Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

Summary

Seçimi, mikroenjeksiyon ve görüntüleme floresan ile F-aktin floresan etiketli (FSM) mikroskopi speckle.

Abstract

Bu protokolde Floresan kullanımı PtK1 hücreleri aktin dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü görüntü yakalamak için Mikroskopi (FSM) speckle açıklar. FSM eşsiz bir avantajı canlı hücrelerin içinde F-aktin ağ hareketini ve ciro kinetiği (montaj / demontaj) yakalamak için yeteneğidir. Bu teknik, bilgisayar vizyonu yazılım (qFSM) ile eşleştirilmiş, F-aktin dinamiklerinin kantitatif ölçümler çıkarmada yararlıdır. Biz seçimi, mikroenjeksiyon ve canlı hücrelerin floresan aktin probları görselleştirme açıklar. Daha da önemlisi, benzer işlemler, diğer macomolecular meclisleri görselleştirmek için geçerli. FSM mikrotübül, ara filamentler, ve yapışma kompleksleri için kanıtlanmıştır.

Protocol

Bölüm 1: FSM için floresan etiketli aktin Alınması

Gerekli malzemeler: aktin, fluorofor (Alexa, X-rodamin önerilir) saflaştırılmış. G-tampon, ultrasantrifüjdeki

1. , Iyi FSM filmleri satın bir temel bileşeni seçtiğiniz fluorofor aktin uygun etiketleme (ya da diğer hücre iskeleti proteinleri) gerektirir.
   Biz Alexa fluorophores (488, 568 dalga boylarında) ve aktin yüzeyinde lizin kalıntılarının maruz hedef X-rodamin succinimidyl ester türevleri kullanmanızı öneririz.
2. Fluorofor ve uygun dalga boyu seçerken, floresan etiketi yerleştirmek için (cıva ark lambası ve / veya lazerler) mikroskop kurulum uygun filtreler (eksitasyon ve emisyon) ve aydınlatıcı olduğundan emin olun. Biz oto-floresans ve foto-hasarı etkilerini en aza indirmek ve GFP-konjugatları ile uyumluluğu sağlamak için turuncu, kırmızı dalga boyları (560-630 nm) dalga boylarında seçilmesi tavsiye ederiz.
3. Saf aktin Sıçan veya Tavuk ait kas dokusu çıkarılan, ancak kas aseton tozu uzun bir ekstraksiyon prosedürü gerektirir. Kas aseton tozu Invitrogen satın alınabilir. Bu protokol etiketleme prosedürü tartışılan, ama burada [1] bulunabilir
4. Alternatif olarak, etiketli aktin proteinler Sitoiskelet Inc ve Invitrogen dahil olmak üzere çeşitli satıcılardan satın alabilirsiniz. Özel etiketleme hizmetleri Invitrogen üzerinden de mevcuttur. Saflaştırılmış, non-etiketli aktin (kas ve kasa invaze olmamış aktin) Sitoiskelet Inc satın alınabilir
5. Kendi etiketli aktin satın alma ya da hazırlanmak için karar olsun, etiketleme oranı aktinin monomer başına 0,3 ila 0,7 boyalar etrafında bir yerde olduğundan emin olmak istiyorum. Etiketleme oranı çok yüksek, çok düşük bir etiketleme oranı yoksul görünümlü benekler (gürültü düşük sinyal) yol ise, aktin filament ciro kinetiği (ve ilişkili proteinler bağlanarak) etkileyebilir ve mikroenjeksiyon sorunları (aşağıya bakın) neden olabilir. Bu iyi görüntü speckle almak için kritik bir faktör.
6. Uzun süreli depolama önce, etiketli aktin çözüm 75.000 az iplik tarafından açıklığa kavuşturulmalıdır - 4 santigrat derece 20 dakika 80.000 xg. Etiketli aktin G-tampon çözelti depolanır ve -80 santigrat derece tutulmalıdır. 2 uL alikotları hazırlanması çok tekrarlanan (çözünmez agregatların yol açar) donma-çözülme zararlı etkilerini azaltmak için tavsiye edilir. (Fluorophores, photobleaching olacak), doğrudan ışığa etiketli aktin çözüm maruz kaçının. Biz uzun süreli depolama için opak mikrosantrifüj tüpleri kullanmanızı öneririz.

