דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

Summary

, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).

Abstract

בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של אקטין הדינמיקה PtK1 תאים. היתרון הייחודי של FSM היא יכולתו ללכוד את התנועה קינטיקה מחזור (הרכבה / פירוק) של רשת ה-F-אקטין בתוך תאים חיים. טכניקה זו שימושית במיוחד הנובעות מדידות כמותית של ה-F-אקטין הדינמיקה כאשר יחד עם תוכנה ראייה ממוחשבת (qFSM). אנו מתארים את, מבחר microinjection ויזואליזציה של בדיקות אקטין פלואורסצנטי בתאים חיים. חשוב לציין, נהלים דומים החלים חזותי macomolecular מכלולים אחרים. FSM הוכח עבור microtubules, חוטים ביניים מתחמי הידבקות.

Protocol

סעיף 1: קבלת אקטין שכותרתו fluorescently שלך FSM

החומרים הדרושים: מטוהרים אקטין, fluorophore (אלקסה, X-rhodamine מומלץ). G-כליקול, ultracentrifuge

1. מרכיב מרכזי לרכישת סרטים FSM טוב מחייב תיוג נכון של אקטין (או חלבונים cytoskeletal אחרים) עם fluorophore על פי בחירתך.
   אנו ממליצים להשתמש fluorophores של Alexa (488, 568 אורכי גל) ו-X-rhodamine נגזרים succinimidyl אסתר כי היעד שאריות ליזין חשופים על פני השטח של אקטין.
2. בעת בחירת fluorophore שלך ​​אורך הגל המתאים שלה, להבטיח כי הגדרת מיקרוסקופ שלך יש את המסננים המתאימים (עירור ופליטה) ו illuminators (קשת כספית מנורה ו / או לייזרים) כדי להכיל תג פלורסנט שלך. אנו ממליצים על בחירת אורכי גל בכתום כדי אורכי הגל האדום (560-630 ננומטר) כדי למזער את ההשפעות של הקרינה אוטומטי ו צילום נזק כדי להבטיח תאימות עם ה-GFP-conjugates.
3. אקטין טהור ניתן להפיק רקמת השריר השייכים עכברוש או עוף, אבל דורש הליך מיצוי ארוך של אבקת אצטון השריר. אצטון אבקת Muscle ניתן לרכוש Invitrogen. ההליך תיוג לא נדון פרוטוקול זה, אך ניתן למצוא כאן [1]
4. לחלופין, ניתן לרכוש את החלבונים אקטין שכותרתו מיצרנים שונים כולל cytoskeleton בע"מ, Invitrogen. שירותי תיוג מותאמים אישית זמינים גם דרך Invitrogen. מטוהרים, שאינם שכותרתו אקטין (שניהם שרירים אקטין nonmuscle) ניתן לרכוש cytoskeleton בע"מ
5. אם אתה מחליט לרכוש או להכין אקטין שלך שכותרתו, אתה רוצה להבטיח כי יחס תיוג הוא בסביבות 0.3-0.7 צבעים לכל מונומר של אקטין. יחס גבוה מדי עלול תיוג אפקט תחלופה קינטיקה (וכן מחייב חלבונים הקשורים) של נימה אקטין, בעוד נמוך מדי יחס תיוג תוביל speckles מחפש עניים (אות לרעש נמוך) וכן עלול לגרום לבעיות microinjection (ראה להלן). זהו גורם קריטי להשגת תמונות טובות רבב.
6. לפני אחסון ארוך טווח, הפתרון אקטין שכותרתו יובהר על ידי ספינינג ב 75,000 - 80,000 XG במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. אקטין תווית יש לאחסן פתרון ה-G-כליקול והמשיך -80 מעלות צלזיוס. הכנת 2 aliquots UL מומלץ מאוד לצמצם את השפעות מזיקות של הקפאה, הפשרה חזר (מוביל אגרגטים מסיסים). להימנע חשיפת פתרון אקטין שכותרתו אור ישיר (יהיה photobleaching של fluorophores). אנו ממליצים להשתמש צינורות microcentrifuge אטום לאחסון ארוך טווח.

