используемые (в алфавитном порядке): CISH, хромогенных на месте тесты гибридизации, рыба, флуоресцентная лампа на месте тесты гибридизации; FFPE, формалин-фиксированных парафин; FNA, тонкая аспирационная биопсия, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, жидкие цитология, ПЦР-полимеразная цепная реакция;

Рисунок 1. Структуры клеточных блок подготовленный протокол Shidham в.

Рисунок 2. Резюме различные шаги для приготовления клеточных квартале от LBC образца по протоколу Shidham в.

Рисунок 3. Подготовка AV-маркер из банановой кожуры.

Рисунок 4. Сравнение ячейки блоков и секций с и без AV-маркер.

Рисунок 5. Сравнение клеточности разделам клеточной блок с и без AV-маркер.

Discussion

Сотовые блоки ценным инструментом для оценки различных образцов цитологии (1). Самое главное, в дополнение к архитектурным деталям образца, сотовые блоки позволяют проводить оценку вспомогательные исследования, такие как иммуноцитохимия, флуоресцентные / хромогенных на месте гибридизация тесты (FISH / CISH) и на месте ПЦР. Различные способы получения клеточных блока описаны. Тем не менее, большинство из них подходят для не-гинекологической образцов цитологии, которые содержат относительно много клеток и тканей с микрофрагментов например, в FNA всасывает и некоторые серозной жидкости, такие как излияния (1,3,4,5).

Поскольку ячейки блоков в первую очередь обеспечить возможность для иммуноцитохимического оценки, их обработки желательно похож на фиксированных формалином парафин (FFPE) тканей. В конечном итоге результаты, полученные после иммуноцитохимического оценки разделы ячейки блока по сравнению с теми с опубликованной литературы осуществляется преимущественно на FFPE разделах ткани. Любые изменения в протокол скомпрометировать и свести на нет действия результатов, полученных на сотовые блоки обрабатываются с помощью различных фиксаторов и реагента последовательности кроме того, что используется для рутинной FFPE. Некоторые коммерческие методы, возможно, недостаток обработки через протокол воздействия других фиксатором-реагент экспозиции.

Различные методы клеточной подготовки блока доступны для образцов со значительным количеством осадков и фрагментов тканей. В принципе, сосредоточен отложений поддерживаются некоторыми геля или коагуляции принципе. Маневренный кнопка затем заливали в парафин после обработки, как хирургическая патология экз / биопсии.

Гели использованы, включают желатин, агар, фибриноген / плазменных тромбина, и других коммерческих гели, такие как HG. Методы концентрации варьируются от простой гранулирования осадка центрифугированием к концентрации клеток вдоль различных типов мембран. Примеры включают в себя: Milipore, collodin (целлоидин) мешки или соскоба клеток из цитология мазков на предметные стекла (1). Мы также оценили различные гели с помощью перебора различных комбинаций агара и желатина. Ни одна из комбинаций достигнута достаточно фирма, последовательность, чтобы получить легко маневренные диск затвердевшего геля со встроенными клетками образца в один кусок. HG показали соответствующие последовательности и по нашему опыту иммунной результаты по разделам HG ячейки блока были отличными.

Жидкостная цитология (LBC) образцов для цервиковагинальных цитологии, как правило, меньше, чем сотовые без гинекологических образцы как упоминалось выше. Кроме того, гинекологические LBC образцов преимущественно содержать отдельные рассеянные вспученного поверхностные клетки слизистой оболочки цервиковагинальных. В связи с этим соответствующие клеточности в разделах ячейки блока не может быть достигнуто без особого подхода. Поскольку эти однократно рассеянного клеточных компонентов в блок не может быть видели histotechnologist во время раздела резки, уровень, при котором клетки начинают появляться в разделах не могут быть оценены и могут быть упущены, либо за счет сокращения прошлом уровень с самыми клетки или нет резки достаточно глубоко в уровень с высокой концентрацией образец клеток (рис. 4). Протокол Shidham адреса обе эти проблемы с использованием HG как вложение средних и обычных лаборатории оборудования (2) (рис. 2).

Этот протокол включает в себя следующие две основные функции (рис. 1):

1. Концентрация и выравнивание однократно рассеянного клеток в узкой плоскости соседних и параллельно режущей поверхности клетки блока (рис. 5).
2. Включение маяк-как темные AV-маркер, как указатель. Это имеет решающее значение для достижения следующих функций:
   1. Выявление и мониторинг уровня, при котором клетки сосредоточены в ячейки блока. Экспозиции темные указателя подчеркивает уровня, при котором большая часть однократно рассеянного клеток в ячейке блока как ожидается, будут расположены (рис. 4). Это предотвращает с рубками (резка прошлом уровень с самыми клеток) или подрывает (не резки достаточно глубоко в уровень с высокой концентрацией образец клеток) в в ячейку блока и позволяют выбрать разделы из уровня в ячейки блока, соответствующих высокая концентрация клеток.
   2. Темные указатель в разделах также служит ориентиром для обследования и определить точно такие же клетки в разных серийных срезов ячейки блока на различных слайдов (рис. 4). Это имеет решающее значение при интерпретации и оценке координировать такие свойства immunoprofile особое клеток СКИП подход следовать той же клетки в разных разделах (6,7).

Хотя НУГ протокол стандартизирован и сообщалось жидкости на основе образцов шейки цитологии, она также может быть использован для повышения диагностической ценности многих других не-гинекологической образцов, таких как выпот жидкости, FNA, щеткой, киста содержания и т.д. Кроме того А. В. маркер позволит улучшить Применение СКИП подход при оценке иммуногистохимического клеточных разделы блок этих образцов. Вложение среды могут быть заменены другими реагентами с соответствующими изменениями в соответствующие шаги. HG может быть заменен плазмы (фибриногена), которые будут загущенное тромбином при комнатной температуре (1).