Bölüm 2: Hücreler ve Mikroenjeksiyon etiketli aktin hazırlanması

Gerekli malzemeler: mikroenjeksiyon iğneler, mikroenjektör, microloaders, prewarmed hücre medya, enjeksiyon tampon, buz kovası, mikroskobu (faz halka, 40X faz kontrast hedefi, transjector, iğne çektirmesi, mikromanipülatör)

1. Birçok hücre tipleri için uygun FSM, ancak iyi görüntü speckle almak mikroenjeksiyon işlemi başarısını doğrudan bağlıdır. FSM hücreleri seçerken, hücreler (> 50 um çapında büyük olmalı), yaymak gerekir, kaplama, ve yüzeylerde (veya plastik doku kültürü yemekleri) doğal yapışık. Aynı zamanda hücrenin sitoplazmada çekirdeğinde daha büyük bir alanı kaplar yardımcı olur. Söz konusu kriterlere hücreler mikroenjeksiyon için uygun olduğundan emin olun. Başarılı aday hücre hatları (ancak bunlarla sınırlı değildir) PtK1 [2,3], newt akciğer hücreleri [4] ve Aplysia nöronlar [3].
2. Asitle yıkanmış; Hücreler kare cam lamelleri (hayır 1-1/2 22 x 22 mm) kaplama olmalıdır. Standart substrat kaplama lamel uygulanabilir ve mikroenjeksiyon etkilemez.
3. Mikroenjeksiyon iğneler doğru seçimi ucu açılış büyüklüğüne bağlıdır. Genellikle, delik boyutları boyutu çok büyük 3 0.5 um um. Ancak, biz bu aktin enjeksiyon 0,5 ila 1 um arasında optimal bir açılış boyutu gerektirir tavsiye ederiz. Tıkanma sorunları sürekli karşılaşılan, büyük delik boyutları monomerik teslim yanı sıra istenmeyen polimerize aktin filamentler barındırabilir. Mikroenjeksiyon iğneler femtotip mikroenjeksiyon iğne yapmak Eppendorf sistemleri de dahil olmak üzere çeşitli satıcılar aracılığıyla satın alınabilir. Alternatif olarak eğer ticari bir iğne çektirmenin, cam mikroenjeksiyon tüplerin Sutter satın alınan ve şartnameye çekilir. Yeni başlayanlar için, biz 10-20 çekti iğne enjeksiyon işlemine başlamadan önce taraftan olmasını öneriyoruz.
4. Aktin ideal enjeksiyon konsantrasyon '(iğne yüklü aktin final konsantrasyon) ug / ul 1,0 - 0,5 arasında aktin monomeri boya,% 40 etiketleme oranı dayalı. Aktinin Alt etiketleme oranı daha yüksek konsantrasyonlarda (1-3 ug / ul) enjekte edilerek telafi edilebilir. Ancak, iğne tıkanma frekansarttırılabilir. Bu, kısmen daha büyük delikleri olan iğneler kullanılarak hafifletilebilir olabilir. Aktin stok konsantrasyonu buz enjeksiyon tampon ekleyerek sulandırılmış olabilir. Buz gibi soğuk ddH2O da hızlı enjeksiyon için sulandırmak için kullanılabilir. Bu noktada tüm çalışma çözümleri buz üzerinde tutulmalıdır.
5. Yük 0.5 - 1.0 uL mikroenjektör (dar göstergesi - Hamilton) kullanarak aktin çözüm, ya da alternatif bir Microloader pipet kullanarak.
6. Dikkatli bir şekilde, yavaşça çözüm serbest bırakarak, aktin çözüm dağıtmak. Kabarcıklar kaçınılmalıdır, ancak kabarcık çevresindeki aşırı sıvı alarak kolayca silinebilir.
7. Aktin çözüm iğne ucu tamamen dinlenme olduğundan emin olun. Her yerde iğne kılcal birlikte aşırı çözüm enjeksiyon akışını bozabilir.
8. Şimdi dikkatli bir şekilde enjektör sahibine, iğne ucu ile temas kaçınarak, iğne takmak. Iğne mikroskop sahne tabanına 35-50 derecelik bir açı yapar, böylece tutucu yerleştirin. Alt açıları tercih edilmektedir.
9. Ancak yüzey hücreleri banyo medya tatili kadar iğne ucu indirin.