סעיף 2: הכנת תאים Microinjection של אקטין שכותרתו

החומרים הדרושים: מחטים microinjection, microsyringe, microloaders, מדיה תא prewarmed, חיץ הזרקה, דלי קרח, מיקרוסקופ (טבעת שלב, לעומת זאת בשלב אובייקטיבי 40X, transjector, מחט חולץ, micromanipulator)

1. סוגי תאים רבים ניתנים FSM, אבל מקבל טוב רבב תמונות תלויה ישירות על ההצלחה של ההליך microinjection. בעת בחירת תאים FSM, תאים צריך להיות גדול (> 50 אממ בקוטר), צריך להתפשט כאשר מצופה, ולהיות חסיד טבעי מצעים (או פלסטיק תרבות מנות רקמות). זה גם עוזר אם cytosol של התא משתרע על שטח גדול יותר הגרעין שלה. הקריטריונים האמורים להבטיח כי התאים ניתנים microinjection. מוצלח שורות תאים מועמד כוללים (אך לא רק) PtK1 [2,3], תאים סלמנדרה ריאות [4], ונוירונים Aplysia [3].
2. תאים צריכים להיות מצופה על coverslips זכוכית מרובע (22 x 22 מ"מ;. אין 1-1/2) כי כבר חומצה שטף. ציפוי מצע רגיל יכול להיות מיושם על coverslip ולא ישפיע microinjection.
3. הבחירה הנכונה של מחטים microinjection תלוי בגודל של פתיחת קצה. בדרך כלל, יכול מאוד בגדלים חור בגודל 0.5 אממ אל גדולים כמו 3 אממ. עם זאת, אנו ממליצים כי הזרקה של אקטין מחייב פתיחת גודל אופטימלי בין 0.5-1 אממ. אם הבעיות סתימת הם נתקלו באופן עקבי, גדלים חור גדול יכול להכיל עבור משלוח של monomeric וכן לא רצויות סיבי אקטין polymerized. מחטים Microinjection ניתן לרכוש דרך מספר ספקים כולל מערכות Eppendorf ההופכים microinjection מחטים femtotip. לחילופין, אם חולץ מחט מסחרי זמין, microinjection צינורות זכוכית ניתן לרכוש סאטר, ומשך למפרט. למתחילים, מומלץ לאחר 10-20 מחטים משך מצד לפני תחילת הליך ההזרקה.
4. "ריכוז זריקה" אידיאלי (הריכוז הסופי של אקטין טעון מחט שלך) של אקטין הוא בין 0.5-1.0 UG / ul מבוסס על יחס תיוג 40% צבען מונומר אקטין. יחס תיוג התחתון של אקטין שלך יכול להיות מתוגמל על ידי הזרקת בריכוזים גבוהים יותר (UG ul 1-3 /). עם זאת, תדירות סתימת של מחט שלךלהיות מוגברת. זו יכולה להיות הקלה חלקית באמצעות מחטים עם פתחים גדולים יותר. ריכוז צילומים של אקטין יכול להיות מדוללת על ידי הוספת קר כקרח חיץ ההזרקה. קר כקרח ddH2O יכול לשמש גם לדלל זריקות מהירה. בשלב זה פתרונות כל עובד צריך להיות כל הזמן על הקרח.
5. טען 0.5 עד 1.0 UL של פתרון אקטין שלך באמצעות microsyringe (צר מד - המילטון), או לחילופין באמצעות קצה פיפטה microloader.
6. בזהירות לוותר על הפתרון אקטין, על ידי שחרור בעדינות את הפתרון. בועות יש להימנע, אבל ניתן להסיר בקלות על ידי לקיחת למעלה נוזל עודף סביב הבועה.
7. ודא כי פתרון אקטין נח לגמרי בקצה המחט. פתרון עודף בכל מקום לאורך נימי של המחט יכול לשבש את זרימת זריקה.
8. כעת, בזהירות לצרף את המחט, הימנעות ממגע עם קצה המחט, לבעל מזרק. מקם את מחזיק כך המחט עושה זווית 35-50 מעלות לבסיס של השלב מיקרוסקופ. זוויות תחתון עדיפים.
9. מנמיכים את קצה המחט עד שהיא בקושי שובר את פני השטח של התקשורת רחצה לתאים.
