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Biology

एफ actin प्रतिदीप्त के माध्यम से गतिशीलता का लाइव सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी धब्बा (FSM)

doi: 10.3791/1325 Published: August 5, 2009

Summary

चयन, microinjection, और इमेजिंग फ्लोरोसेंट के माध्यम से fluorescently लेबल एफ actin माइक्रोस्कोपी धब्बा (FSM).

Abstract

हम इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्रतिदीप्त का उपयोग माइक्रोस्कोपी (FSM) PtK1 कोशिकाओं में actin गतिशीलता के उच्च संकल्प छवियों पर कब्जा धब्बा. FSM का एक अनूठा लाभ इसके लिए जीवित कोशिकाओं के भीतर आंदोलन और एफ actin नेटवर्क के कारोबार कैनेटीक्स (विधानसभा / disassembly) पर कब्जा करने की क्षमता है. इस तकनीक को एफ actin गतिशीलता के मात्रात्मक मापन जब कंप्यूटर दृष्टि सॉफ्टवेयर (qFSM) के साथ बनती पाने में विशेष रूप से उपयोगी है. हम चयन microinjection, और जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट actin जांच के दृश्य का वर्णन. महत्वपूर्ण बात है, इसी तरह की प्रक्रियाओं अन्य macomolecular विधानसभाओं visualizing करने के लिए लागू होते हैं. FSM सूक्ष्मनलिकाएं, मध्यवर्ती filaments, और आसंजन परिसरों के लिए प्रदर्शन किया गया.

Protocol

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धारा 1: FSM के लिए अपने fluorescently लेबल actin प्राप्त

आवश्यक सामग्री: actin, की fluorophore (Alexa, की सिफारिश की एक्स - rhodamine) शुद्ध. जी बफर, ultracentrifuge

  1. अच्छा FSM फिल्में प्राप्त करने के लिए एक प्रमुख घटक actin की उचित अपनी पसंद की fluorophore साथ (या अन्य cytoskeletal प्रोटीन) लेबलिंग की आवश्यकता है.
    हम Alexa की fluorophores (488, 568 तरंग दैर्ध्य) और एक्स - rhodamine succinimidyl एस्टर डेरिवेटिव कि actin की सतह पर लाइसिन अवशेषों को उजागर लक्ष्य का उपयोग सलाह देते हैं.
  2. जब अपने fluorophore और उसके उचित तरंगदैर्ध्य का चयन सुनिश्चित करें कि आपके खुर्दबीन सेटअप उपयुक्त फिल्टर (उत्तेजना और उत्सर्जन) और illuminators है (पारा आर्क दीपक और / या पराबैंगनीकिरण) करने के लिए अपने फ्लोरोसेंट टैग को समायोजित. हम संतरे में तरंगदैर्य लाल तरंगदैर्य (560-630 एनएम) का चयन करने के लिए ऑटो प्रतिदीप्ति और तस्वीर क्षति के प्रभाव को कम करने और GFP-conjugates के साथ अपनी संगतता सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं.
  3. शुद्ध actin चूहा या चिकन के लिए संबंधित मांसपेशी ऊतक से निकाला जा सकता है, लेकिन मांसपेशियों एसीटोन पाउडर से एक लंबा निष्कर्षण प्रक्रिया की आवश्यकता है. बलवान एसीटोन पाउडर Invitrogen से खरीदा जा सकता है है. लेबलिंग प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं है, लेकिन [1] यहां पाया जा सकता
  4. वैकल्पिक रूप से, आप cytoskeleton इंक, और Invitrogen सहित कई विक्रेताओं से लेबल actin प्रोटीन खरीद कर सकते हैं. कस्टम लेबलिंग सेवाओं Invitrogen के माध्यम से भी उपलब्ध हैं. शुद्ध, गैर लेबल actin (दोनों की मांसपेशी और nonmuscle actin) cytoskeleton इंक से खरीदा जा सकता है है
  5. चाहे आप खरीद या अपने स्वयं के लेबल actin तैयार के निर्णय लेते हैं, तो आप करने के लिए सुनिश्चित करें कि लेबलिंग अनुपात actin की monomer के प्रति 0,3 0,7 रंगों के आसपास कहीं है चाहता हूँ. बहुत एक उच्च लेबलिंग अनुपात actin फिलामेंट के कारोबार कैनेटीक्स (और बाध्यकारी प्रोटीन जुड़े) प्रभाव, जबकि बहुत कम लेबलिंग अनुपात गरीब देख speckles के (कम शोर करने के लिए संकेत) के लिए नेतृत्व करेंगे कर सकते हैं और microinjection समस्याओं (नीचे देखें) का कारण हो सकता है. यह हो, अच्छा छवियों धब्बा के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है.
  6. दीर्घकालिक भंडारण के लिए पहले, लेबल actin के समाधान 75,000 पर कताई के द्वारा स्पष्ट किया जाना चाहिए - 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 80,000 XG. लेबल actin जी बफर समाधान में संग्रहित किया जाना चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस रखा. 2 उल aliquots तैयारी अत्यधिक दोहराया ठंड विगलन (अघुलनशील समुच्चय के लिए सुराग) के हानिकारक प्रभाव को कम करने की सिफारिश की है. प्रत्यक्ष प्रकाश लेबल actin के समाधान को उजागर (fluorophores के photobleaching) से बचना चाहिए. हम दीर्घकालिक भंडारण के लिए अपारदर्शी microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग की सलाह देते हैं.