10. Şimdi iğne ucu (düşürmeden) doğrudan hedefi merkezi üzerinde duracak şekilde yerleştirin. Iğne ucu hedefi ile uyumlu ise, göz merceği ile parlak bir hale göreceksiniz. Bu iğne ucu sonu. Yavaş yavaş (manipülatör kullanarak) iğne yan tarafında hareketli hale bulmak daha iyi yardımcı olabilir.
11. Mikroskop z odak hücreleri net görüntü kadar ayarlayın. Şimdi, nihayet içine yakınsak iğne ucu kadar hale yavaş yavaş daraltır kadar yavaş yavaş ucu alt odaklama (z konum) aynı anda kontrol etmek gerekecektir. Aramak için bir ek özellik iğne mili, doğrusal gölge. Iğne düşürülmesi yavaş yavaş iğne mili tanımlayabilirsiniz. İğne ve hücrelerin sonuna doğru yapıldığı zaman hem de net bir görüntü olmalıdır. Faz halka hafif ayarı, kontrastı artırmak için gerekli olabilir.
12. Gezinirken, iğne ucu ve iğne ucunun kırılmasını önleyen hücreleri yukarıda olduğundan emin olun.
13. Enjekte hücreleri seçerken, hücreleri serbest kenarları iğne ucu dönük olmalıdır. Bu paralel çalışan daha iğne ucu yerine, bir araya gelecek (çekirdeğin en ince noktasına öncü bulunduğu kalın noktası) hücre azalan eğim sağlayacaktır.
14. Iğne basıncı 0,3 ila 0,8 psi ayarlanmış olmalıdır. Aktin çözüm sürekli bir akış içinde sabit bir basınç uygulanan neden olacaktır.
15. Ucu çekirdeği (perinükleer bölge, hücre çekirdeği doğrudan aşağıda kalın bir kısmı) bu yüzden bir hücre enjekte etmeye karar verdikten sonra, iğne pozisyonu.
16. Yavaş yavaş daha düşük, ve iğne ucu, iğne ucu zarı delinir kadar, aşamalı olarak daha düşük membran karartıcı kadar pozisyonunu yeniden ayarlamak. Iğne tam zarı delinir varsa, bu fark, artık hücre dokunuyor kadar iğne yükseltmek gördüğünüz gibi, hücrenin en kısa sürede, daha parlak görünecektir. Gerçek piercing ve enjekte süreci 0,5-2 saniye sürecektir.
17. Doğru yapıldığı zaman çok enjeksiyon hücre kenar hızlı retraksiyonu sonucu ise, hücre şekli değişmeden görünecektir ve bazı durumlarda aslında hücre patlayabilir göreceksiniz.
18. (Parlak olmaz) microinjecting zaman hücre değişiklikleri göremiyorsanız, iğne ucu kapalı olabilir. 'Temiz' düğmesine transjector üzerinde varsa basarak test edebilirsiniz. Açarsanız, bu göz mercekleri ile görülebilir sabit basınç akış önemli ölçüde artacak - dalgalanmalar ve yakındaki enkaz dispersiyon görülebileceği gibi görünecektir.
19. Eğer iğne ucu kapalı, böylece ucunun sonuna neden, yeni bir mikroenjeksiyon iğne veya iğne ucu, iğne presler cam lamel karşı ucu kadar iğne hafifçe düşürerek kırmaya teşebbüs eklemek için seçebilirsiniz kırılmasına neden olabilir. Kırılması alan iğne ucu (iğne bir noktaya yakınsama başlar bölümü) alanında 1 / 5 ^inci daha fazla olmalıdır.
20. Her mikroenjeksiyon oturumu (hücre tipine göre değişir) 45 dakika - 20 daha fazla harcama, enjeksiyon ile devam edin. Genel bir kural olarak, kısa oturumları hücreleri üzerindeki stresi en aza indirmek için tavsiye edilir.
21. Mikroenjeksiyon bitirdikten sonra, taze prewarmed medya ekleyerek çanak hücre ortamı değiştirmek. Daha sonra hücreler 30 dakika önce bir kuluçka görüntüleme kurtarmak için izin verir. Bu aktin mevcut hücre iskeletinin ağ içine entegre etmek için ayrıca izin verecektir.

