Живая изображений Сотовые Ф-актина Динамика через Флуоресцентный Спекл микроскопия (FSM)

Summary

Выбор, микроинъекции, и обработки изображений флуоресцентно меченных F-актин с помощью флуоресцентной микроскопии спекл (ФШМ).

Abstract

В этом протоколе описываются использование флуоресцентных Спекл микроскопия (FSM) для захвата изображений с высоким разрешением актина динамика в PtK1 клеток. Уникальное преимущество автомата является ее возможность захвата движения и оборот кинетики (сборка / разборка) из F-актин сети в живых клетках. Эта методика особенно полезна при выводе количественных измерений F-актин динамика в паре с компьютерного зрения программного обеспечения (qFSM). Мы описываем отбора, микроинъекции и визуализации флуоресцентных зондов актина в живых клетках. Важно отметить, что аналогичные процедуры, применимые к визуализации других сборок macomolecular. FSM был продемонстрирован на микротрубочки, промежуточные нити, и адгезию комплексов.

Protocol

Раздел 1: Получение вашего флуоресцентно меченных актина для FSM

Необходимые материалы: очищенная актин, флуорофор (Alexa, Х-родамин рекомендуется). G-буфера, ультрацентрифуге

1. Ключевым компонентом в приобретении хороших фильмов FSM требует надлежащей маркировки актина (или других белков цитоскелета) с флуорофора на ваш выбор.
   Мы рекомендуем использовать флуорофоров от Alexa (488, 568 длин волн) и Х-родамин сукцинимидил эфир производные этой цели подвергается остатков лизина на поверхности актина.
2. При выборе флуорофора и его соответствующей длины волны, убедитесь, что микроскоп установка имеет соответствующие фильтры (возбуждения и эмиссии) и осветителей (ртутные дуговые лампы и / или лазеров) с учетом ваших флуоресцентные метки. Мы рекомендуем выбор длин волн в оранжевых до красных длин волн (560-630 нм), чтобы минимизировать последствия авто-флуоресценции и фото-повреждения и для обеспечения ее совместимости с GFP-конъюгатов.
3. Чистая актина могут быть извлечены из мышечной ткани крыс принадлежащих или курица, но требует длительной процедуры извлечения из мышц порошок ацетона. Порошок мышц ацетона можно приобрести у Invitrogen. Маркировки процедура не обсуждается в данном протоколе, но можно найти здесь [1]
4. Кроме того, вы можете приобрести меченые белки актин от нескольких производителей, включая цитоскелета Inc, и Invitrogen. Таможенные услуги маркировке также доступны через Invitrogen. Очищенная, без меток актина (как мышцы и nonmuscle актином) могут быть приобретены у ООО цитоскелета
5. Если вы решили купить или подготовить свои собственные помечены актина, вы хотите убедиться, что маркировка соотношение где-то около 0,3 до 0,7 красителей на мономер актина. Слишком высокая маркировки соотношение может эффект оборот кинетики (и обязательным для связанных белков) актиновых филаментов, а слишком низкий коэффициент маркировки приведет к бедным глядя крапинками (низкий сигнал-шум) и может привести к микроинъекции проблем (см. ниже). Это является решающим фактором для получения хорошей спекл-изображений.
6. До длительного хранения, помечены актина решение должно быть уточнены вращается со скоростью 75000 - 80000 мкг в течение 20 минут при температуре 4 градуса по Цельсию. Маркированный актина должны храниться в G-буферный раствор и все -80 градусов по Цельсию. Подготовка 2 мкл аликвоты настоятельно рекомендуется уменьшить пагубные последствия повторного замораживания-оттаивания (приводит к нерастворимые агрегаты). Воздержитесь от разоблачения помечены актина решение прямой свет (будет фотообесцвечивания флуорофоров). Мы рекомендуем использовать непрозрачной трубы микроцентрифужных для длительного хранения.