धारा 2: लेबल actin के कक्ष और Microinjection की तैयारी

Microinjection सुइयों, microsyringe, microloaders, prewarmed कक्ष मीडिया, इंजेक्शन बफर, बर्फ की बाल्टी, खुर्दबीन (चरण अंगूठी, चरण इसके विपरीत 40x उद्देश्य, transjector, सुई पेचकश, micromanipulator) सामग्री: आवश्यक

  1. कई प्रकार की कोशिकाओं FSM के लिए उत्तरदायी हैं, लेकिन हो रही अच्छा छवियों धब्बा सीधे microinjection प्रक्रिया की सफलता पर निर्भर है. जब FSM के लिए कक्षों का चयन, कोशिकाओं बड़े हो (> 50 उम व्यास में) होना चाहिए फैल चाहिए, जब मढ़वाया, और स्वाभाविक रूप से substrates (या प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजन) पक्षपाती हो. यह भी मदद करता है अगर सेल cytosol इसके नाभिक से अधिक क्षेत्र में रह रहे है. aforementioned मानदंड सुनिश्चित करना है कि कोशिकाओं microinjection के लिए उत्तरदायी हैं. सफल उम्मीदवार सेल लाइनों शामिल हैं (लेकिन सीमित करने के लिए नहीं) [2,3], न्यूट फेफड़ों की कोशिकाओं [4], और Aplysia न्यूरॉन्स [3] PtK1
  2. कि एसिड धोया गया है; कक्ष वर्ग में कांच coverslips (नहीं 1-1/2 22 x 22 मिमी) पर चढ़ाया होना चाहिए. मानक सब्सट्रेट कोटिंग coverslip के लिए लागू किया जा सकता है और microinjection प्रभावित नहीं होगा.
  3. microinjection सुइयों का सही चयन टिप खोलने के आकार पर निर्भर है. आमतौर पर, छेद आकार कर सकते हैं आकार में बहुत 0.5 उम से के रूप में बड़े रूप में 3 उम. हालाँकि, हम अनुशंसा actin की है कि इंजेक्शन 0,5 करने के लिए 1 उम के बीच एक इष्टतम खोलने आकार की आवश्यकता है. यदि clogging समस्याओं लगातार सामना कर रहे हैं, बड़ा छेद आकार monomeric के वितरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अवांछित polymerized actin filaments के लिए समायोजित कर सकते हैं. Microinjection सुइयों Eppendorf सिस्टम जो femtotip microinjection सुइयों बनाने सहित कई विक्रेताओं के माध्यम से खरीदा जा सकता है है. वैकल्पिक रूप से अगर एक वाणिज्यिक सुई खींचने उपलब्ध है, कांच microinjection ट्यूबों Sutter से खरीदा है, और कर सकते हैं विनिर्देशन के लिए खींच लिया. Beginners के लिए, हम हाथ पर इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू करने से पहले 10-20 खींच सुइयों होने की सलाह देते हैं.