Bölüm 3: Görüntüleme Odası Montajı

Gerekli Malzeme: coverglass, çift taraflı bant, q-ipuçları, forseps, valap, kim, oxyrase, görüntüleme medya, jilet, P200 pi silin.pette, saf etanol

1. Görüntüleme medya prewarming ve Oxyrase 15 uL kısım çözülme başlar. Işıktan ışığa oxyrase korumak için emin olun. Ayrıca, oxyrase photobleaching, etkileri büyük ölçüde azaltacaktır.
2. Sıcak plaka düşük sıcaklık ayarı, valap Prewarm. Bir dolgu olarak etkinliğini kaybedecektir valap ısınmasına / yanık bırakmayın.
3. Bir coverglass aşağı, temiz ve küçük bir enkaz kaldırmak için saf etanol ile doused bir kimwipe silin.
4. Temiz, düz bir yüzey bir platform olarak kullanarak, birbirlerinin üstüne çift taraflı bant iki eşit büyüklükte uzunlukları (2.5 cm uzunluğunda), Stack. Tamamen düz bir düzlem oluşturmak için herhangi bir hava kabarcığı basın.
5. Bir jilet kullanarak, her bir şerit genişliği 0.5 cm, böylece uzun ekseni boyunca iki düz şeritler kesti.
6. Forseps kullanarak, iki bant şeritler sizin coverglass merkezinde bir boşluk oluşturur, böylece sizin coverglass uzun kenarına her şerit yerleştirin. Cam ile güzel bir mühür bandı üzerine hafifçe bastırın. Bant şeritler coverglass ve lamel arasında yer tutucular olarak hareket edecektir.
7. Bir sonraki adıma başlamadan önce valap tamamen sıvılaştırılmış emin olun.
8. Medya her 500 uL oxyrase 15 ul ekleyerek, prewarmed görüntüleme medya al.
9. Katlama Kimwipes üçgen içine 3 sert kenarları oluşturmak için. Bu sopa bandı için kuru bir yüzey oluşturmak için kullanılır.
10. Inkübatör hücreler al. Kullanarak, forseps lamel bir köşe kapmak. Hızla bir kimwipe lamel (hücre yan dokuya dokunmadan, yukarı bakacak şekilde) yerleştirin ve yarı kuru bir yüzey oluşturmak için lamel iki karşıt taraf silmek için katlanmış kimwipe kullanmak (yüzey hücreleri geri kalanı).
11. Forseps kullanarak, kuru yüzeylerde iki bant şeritler hizalanmış olduğunu bu nedenle bir köşeye lamel kapmak ve coverglass üzerine yerleştirin. Kapalı iki taraf ve iki açık yarıklar var şimdi dikkat edin. Yakın bir açılış görüntüleme-medya-oxyrase çözüm Yavaşça pipet 200 uL. Önemlisi, herhangi bir hava kabarcıkları getirilmelidir. Böylece tam çözüm hücreleri çeker, çözüm kılcal güçleri tarafından yeni oluşturulan odasına kadar emdi olmalıdır.
12. Q-tip dab hızlı yapıştırmayın erimiş valap ile lamel dört köşe kullanma ve lamel stabilize. Farkedeceğiniz anında valap kurur (oda sıcaklığında saniye içinde).
13. Şimdi açık taraf (non-teyp tarafı) ile başlayan, bir Q-tip ve fırçalama inme taklit valap ince bir şerit yatıyordu. Kapalı taraf için de tekrarlayın. Böylece kaplama adımları tekrarlayarak mühür takviye valap ceket, yavaş yavaş oluşturmak. Valap lamel merkezinde açık bırakarak, kenarları kapalı olmalıdır.
14. Hücrelerin ezmek için değil, dikkatli olmak, herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için ddH2O Q-ucu kullanarak lamel merkez kısmına hafifçe temizleyin. Saf etanol ile temizlik adımı tekrarlayın.
15. Artık tamamen kapalı görüntüleme odası, görüntüleme speckle için optimize olacaktır. Tamamen kapalı bir muhafaza hızlı photobleaching fluorophores önleyecektir.