Раздел 2: Подготовка клетки и Микроинъекция меченых актина

Необходимые материалы: микроинъекции иглы, микрошприца, microloaders, нагретого СМИ клетки, инъекции буфера, ведро льда, микроскоп (фазовое кольцо, фазовый контраст цель 40X, transjector, игольчатые съемник, микроманипулятора)

1. Многие типы клеток поддаются FSM, но получать хорошие спекл изображения напрямую зависит от успеха микроинъекции процедуры. При выборе камеры для автомата, камеры должны быть большими (> 50 мкм в диаметре), должны распространяться при посеве, и естественно приверженцем субстратов (или пластиковой посуды культуры тканей). Он также помогает, если цитозоле ячейка занимает площадь больше, чем его ядра. Вышеупомянутым критериям обеспечения того, чтобы клетки поддаются микроинъекции. Успешный кандидат клеточные линии включают в себя (но не ограничиваясь) PtK1 [2,3], клеток тритона легких [4], а Aplysia нейронов [3].
2. Клетки должны быть покрыты на квадратные покровные стекла (22 х 22 мм;. Не 1-1/2), которые были кислотой мыть. Стандартное покрытие подложки могут быть применены к покровным и не повлияет на микроинъекции.
3. Правильный выбор микроинъекции иглы зависит от размера наконечника открытия. Как правило, размеры отверстия может очень размером от 0,5 мкм до такого размера, как 3 мкм. Тем не менее, мы рекомендуем введение актина требует оптимального размера открытия в пределах от 0,5 до 1 мкм. Если засорение задачи встречаются постоянно, большие размеры отверстий могут разместиться на поставку мономерные а также нежелательной полимеризованного нитей актина. Микроинъекция иглы могут быть приобретены через несколько производителей, включая Эппендорф системы, которые делают иглами femtotip микроинъекции. Либо, если коммерческие съемник иглы доступно, стеклянные трубки микроинъекции можете приобрести у Саттера, и вытащил спецификации. Для начинающих мы рекомендуем 10-20 вытащил иглы под рукой, прежде чем начать процедуру инъекции.
4. "Инъекции концентрация" Идеальный (конечная концентрация актина загружалась в иголку) актина составляет от 0,5 до 1,0 мкг / ул основаны на 40% маркировки отношение красителя мономера актина. Нижняя маркировка отношение вашего актин может быть компенсирован путем введения при более высоких концентрациях (1-3 мкг / мкл). Тем не менее, засорение частоту вашего иглабыть увеличена. Это может быть частично смягчены с помощью иглы с более широкими отверстиями. Сток концентрация актина можно развести, добавив ледяной инъекции буфера. Ледяной ddH2O также может быть использован для разбавления для быстрой инъекции. На данный момент все рабочие растворы должны быть на льду.
5. Нагрузка от 0,5 до 1,0 мкл ваш актина решения с использованием микрошприца (узкоколейная - Гамильтон), или же с помощью кончика microloader пипетки.
6. Внимательно обойтись актина решение, осторожно выпуская решение. Пузыри следует избегать, но может быть легко удалены с избыточной жидкости, окружающей пузырек.
7. Убедитесь, что актин решение полностью отдыхает на кончике иглы. Превышение решение в любом месте вдоль капилляра иглы может привести к нарушению инъекции потока.
8. Теперь, тщательно прикрепить иглу, избегая контакта с иглой, чтобы держатель форсунки. Расположите держатель так, чтобы стрелка делает 35-50 градусов к базе столик микроскопа. Нижние углы являются предпочтительными.
9. Нижняя кончик иглы, пока он едва перерывы поверхности СМИ купания ваших клеток.