  4. आदर्श actin की एकाग्रता इंजेक्शन '(अपने सुई में भरी हुई actin के अंतिम एकाग्रता) 0.5 के बीच 1.0 / स्नातकीय उल डाई की एक 40% लेबलिंग actin monomer के अनुपात पर आधारित है. लोअर अपने actin की लेबलिंग अनुपात उच्च सांद्रता (1-3 स्नातकीय / उल) को इंजेक्शन लगाने के द्वारा मुआवजा किया जा सकता है है. हालांकि, अपने सुई के clogging आवृत्तिहो वृद्धि हुई है. यह आंशिक रूप से बड़े खुलने के साथ सुइयों का उपयोग द्वारा alleviated किया जा सकता है. Actin के स्टॉक एकाग्रता ठंडा इंजेक्शन बफर जोड़कर पतला किया जा सकता है है. आइस - ठंड ddH2O भी जल्दी इंजेक्शन के लिए पतला किया जा सकता है. इस बिंदु पर सभी काम कर रहे समाधान बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
  5. अपने actin microsyringe (गेज - हैमिल्टन संकीर्ण) का उपयोग कर समाधान के 1.0 उल 0.5 लोड, या वैकल्पिक रूप से एक microloader विंदुक टिप का उपयोग करके.
  6. सावधानी से धीरे समाधान रिहा द्वारा actin समाधान बग़ैर. बुलबुले, बचा जाना चाहिए, लेकिन अतिरिक्त तरल बुलबुला आसपास लेने के द्वारा आसानी से हटाया जा सकता है है.
  7. सुनिश्चित करें कि actin समाधान सुई नोक पर पूरी तरह से आराम कर रहा है. सुई की केशिका साथ कहीं अधिक समाधान इंजेक्शन प्रवाह को बाधित कर सकते हैं.
  8. अब, ध्यान से सुई देते हैं, सुई टिप के साथ संपर्क से बचने इंजेक्टर धारक को. धारक स्थिति इतनी है कि सुई खुर्दबीन मंच के आधार पर एक 35-50 डिग्री कोण बनाता है. लोअर कोण पसंद कर रहे हैं.
  9. सुई की नोक निचले जब तक यह मुश्किल से अपनी कोशिकाओं स्नान मीडिया की सतह टूट जाता है.
  10. अब सुई टिप (कम करने के बिना) की स्थिति इतना है कि यह सीधे उद्देश्य के केन्द्र से ऊपर टिकी हुई है. यदि सुई टिप उद्देश्य के साथ गठबंधन किया है, तुम ऐपिस के माध्यम से एक उज्ज्वल प्रभामंडल देखना चाहिए. यह सुई टिप के अंत है. धीरे धीरे पक्ष को सुई ओर बढ़ (जोड़तोड़ का प्रयोग करके) बेहतर प्रभामंडल का पता लगाने में मदद कर सकते हैं.
  11. खुर्दबीन पर z फोकस समायोजित करें जब तक अपनी कोशिकाओं स्पष्ट दृश्य में हैं. अब, धीरे धीरे टिप कम जब तक प्रभामंडल धीरे - धीरे constricts अंत में जब तक सुई टिप में converging - आप ध्यान केंद्रित (स्थिति z-) के साथ नियंत्रण की आवश्यकता होगी. एक अतिरिक्त सुविधा के लिए देखने के लिए सुई की शाफ्ट, जो रैखिक छाया डाली है. सुई कम धीरे धीरे सुई शाफ्ट को परिभाषित करेगा. जब सही ढंग से किया सुई और अपनी कोशिकाओं के अंत दोनों स्पष्ट दृश्य में होना चाहिए. चरण की अंगूठी के मामूली समायोजन करने के लिए इसके विपरीत में सुधार के लिए आवश्यक हो सकता है.
  12. जब नेविगेट सुनिश्चित करने के लिए, सुई टिप अपने कोशिकाओं के लिए सुई टिप को तोड़ने से रोकने के अच्छी तरह से ऊपर है.