10. עכשיו עמדה על קצה מחט (ללא הורדת) כך שהיא נשענת ישירות מעל מרכז היעד. אם קצה המחט מיושר במטרה, אתה צריך לראות הילה בהירה דרך העינית. זהו סוף של קצה המחט. לאט לאט להזיז את המחט בצד בצד (באמצעות מניפולטור) עשוי לסייע טוב יותר לאתר את הילה.
11. התאם את Z-להתמקד המיקרוסקופ עד התאים שלך נמצא בתצוגה ברורה. עכשיו, לאט לאט להוריד את קצה ההילה בהדרגה עד מכווץ עד שלבסוף מתכנסים לתוך קצה המחט - תצטרך לשלוט על המיקוד (z-position) בו זמנית. תכונה נוספת היא לחפש את הפיר של המחט, אשר הטילו צללים ליניארי. הורדת את המחט בהדרגה להגדיר את מוט מחט. כאשר נעשה בצורה נכונה את הקצה של המחט ותאי שלך גם צריך להיות תצוגה ברורה. התאמה קלה של הטבעת שלב ייתכן שתידרש כדי לשפר את החדות.
12. כאשר ניווט, להבטיח את קצה המחט היא הרבה מעל תאים כדי למנוע שבירת קצה המחט.
13. בעת בחירת תאים להזריק, תאים עם קצוות חופשיים צריך להיות מול קצה המחט. פעולה זו תבטיח במדרון הירידה של התא (מנקודת העבה, שם שוכן בגרעין, עד הדק את הקצה המוביל) יפגשו את קצה המחט, מאשר לרוץ במקביל אליו.
14. הלחץ מחט צריך להיות מוגדר ב 0.3-0.8 psi. לחץ מתמיד להחיל תגרום זרם קבוע של הפתרון אקטין.
15. לאחר שהחליט על תא להזריק, מיקום המחט שלך, כך הטיפ הבא הוא לגרעין (אזור perinuclear, החלק העבה ביותר של התא שבו הגרעין אינה ישירות להלן).
16. לאט לאט נמוך יותר, להתקין מחדש את מיקום המחט עד קצה מדכא את הממברנה, עכשיו בהדרגה נמוכה עד קצה המחט חוררה את הממברנה. אם המחט חוררה מלא קרום, התא יופיעו בהירים, ברגע שאתה רואה את ההבדל הזה להעלות את המחט עד שהוא כבר לא נוגע התא. פירסינג בפועל תהליך הזרקת ייקח 0.5-2 שניות.
17. כאשר נעשה בצורה נכונה, צורת התא יופיע ללא שינוי, ואילו הזרקת יותר מדי תגרום נסיגת מהירה של קצה התא, ובמקרים מסוימים תוכלו ממש לראות התא מתפוצץ.
18. אם אינך רואה את השינויים בתא כאשר microinjecting (לא מקבל בהירים), קצה המחט עשוי להיות סגור. אתה יכול לבדוק זאת על ידי לחיצה על כפתור "נקי" אם זמין transjector שלך. אם פתוח, זה יהיה להגדיל באופן משמעותי את זרימת לחץ מתמיד אשר ניתן לראות דרך מהעיניות - הוא יופיע כמו אדוות ופסולת בסמוך ניתן לראות פיזור.
19. אם קצה המחט סגור, אתה יכול לבחור להכניס מחט microinjection חדש או ניסיון לשבור את קצה המחט על ידי מעדנות את המחט עד קצה לוחץ מחט נגד coverslip הזכוכית, ובכך גורם מאוד סוף של קצה לשבור. האזור שבירה צריכה להיות לא יותר מאשר ^ה 1 / 5 השטח של נקודת מחט (החלק של המחט שמתחיל להתכנס לנקודה).
20. המשך עם הזריקה, ההוצאות לא יותר מ -20 - 45 דקות עבור כל פגישה microinjection (תלוי בסוג התא). ככלל, מפגשים קצרים מומלץ כדי למזער את הלחץ על התאים.
21. לאחר סיום microinjection, לשנות את התקשורת תא המנה על ידי הוספת מדיה prewarmed טריים. ואז לאפשר לתאים להתאושש במשך 30 דקות באינקובטור לפני הדמיה. זה גם יאפשר עבור אקטין להשתלב ברשת cytoskeleton הקיים.