10. Теперь положение кончика иглы (без снижения), так что она покоится прямо над центром цели. Если кончик иглы совмещена с целью, вы должны увидеть яркое гало через окуляр. Это конец иглы. Медленно перемещая иглу из стороны в сторону (с помощью манипулятора) может помочь более эффективно выявлять гало.
11. Отрегулируйте Z-сосредоточиться на микроскоп пока ваши клетки находятся в ясное представление. Теперь медленно опустите кончик до гало постепенно сужается, пока, наконец, сходящихся в кончике иглы - Вам нужно будет контролировать фокус (г-позиции) одновременно. Дополнительной функцией нужно обращать внимание на валу иглы, что негативно отразится линейные тени. Снижение иглы постепенно определить иглы вала. Если все сделано правильно конце иглы и ваши клетки должны быть оба в ясное представление. Незначительные корректировки фазы кольцо может быть, необходимых для улучшения контрастности.
12. Во время навигации необходимо обеспечить кончике иглы, что значительно выше ваши клетки, чтобы предотвратить нарушение кончике иглы.
13. При выборе клетки для введения, клетки со свободными краями должна быть обращена кончике иглы. Это позволит обеспечить снижение склоне ячейки (от толстой точке, где находится ядро, в самом тонком месте передней кромке) встретится кончике иглы, а не параллельно ему.
14. Иглы давление должно быть установлено на уровне 0,3 до 0,8 бар. Постоянное давление приведет к устойчивый поток актина решение.
15. После выбора ячейки вводить, поместите иглу так наконечник находится рядом с ядром (перинуклеарные регионе, толстой части камеры, где ядра непосредственно не ниже).
16. Медленно опустите, и скорректировать положение иглы до кончика удручает мембраны, в настоящее время постепенно ниже, пока кончик иглы пробил мембраны. Если игла полностью пронзила мембрану, клетка будет ярче, как только вы видите эту разницу поднять иглу, пока она больше не прикасаться к клетке. Фактические пирсинг и инъекционных процесс займет от 0,5 до 2 секунд.
17. Если все сделано правильно, формы клеток появится неизменными, в то время как слишком много инъекции приведет к быстрой ретракции края ячейки, а в некоторых случаях действительно можно увидеть ячейки взорваться.
18. Если вы не видите изменения в клетке, когда microinjecting (не становится ярче), иглы могут быть закрыты. Вы можете проверить это, нажав на "чистый" кнопку, если доступны на вашей transjector. Если открытый, это позволит значительно увеличить постоянный поток давление, которое можно увидеть через окуляры - он появится как рябь и близлежащих мусора можно увидеть расходились.
19. Если кончик иглы закрыт, вы можете выбрать, чтобы вставить новую иглу микроинъекции или пытаться сломать кончик иглы, осторожно снижение иглы до кончика иглы прижимается стекло покровное, тем самым вызывая самом конце наконечника сломаться. Поломки области должны быть не более 1 / ^5-й области острия иглы (часть иглы, которая начинает сходиться к точке).
20. Продолжайте инъекции, проводить не более 20 - 45 минут для каждого микроинъекции сессии (зависит от типа клеток). Как правило, более короткие сессии рекомендуется свести к минимуму стресс на клетки.
21. После окончания микроинъекции, изменение ячейки СМИ в блюдо, добавив свежие нагретого СМИ. Затем позволяют клеткам восстановить в течение 30 минут в инкубаторе до визуализации. Это позволит также актин интегрироваться в существующую сеть цитоскелета.