  13. जब इंजेक्षन कोशिकाओं का चयन, मुफ्त किनारों के साथ कोशिकाओं सुई टिप का सामना करना पड़ रहा होना चाहिए. इस सेल की गिरावट ढलान सुनिश्चित बड़ी से बड़ी बात है, जहां नाभिक thinnest बिंदु पर रहता है, अग्रणी धार से सुई, यह करने के लिए समानांतर चल बजाय टिप को पूरा करेंगे.
  14. सुई दबाव 0,3 करने के लिए 0,8 साई पर सेट किया जाना चाहिए. निरंतर दबाव लागू actin के समाधान की एक सतत प्रवाह में परिणाम देगा.
  15. इंजेक्षन सेल पर तय करने के बाद, अपने सुई की स्थिति तो टिप नाभिक (perinuclear क्षेत्र, सेल जहां नाभिक सीधे नीचे नहीं है के बड़ी से बड़ी हिस्सा) के बगल में है.
  16. धीरे धीरे कम है, और सुई की स्थिति बदल डालना जब तक टिप झिल्ली निराशाजनक है, अब संवर्द्धित कम जब तक सुई टिप झिल्ली छेदा है. यदि सुई पूरी तरह से झिल्ली छेदा है, सेल उज्जवल दिखाई देते हैं, के रूप में जल्द ही है जैसा कि आप देख इस अंतर सुई बढ़ा जब तक यह नहीं रह सेल छू रहा है. वास्तविक भेदी और इंजेक्शन प्रक्रिया 0,5 करने के लिए 2 सेकंड ले जाएगा.
  17. जब सही ढंग से किया, कक्ष आकार अपरिवर्तित दिखाई देते हैं, जबकि बहुत अधिक इंजेक्शन सेल बढ़त के त्वरित त्याग में परिणाम होगा और कुछ मामलों में आप वास्तव में देखने के लिए सेल विस्फोट.
  18. यदि आप कक्ष में परिवर्तन नहीं देख जब microinjecting (नहीं मिलता उज्जवल नहीं), सुई टिप बंद हो सकता है. 'साफ' अगर आपके transjector पर उपलब्ध बटन दबाकर आप इस परीक्षण कर सकते हैं. खुले अगर, यह काफी लगातार दबाव प्रवाह है जो eyepieces के माध्यम से देखा जा सकता है है में वृद्धि होगी - यह है के रूप में चर्चित और आसपास के मलबे dispersing देखा जा सकता है दिखाई देगा.
  19. यदि सुई टिप बंद है, तो आप एक नया microinjection सुई या सुई की नोक धीरे कांच coverslip के खिलाफ प्रेस सुई की नोक तक सुई कम से तोड़ने की कोशिश सम्मिलित चुनते हैं, तो इस प्रकार टिप के बहुत अंत पैदा कर सकते हैं तोड़ने के लिए. टूटना क्षेत्र सुई बिंदु (है कि एक बिंदु पर एकाग्र शुरू होता है सुई की भाग) के क्षेत्र के 1 / 5 वीं से अधिक नहीं होना चाहिए.
  20. इंजेक्शन के साथ जारी रखें, कोई 20 से अधिक खर्च प्रत्येक microinjection सत्र (सेल प्रकार पर निर्भर करेगा) के लिए 45 मिनट. एक सामान्य नियम के रूप में, छोटे सत्र कोशिकाओं पर तनाव को कम करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
  21. Microinjection खत्म करने के बाद ताजा prewarmed मीडिया जोड़कर डिश में सेल मीडिया बदल जाते हैं. फिर कोशिकाओं इमेजिंग पहले एक मशीन में 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. यह भी actin मौजूदा cytoskeleton नेटवर्क में एकीकृत करने के लिए अनुमति देगा.