סעיף 3: הרכבת לשכת הדמיה

החומרים הדרושים: קלטת coverglass, דו צדדי, Q-טיפים, מלקחיים, valap, קים לנגב, oxyrase, הדמיה התקשורת, להב גילוח, p200 pipette, אתנול טהור

1. בגין על ידי prewarming התקשורת הדמיה מפשיר aliquot 15 UL של Oxyrase. הקפד להגן על oxyrase רגישים מן האור. תוספת של oxyrase יהיה לצמצם במידה ניכרת את השפעות photobleaching.
2. Prewarm valap, על ידי קביעת הטמפרטורה פלטה לנמוך. לא לחמם יותר מדי / לשרוף את valap על זה יאבד את יעילותו כמו איטום.
3. נגב במורד coverglass עם kimwipe שפך עם אתנול טהור לנקות ולהסיר פסולת קטנים.
4. סטאק בגודל שווה בשני אורכים (2.5 ס"מ) של סרט דו צדדית על גבי השני, בעזרת משטח שטוח ונקי כפלטפורמה. לחצו על כל בועות אוויר שנלכדו ליצור מטוס שטוח לחלוטין.
5. באמצעות סכין גילוח, לחתוך שתי רצועות ישר לאורך ציר זמן, כך רצועת כל האמצעים 0.5 ס"מ רוחב.
6. בעזרת מלקחיים, במקום כל רצועה כנגד הקצה הארוך של coverglass שלך כך ששני הסרטים יוצר פער במרכז coverglass שלך. לחצו בעדינות על קלטת כדי להפוך חותם נחמד עם הזכוכית. רצועות של סרט ישמש מפרידי בין coverglass לבין coverslip.
7. ודא valap יש נוזלי לחלוטין לפני שאתם מתחילים את הצעד הבא.
8. אחזר התקשורת prewarmed שלך הדמיה, והוסיף 15 ul של oxyrase כדי UL 500 בכל אמצעי התקשורת.
9. Kimwipes מקפלים למשולשים ליצור 3 קצוות קשים. זה ישמש כדי ליצור משטח יבש הקלטת לדבוק ב.
10. אחזר התאים מן החממה. בעזרת מלקחיים, לתפוס פינה של coverslip. במהירות למקום coverslip על kimwipe (בצד התא הוא פונה כלפי מעלה, לא נוגעת רקמות), ולהשתמש kimwipe מקופל למחוק שני צדדים מנוגדים של coverslip כדי ליצור משטח חצי יבש (על פני השטח שבו התאים שלכם לנוח).
11. בעזרת מלקחיים, לתפוס בפינה coverslip ולמקם אותו על coverglass שלך כך משטחים יבשים מיושרים לשני הסרטים. שימו לב עכשיו יש לך שני הצדדים סגור ושני חריצים פתוחים. לאט לאט פיפטה 200 UL של הפתרון שלך הדמיה-מדיה oxyrase קרוב פתיחת אחד. חשוב לציין, בועות אוויר לא צריך להיות הציג. הפתרון צריך להישאב לתוך החדר החדש שהורכב על ידי כוחות נימי, ובכך מלא טבילה התאים בתמיסה.
12. שימוש Q-טיפ טיפה בארבע פינות coverslip שלך עם valap מומסת כדי להדביק במהירות לייצב את coverslip. תוכל להבחין כי מתייבש valap באופן מיידי (תוך שניות בטמפרטורת החדר).
13. עכשיו עם תחילת הצדדים לפתוח (סרט שאינו צד), שכב רצועה דקה של valap באמצעות Q-טיפ ומחקה שבץ צחצוח. חזור על הצדדים סגור. לאט לאט לבנות את המעיל של valap, ובכך לחזק את החותם על ידי חזרה על שלבים ציפוי. Valap צריך להיות מוגבל את הקצוות, להשאיר את מרכז coverslip ברורה.
14. לנקות בעדינות את החלק מרכז coverslip באמצעות Q-קצה עם ddH2O להסיר כל התקשורת שיורית, להיות מודע לא לרסק את התאים. חזור על שלב הניקוי עם אתנול טהור.
15. תוכלו כעת יש תא הדמיה סגורה לחלוטין אופטימיזציה עבור רבב הדמיה. בעל מארז אטום לחלוטין ימנע fluorophores שלך במהירות photobleaching.