Секция 3: Сборка палаты изображений

Необходимые материалы: покровного стекла, двусторонний скотч, Q-Tips, пинцеты, valap, Ким протереть, oxyrase, визуализации информации, лезвие бритвы, P200 пиpette, чистый этанол

1. Начните с prewarming изображений средствами массовой информации и оттаивания 15 мкл аликвоту Oxyrase. Убедитесь, что для защиты светочувствительных oxyrase от света месте. Добавление oxyrase значительно уменьшит эффект фотообесцвечивания.
2. Prewarm valap, путем установки температуры горячей пластины на низком уровне. Не перегревается / записи valap для него потеряет свою эффективность в качестве герметика.
3. Протрите покровного стекла с kimwipe облили чистого этанола для очистки и удаления небольших обломков.
4. Стек две равные по размеру длины (2,5 см) из двусторонней ленты друг на друга, используя чистую плоскую поверхность в качестве платформы. Пресс каких-либо осталось воздуха для создания совершенно плоская.
5. Использование лезвие бритвы, вырезать два прямых полос вдоль длинной оси, так что каждая полоса мер 0,5 см в ширину.
6. Использование пинцета, поместить каждую полоску против длинной стороне вашей покровного стекла, так что две полоски ленты создает разрыв в центре вашего покровного стекла. Пресс мягко на ленту, чтобы сделать хорошее уплотнение со стеклом. Полосы ленты будет выступать в качестве прокладок между покровного стекла и покровным стеклом.
7. Убедитесь, что valap полностью сжиженного перед началом следующего шага.
8. Получить ваши нагретого СМИ изображений, добавляя 15 мкл oxyrase на каждые 500 мкл СМИ.
9. Сложите kimwipes на треугольники, чтобы создать 3 жестких краев. Это будет использовано для создания сухой поверхности для ленты, чтобы придерживаться на.
10. Получить ваши клетки из инкубатора. Использование щипцов, захватите угол покровное. Быстро место покровное на kimwipe (ячейка лицевой стороной вверх, не касаясь ткани), а также использовать сложенный kimwipe уничтожить двух противоположных сторон покровным создать полусухой поверхности (на поверхности, где ваши клетки отдыха).
11. Использование щипцов, захватите угол покровное и размещаете его на своем покровного стекла, так что сухой поверхности выравниваются по две полоски ленты. Обратите внимание, теперь у вас есть два закрытых сторон и двух открытых щелей. Медленно пипетки 200 мкл обработки изображений, медиа-oxyrase решение близко друг к открытию. Важно отметить, что нет пузырьков воздуха должна быть введена. Раствор должен быть высосан во вновь собрал камеру капиллярных сил, тем самым полностью погружаясь ваших клеток в растворе.
12. Использование Q-Tip мазок четырех углах покровное с топленым valap быстро наносить и стабилизировать покровное. Вы заметите, что valap высыхает мгновенно (в течение нескольких секунд при комнатной температуре).
13. Теперь, начиная с открытых сторон (без ленты сторона), положите тонкую полоску valap с помощью Q-Tip и имитировать чистку инсульта. Повторите эти действия для закрытых сторон. Постепенно наращивать слой valap, укрепляя тем самым печать, повторяя покрытие шагов. Valap должна ограничиваться края, оставляя центр покровное ясно.
14. Аккуратно очистить центральную часть покровного с помощью Q-Tip с ddH2O, чтобы удалить остатки средства массовой информации, не забывая, чтобы не раздавить клеток. Повторите стадии очистки с чистого этанола.
15. Теперь вы будете иметь полностью закрытую камеру изображения оптимизированы для спекл-изображений. Имея в полностью герметичном корпусе приведет к тому, флуорофоров от быстрого фотообесцвечивания.

Секция 4: изображения клетки

Необходимые материалы: инвертированный микроскоп широкопольных, mecury лампы, соответствующие фильтры, охлаждают ПЗС-камера с 6,7 микрон пикселей, высокой числовой апертурой, нефте-погружение план-Апохроматическая целей (60X для 100X, фазы или ДВС-синдром). Вибрация стола. Обработки фотоизображений.

1. Prewarm столике микроскопа до 37 градусов. Наведите недавно завершила изображения камеры, и ждать 10-15 минут для стабилизации температуры до изображения.
2. Начать, сосредоточив внимание ваши клетки в ярко-поля, а затем найти свой вводили клетки путем переключения правильный флуоресценции настройки. Постарайтесь свести к минимуму время флуоресценции воздействием снижения фотообесцвечивания.
3. Ищите вводили клетки, которые имеют здоровые изогнутых передних кромок. За впрыском клеток (взорвался клетки) будет характеризоваться отказался и неровными краями, напоминающие многочисленные филоподий - избегать изображения этих клеток.
4. Приобретение настройки будет зависеть от типа клеток, качество помечены актин, и микроскоп компонентов. Тем не менее, настройки экспозиции не должна быть больше, чем за 2 секунды, а интервал времени между кадрами должна быть установлена ​​от 5 до 10 секунд. Типичные длины для временных рядов (в отображаемого клеток) может варьироваться в пределах от 10 до 30 минут, и ограничивается фотообесцвечивания эффектов. Усиление настройки камеры можно повернуть вверх, чтобы увеличить сигнала к шуму.
5. Идеально спекл характеристики должна иметь каждая спекл расположенных на ~ 2 спекл диаметром до следующего соседних спекл. Это гарантирует оптимальную пространственную и временную выборки актина структуры. Для эпителиальных клеток, пятнистые сеть актиновых появится однородная, с крапинками равномерно друг от друга. Клеточные линии, которые показывают плотные волокна стресса или lamellipodiaбудут различимы, но будет иметь пунктирную / пестрый вид. Настройка экспозиции должны быть скорректированы, чтобы получить лучший пятнистые изображений.
6. Over-microinjected клетки будут иметь плотно упакованных крапинками, которые не появляются дискретным. Стресс волокон и lamellipodia потеряет свой внешний вид пунктирной.
7. Заместитель microinjected клетки появится очень тускло через окуляр, содержащие крапинками, которые далеки друг от друга (> 10 крапинками друг от друга) и появляться беспорядочно разбросанных. Стресс волокон и lamellipodia в этих клетках будут неразличимы.
8. Ключ к получению «хорошо» спекл фильмов поддержания фокуса. Это особенно важно для последующего анализа с участием спекл потока и оборота измерений. Таким образом, качество количественного анализа будет зависеть от блокировки в центре внимания в течение всего срока замедленной. Это может быть особенно сложным, если плоскости воспроизведения довольно тонкий. Другие факторы, будет зависеть от стабильности микроскопа, особенно жилья сцене и камеры изображений. Контрастность основе фокусировки может использоваться, если длина интервала изображения достаточно, чтобы разместить эту функцию. Другие варианты включают покупку ближней инфракрасной основан фокусирующей системой, которая обеспечивает надежную реальном времени регулировать фокус. Вы можете найти эти предложения от Nikon, Olympus и ASI.