धारा 3: कोडांतरण इमेजिंग चैंबर

आवश्यक सामग्री: coverglass, डबल पक्षीय टेप, क्ष युक्तियाँ, संदंश, valap, किम पोंछ, oxyrase, इमेजिंग मीडिया, धार, P200 अनुकरणीयpette, शुद्ध इथेनॉल

  1. इमेजिंग मीडिया prewarming और Oxyrase के 15 उल विभाज्य विगलन द्वारा शुरू करो. प्रकाश से सहज oxyrase की रक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें. oxyrase के अलावा काफी photobleaching के प्रभाव को कम करेगा.
  2. Prewarm valap गर्म थाली के तापमान को कम करने के लिए सेटिंग के द्वारा,. ज़रूरत से ज़्यादा गरम / valap जला के लिए यह एक सीलेंट के रूप में अपनी प्रभावकारिता खो देंगे मत करो.
  3. नीचे एक शुद्ध इथेनॉल के साथ doused और साफ करने के लिए छोटे मलबा हटाने kimwipe के साथ एक coverglass पोछो.
  4. एक दूसरे के शीर्ष पर डबल पक्षीय टेप के दो बराबर आकार (2.5 सेमी लंबी) लंबाई, एक मंच के रूप में एक साफ फ्लैट सतह का उपयोग ढेर. बाहर किसी भी फंस हवाई बुलबुले प्रेस करने के लिए एक पूरी तरह से फ्लैट विमान बनाने के लिए.
  5. एक धार का प्रयोग, लंबे अक्ष के साथ दो सीधे स्ट्रिप्स में कटौती, ताकि प्रत्येक पट्टी चौड़ाई में 0.5 सेमी उपायों.
  6. संदंश का प्रयोग, अपने coverglass की लंबी बढ़त के खिलाफ प्रत्येक पट्टी इतनी जगह है कि टेप के दो स्ट्रिप्स अपने coverglass के केंद्र में एक अंतर पैदा. टेप पर धीरे प्रेस गिलास के साथ एक अच्छा मुहर बनाने के लिए. टेप की स्ट्रिप्स coverglass और coverslip के बीच spacers के रूप में कार्य करेगा.
  7. सुनिश्चित करें valap पूरी तरह से इससे पहले कि आप अगले चरण शुरू तरलीकृत है.
  8. पुनर्प्राप्त अपने prewarmed इमेजिंग मीडिया, मीडिया के हर 500 उल oxyrase के 15 उल जोड़ने.
  9. त्रिकोण में मोड़ो kimwipes 3 हार्ड किनारों को बनाने के लिए. इस टेप के लिए एक सूखी सतह पर छड़ी बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  10. इनक्यूबेटर से अपने कोशिकाओं पुनर्प्राप्त. संदंश का प्रयोग, coverslip के एक कोने में ले लो. जल्दी kimwipe पर coverslip (सेल की ओर का सामना करना पड़ रहा है, ऊतकों को छू नहीं) जगह है, और मुड़ा kimwipe का उपयोग करने के लिए coverslip के दो विरोधी पक्ष को मिटा करने के लिए एक अर्ध - शुष्क सतह बनाने (जहां अपने कोशिकाओं बाकी की सतह पर).
  11. संदंश का प्रयोग, एक कोने coverslip हड़पने के लिए और इसे अपने coverglass पर जगह इतनी है कि टेप के दो स्ट्रिप्स सूखी सतहों गठबंधन कर रहे हैं. अब आप दो बंद पक्षों और दो खुले slits सूचना. धीरे धीरे अपने इमेजिंग मीडिया oxyrase एक खोलने के लिए करीब समाधान के विंदुक 200 उल. महत्वपूर्ण बात है, कोई हवाई बुलबुले को पेश किया जाना चाहिए. समाधान केशिका बलों द्वारा नव इकट्ठे चेंबर में चूसा चाहिए, इस प्रकार पूरी तरह से समाधान में अपनी कोशिकाओं को डुबो.
  12. एक क्यू - टिप थपका जल्दी प्रत्यय करने के लिए पिघल valap के साथ अपने coverslip के चार कोनों का प्रयोग और coverslip स्थिर. तुम नोटिस हूँ कि valap तुरन्त dries (कमरे के तापमान पर सेकंड के भीतर).
  13. अब खुला पक्षों (गैर - टेप पक्ष) के साथ शुरुआत है, एक क्यू - टिप का उपयोग कर और एक brushing स्ट्रोक नकल उतार द्वारा valap की एक पतली पट्टी रखना. बंद पक्षों के लिए दोहराएँ. धीरे valap के कोट का निर्माण, इस प्रकार कोटिंग कदम दोहरा द्वारा सील मजबूत. valap किनारों तक ही सीमित होना चाहिए, स्पष्ट coverslip के केंद्र छोड़ने.
  14. DdH2O के साथ एक क्यू की नोक का उपयोग करने के लिए किसी भी अवशिष्ट मीडिया को हटाने के प्रति जागरूक किया जा रहा कोशिकाओं को कुचलने नहीं कर धीरे coverslip के केंद्र भाग साफ. शुद्ध इथेनॉल के साथ कदम की सफाई दोहराएँ.
  15. अब आप एक पूरी तरह से बंद इमेजिंग इमेजिंग धब्बा के लिए अनुकूलित कक्ष होगा. एक पूरी तरह से सील बाड़े के बाद जल्दी photobleaching से अपने fluorophores को रोकने जाएगा.