סעיף 4: תאים הדמיה

החומרים הדרושים: הפוך מיקרוסקופ widefield, מנורה mecury, מסננים מתאימים, מקורר מצלמת CCD עם 6.7 פיקסלים מיקרון, הצמצם המספרי גבוה, שמן טבילה לתכנן-Apochromatic מטרות (60x עד 100x, או שלב DIC). רעידות השולחן. תוכנת הדמיה.

1. Prewarm השלב מיקרוסקופ כדי 37 מעלות. המקום קאמרית השלימה החדש שלך הדמיה, ולחכות 10-15 דקות בטמפרטורה לייצב לפני הדמיה.
2. התחל על ידי התמקדות בתאי שלך בתחום, מוארת, ולאחר מכן למצוא התאים מוזרקים שלך על ידי החלפת הגדרות הקרינה הנכונים. נסו לצמצם את זמן החשיפה כדי להפחית את הקרינה photobleaching.
3. חפש התאים מוזרקים שיש בריא קצוות מעוגלים המובילים. Over-הזריק תאים (תאים התפוצץ) יאופיין על ידי קצוות משוננים והוא חזר בו, הדומה filopodia רבים - להימנע הדמיה תאים אלה.
4. הגדרות רכישה יהיה תלוי בסוג התא, איכות אקטין שכותרתו, ורכיבים מיקרוסקופ. עם זאת, הגדרות החשיפה לא צריך להיות גדול מ 2 שניות, מרווח הזמן בין המסגרות צריך להיות מוגדר בין 5 ל 10 שניות. אורכים אופייניים לסדרת זמן (לכל תא הדמיה) יכול להשתנות בכל מקום בין 10 עד 30 דקות, והיא מוגבלת על ידי אפקטים photobleaching. רווח הגדרות המצלמה ניתן להפעיל כלפי מעלה כדי להגביר את האות לרעש.
5. אידיאלי רבב מאפיינים צריך כל רבב במרווחים על ידי ~ 2 רבב בקטרים ​​של השכנה הבא רבב. זה יהיה צו דגימה במרחב ובזמן אופטימלי של מבנה אקטין. עבור תאים אפיתל, רשת אקטין מנומר יופיעו הומוגנית, עם כתמי להתפשט באופן שווה ביניהם. שורות תאים כי תכונה סיבים צפופים מתח או lamellipodiaיהיה להבחין, אבל תהיה הופעה מנוקד / מנומר. הגדרות חשיפה צריך להיות מותאם לקבל את התמונות מנומר הטוב ביותר.
6. Over-microinjected התאים יהיו כתמים צפופים שאינם מופיעים להיות בדידים. סיבי סטרס לבין lamellipodia תאבד מראה מנוקד שלה.
7. תת microinjected התאים יופיעו עמום מאוד דרך העינית, המכיל speckles כי הם רחוקים אחד מהשני (> 10 speckles בנפרד) ו המופיעים מפוזרים באופן אקראי. סיבי סטרס לבין lamellipodia בתאים אלה יהיו נבדלים.
8. המפתח להשגת 'טוב' רבב בסרטים הוא שמירה להתמקד. הדבר חשוב במיוחד עבור ניתוח שלאחר מעורבים רבב זרימה ומדידות מחזור. כך את איכות ניתוח כמותי יהיה תלוי נעילה המוקד למשך זמן לשגות. זה יכול להיות מאתגר במיוחד אם את המטוס הדמיה הוא דק למדי. גורמים נוספים יהיו תלויים ביציבות המערכת מיקרוסקופ, במיוחד הדיור הבמה הקאמרית הדמיה. ניגודיות מבוסס התמקדות יכולה לשמש אם מרווח אורכי תמונה מספיקים כדי להכיל את תכונה זו. אפשרויות אחרות כוללות רכישת מערכת אינפרא אדום הקרוב התמקדות מבוסס המספק אמין התאמות בזמן אמת להתמקד. אתה יכול למצוא אלה הצעות מ ניקון, אולימפוס אסי.