Раздел 5: qFSM анализ

В этом разделе не обсуждается в деталях, но информацию по анализу программного обеспечения можно найти здесь [5]. Загрузка программного обеспечения запросы могут быть сделаны на нашем сайте (lccb.scripps.edu).

Рассматриваются следующие темы:

• Шум калибровки
• Спекл обнаружения
• Отслеживание использования гибридного подхода имиджа корреляции с отслеживанием хода грубые движения спекл районов и отслеживания одной частицы подробную движения отдельных пятен.
• Вычисление сборка полимера и разборки скоростях от интенсивности флуктуации при спекл появление и исчезновение событий.

Discussion

Несколько ключевых факторов имеют решающее значение для успешного получения спекл-изображений, каким бы хорошим крапинками начинаться и заканчиваться качество вашей флуоресцентно меченных актина. Высокий коэффициент маркировке красителей с актином мономера, расположенные вокруг 0,4 до 0,7 будет гарантировать, что крапинками появятся яркие и дискретно, в то время как меченого белка сама по себе должна быть растворимы и без агрегатов. Не менее важным является микроинъекции процедуры. Для обеспечения нормального гомеостаза клетки (и выживания), ячейки должны быть введены с низким давлением потока, представляя низкой концентрации меченых белков. Это требует некоторой степени технических знаний / опыта, связанного с использованием микроинъекции системы. Как правило, более короткое время инъекции (<1с) предпочтительнее, чем более длительное время инъекции. Последний решающий компонент микроскопом. Инвертированный микроскоп в паре с ртутью лампы эпи-осветителя, можно найти в большинстве объектов ядра, будет служить адекватной платформой для спекл-изображений. Предполагая надлежащее флуоресценции фильтры на место, сочетание высокой цели Н.А. и охлаждением ПЗС-камерой будет производить снимки с высоким разрешением ярких пятен. Мы рекомендуем использовать большом увеличении (100х), высокая Н.А. (> 1,3), план-апохромат задач, которые обеспечивают превосходное разрешение и яркость. В идеальных условиях инъекции, увеличение может быть снижена до 60X, увеличивая яркость и SNR на пиксель. Низкий уровень шума, высокий квантовый эффективный, охлаждением ПЗС-камер, с пиксельными размерами ~ 6,5 мкм идеальны детекторов, а в некоторых случаях может компенсировать низкое качество флуоресцентных зондов. Кроме того, флуоресцентно меченых зондов белок может быть со-инъекции кДНК конструкции (nucleoinjection), чтобы выразить GFP / ППП сложные белки в пределах одной клетки. Это требует nucleoinjection кДНК в ядрах клеток, а затем второй инъекции в окружающей цитоплазмой. Таким образом, FSM обеспечивает беспрецедентную взглянуть на динамику цитоскелета. Получение хороших крапинками требует надлежащего зондов, оборудования и немного терпения, немного (обучение).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C