धारा 4: इमेजिंग कोशिकाओं

आवश्यक सामग्री: औंधा widefield माइक्रोस्कोप, mecury दीपक, उपयुक्त फिल्टर, और 6.7 माइक्रोन पिक्सेल, उच्च संख्यात्मक एपर्चर, तेल विसर्जन योजना Apochromatic उद्देश्यों (60x 100X चरण, या डीआईसी) के साथ सीसीडी कैमरा ठंडा. कंपन तालिका. इमेजिंग सॉफ्टवेयर.

  1. 37 डिग्री खुर्दबीन मंच Prewarm. अपने नए पूरा इमेजिंग चैम्बर प्लेस, और तापमान के लिए 10-15 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए इमेजिंग से पहले स्थिर.
  2. उज्ज्वल क्षेत्र में अपनी कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित द्वारा शुरू करो, और फिर सही प्रतिदीप्ति सेटिंग्स toggling द्वारा अपने इंजेक्शन कोशिकाओं को खोजने के. प्रतिदीप्ति photobleaching कम जोखिम के समय कम से कम करने की कोशिश करो.
  3. इंजेक्शन कोशिकाओं है कि स्वस्थ घुमावदार अग्रणी किनारों है के लिए देखो. ओवर इंजेक्शन कोशिकाओं (विस्फोट कोशिकाओं) मुकर और दांतेदार किनारों के द्वारा लक्षण वर्णन किया जा जाएगा, कई filopodia जैसी - इन कोशिकाओं इमेजिंग से बचने.
  4. अधिग्रहण सेटिंग्स कोशिका प्रकार, लेबल actin की गुणवत्ता, और माइक्रोस्कोप घटकों पर निर्भर करेगा. हालांकि, प्रदर्शन सेटिंग्स 2 सेकंड से अधिक नहीं हो सकता है, और फ्रेम के बीच समय अंतराल 5 और 10 सेकंड के बीच सेट किया जाना चाहिए चाहिए. एक समय श्रृंखला (प्रति imaged सेल) के लिए विशिष्ट लंबाई 10 से 30 मिनट के बीच कहीं भी भिन्न कर सकते हैं, और photobleaching प्रभाव के द्वारा सीमित है. कैमरे पर लाभ सेटिंग्स को दिया जा सकता है शोर करने के लिए संकेत वृद्धि.
  5. आदर्श धब्बा विशेषताओं प्रत्येक 2 ~ दूरी पर धब्बा है अगले पड़ोसी धब्बा व्यास धब्बा चाहिए. इस इष्टतम actin संरचना के स्थानिक और लौकिक नमूना वारंट होगा. उपकला कोशिकाओं के लिए, धब्बेदार actin नेटवर्क सजातीय समान रूप से अलग फैल speckles के साथ दिखाई देगा. सेल लाइनों है कि घने तनाव फाइबर या lamellipodia सुविधाअलग पहचाना हो जाएगा, लेकिन एक डॉटेड / धब्बेदार उपस्थिति होगा. एक्सपोजर सेटिंग सबसे अच्छा धब्बेदार छवियाँ प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