סעיף 5: ניתוח qFSM

סעיף זה לא נדון בפירוט, אבל את המידע על תוכנה הניתוח ניתן למצוא כאן [5]. בקשות להוריד תוכנה יכול להתבצע באתר האינטרנט שלנו (lccb.scripps.edu).

נושאים בקורס:

• רעש כיול
• רבב זיהוי
• מעקב באמצעות גישה היברידית של מעקב תמונה מתאם מבוססי תנועה הגסה של רבב אזורים ומעקב אחר חלקיק יחיד של התנועה מפורט של כתמים בודדים.
• חישוב של האסיפה פולימר ושיעורי פירוק מן התנודות בעוצמה במהלך רבב מראה ואירועים היעלמותה.

Discussion

גורמים מרכזיים הם קריטיים עבור קבלת בהצלחה רבב תמונות, speckles טוב אבל להתחיל ולסיים עם איכות של אקטין שכותרתו fluorescently שלך. יחס גבוה של תיוג צבען מונומר אקטין, להגדיר סביב 0.4-0.7 תבטיח speckles יופיעו בהיר בדידה, ואילו חלבון הנקרא עצמו צריך להיות מסיסים חינם של אגרגטים. לא פחות חשוב הוא נוהל microinjection. כדי להבטיח הומאוסטזיס תא נורמלי (הישרדות), התאים צריכים להיות מוזרק עם הלחץ זרימה נמוכה, מציגה ריכוז נמוך של חלבון הנקרא. זה דורש מידה מסוימת של מומחיות וניסיון טכני / בהתאם לשימוש של מערכת microinjection. ככלל, פעמים זריקה קצרה (<1s) עדיפים על הזרקה פעמים כבר. מרכיב חיוני האחרון הוא מיקרוסקופ. מיקרוסקופ הפוכה יחד עם המאייר-EPI כספית מנורה, נמצאו מתקני הגרעין ביותר, תשמש כפלטפורמה מתאימה רבב הדמיה. בהנחה מסנני הקרינה נמצאים במקום הנכון, השילוב של מטרה NA גבוהה מצלמה מקורר CCD יהיה לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של כתמים בהירים. אנו ממליצים להשתמש בהגדלה גבוהה (100x), גבוה NA (> 1.3), תוכנית, יעדים apochromat שיספק רזולוציה בהירות מעולה. בתנאים אידיאליים הזרקה, בהגדלה ניתן הוריד ל 60x, הגדלת הבהירות SNR לפיקסל. רעש נמוכה, גבוה קוונטי יעיל, מקורר מצלמות CCD, עם גודל פיקסל של 6.5 מיקרון ~ הם גלאי אידיאלי, ובמקרים מסוימים יכול לפצות על בדיקות איכות ירודה ניאון. בנוסף, בדיקות חלבון שכותרתו fluorescently יכול להיות שותף הזריקו בונה cDNA (nucleoinjection) כדי לבטא את ה-GFP לחלבונים / RFP מצומד בתוך התא אותו. זה מחייב את nucleoinjection של cDNA לתוך הגרעינים של תאים, ואחריו זריקה שנייה בציטופלסמה שמסביב. לסיכום, FSM מספק תובנות חסרות תקדים לתוך הדינמיקה cytoskeleton. קבלת speckles טוב מחייב בדיקות תקין, ציוד קצת סבלנות (אימון).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C