  6. अधिक microinjected कोशिकाओं घनी पैक speckles कि असतत होना प्रकट नहीं होगा. तनाव फाइबर और lamellipodia डॉटेड उपस्थिति खो देंगे.
  7. अंडर microinjected कोशिकाओं बहुत मंद ऐपिस के माध्यम से दिखाई देते हैं, speckles है कि दूर कर रहे हैं (> 10 speckles के अलावा) और बेतरतीब ढंग से प्रदर्शित होने बिखरे हुए युक्त. तनाव इन कोशिकाओं में और फाइबर lamellipodia अप्रभेद्य हो जाएगा.
  8. 'अच्छा प्राप्त करने के लिए कुंजी धब्बा फिल्में ध्यान बनाए रखने है. इस के बाद शामिल प्रवाह और कारोबार माप धब्बा विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार मात्रात्मक विश्लेषण की गुणवत्ता में समय चूक की अवधि के लिए ध्यान में बंद पर निर्भर करेगा. यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है अगर इमेजिंग विमान काफी पतली है. और अन्य कारकों खुर्दबीन प्रणाली की स्थिरता, विशेष रूप से मंच आवास और इमेजिंग चैम्बर पर निर्भर करेगा. यदि छवि अंतराल लंबाई के लिए इस सुविधा को समायोजित करने के लिए पर्याप्त हैं कंट्रास्ट - आधारित ध्यान केंद्रित किया जा सकता. अन्य विकल्प एक के पास अवरक्त आधारित प्रणाली है कि विश्वसनीय वास्तविक समय ध्यान समायोजन प्रदान करता है ध्यान केंद्रित क्रय शामिल हैं. आप Nikon ओलिंप, और एएसआई से इन प्रसाद पा सकते हैं.

धारा 5: qFSM विश्लेषण

इस अनुभाग में विस्तार से चर्चा नहीं है, लेकिन विश्लेषण सॉफ्टवेयर के बारे में जानकारी [5] यहाँ पाया जा सकता है है. सॉफ्टवेयर डाउनलोड अनुरोधों हमारी वेबसाइट (lccb.scripps.edu) पर बनाया जा सकता है.

जिन विषय:

  • शोर अंशांकन
  • पता लगाने धब्बा
  • छवि के मोटे गति के सहसंबंध आधारित ट्रैकिंग के एक संकर दृष्टिकोण का उपयोग ट्रैकिंग क्षेत्रों और व्यक्तिगत speckles के विस्तृत गति का एक कण ट्रैकिंग धब्बा.
  • बहुलक के दौरान तीव्रता उतार चढ़ाव से विधानसभा और disassembly दरों की संगणना उपस्थिति और लापता होने की घटनाओं धब्बा.

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Discussion

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कई महत्वपूर्ण कारक महत्वपूर्ण हैं के लिए सफलतापूर्वक छवियों को प्राप्त करने धब्बा, लेकिन अच्छा speckles के शुरू और अपने fluorescently लेबल actin की गुणवत्ता के साथ खत्म. Actin monomer, 0.4 के आसपास 0.7 करने के लिए सेट करने के लिए डाई के एक उच्च अनुपात लेबलिंग कि speckles के उज्ज्वल और असतत दिखाई देगा सुनिश्चित करने के लिए, जबकि लेबल प्रोटीन ही घुलनशील और समुच्चय से मुक्त होना चाहिए. समान रूप से महत्वपूर्ण microinjection प्रक्रिया है. सामान्य सेल homeostasis और अस्तित्व () सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं के लिए एक कम प्रवाह दबाव के साथ इंजेक्शन हो सकता है, लेबल प्रोटीन की एक कम एकाग्रता शुरू की जरूरत है. यह microinjection प्रणाली का उपयोग करने के लिए सम्मान के साथ तकनीकी विशेषज्ञता / अनुभव के कुछ डिग्री की आवश्यकता है. एक सामान्य नियम के रूप में, छोटे इंजेक्शन बार (<1s) अब इंजेक्शन बार से अधिक पसंद कर रहे हैं. पिछले महत्वपूर्ण घटक सूक्ष्मदर्शी है. पारा दीपक महामारी - प्रकाशक, सबसे बुनियादी सुविधाओं में पाया के साथ एक औंधा बनती खुर्दबीन इमेजिंग धब्बा के लिए, एक पर्याप्त मंच के रूप में सेवा करेंगे. यह मानते हुए उचित प्रतिदीप्ति फिल्टर जगह में हैं, एक उच्च एनए उद्देश्य और एक ठंडा सीसीडी कैमरा के संयोजन उज्ज्वल speckles के उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन होगा. हम उच्च आवर्धन (100X), उच्च एनए (> 1.3), योजना apochromat उद्देश्यों कि बेहतर संकल्प और चमक प्रदान करेगा का उपयोग करने की सलाह देते हैं. आदर्श इंजेक्शन शर्तों के तहत बढ़ाई 60x करने के लिए उतारा जा सकता है, पिक्सेल प्रति चमक और SNR बढ़ाने. कम शोर, ~ 6.5 microns के पिक्सेल आकार के साथ उच्च मात्रा कुशल, ठंडा सीसीडी कैमरों, आदर्श डिटेक्टरों हैं, और कुछ मामलों में गरीब गुणवत्ता जांच फ्लोरोसेंट के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, fluorescently लेबल प्रोटीन जांच किया जा सकता है व्यक्त / GFP आरएफपी संयुग्मित प्रोटीन सीडीएनए nucleoinjection () एक ही कोशिका के भीतर constructs के साथ सह इंजेक्शन. यह कोशिकाओं के नाभिक में सीडीएनए के nucleoinjection, आसपास के cytoplasm में एक दूसरे इंजेक्शन द्वारा पीछा आवश्यकता है. सारांश में, FSM cytoskeleton गतिशीलता में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. अच्छा speckles के प्राप्त करने के उचित जांच, उपकरण और एक छोटा सा धैर्य (प्रशिक्षण) की आवश्यकता है.

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Acknowledgments

qFSM के विकास NIH अनुदान U01 GM06230 द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C

G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercapt–thanol

Store up to 1 day at 4° C

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References

  1. Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).
  2. Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305, 1782-1786 (2004).
  3. Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow. Neuron. 40, 931-944 (2003).
  4. Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).
  5. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).
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Cite this Article

Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).More

Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).

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