Bölüm 4: Görüntüleme hücreleri

Gerekli malzemeler: 6.7 mikron piksel, Yüksek sayısal diyafram, yağ daldırma planı Apochromatic hedefleri (60X 100X, faz ya da DIC) ile ters widefield mikroskop, mecury lamba, uygun filtreler, soğutmalı CCD kamera. Titreşim tablosu. Görüntüleme yazılımı.

1. 37 derece için mikroskop sahne Prewarm. Yeni tamamlanan görüntüleme odasına yerleştirin ve görüntüleme önce stabilize etmek için sıcaklık 10-15 dakika bekleyin.
2. Parlak alan hücrelerin odaklanarak başlatın ve sonra doğru floresan ayarlarını değiştirir enjekte hücreleri bulmak. Photobleaching azaltmak için floresan maruz kalma süresini en aza indirmek için deneyin.
3. Enjekte edilen hücrelerin sağlıklı önde gelen kıvrımlı kenarları bakın. Aşırı enjekte edilen hücrelerin (patladı hücreleri) geri çekilir ve pürüzlü kenarlar ile karakterize, çok sayıda filopodia benzer olacak - bu hücrelerin görüntüleme önlemek.
4. Toplama ayarları etiketli aktin hücre tipi, kalitesi ve mikroskop bileşenleri bağlıdır. Ancak, pozlama ayarları 2 saniye daha fazla olması gerektiğini ve kareler arasındaki zaman aralığı 5 ile 10 saniye arasında ayarlanabilir olmalıdır. Tipik bir zaman serisi için boyları (görüntülü hücre başına) herhangi bir yerde 10 ila 30 dakika arasında değişebilir ve photobleaching etkileri sınırlıdır. Kamera ayarları Kazanç gürültü sinyali artırmak için açılabilir.
5. Ideal özellikleri bir sonraki komşu speckle çapları speckle her ~ 2 aralıklı speckle olmalıdır speckle. Bu aktin yapısının optimal mekansal ve zamansal örnekleme garanti. Epitel hücreleri için, benekli aktin ağ benek eşit dışında yayılmış, homojen görünecektir. Yoğun stres lifleri veya lamellipodia özelliği hücre hatlarıayırt edilebilir, ancak bir noktalı / benekli görünüme sahip. Pozlama ayarları benekli en iyi görüntü almak için ayarlanabilir olmalıdır.
6. Aşırı microinjected hücrelerin ayrık olarak görünmüyor sık ​​donatılı benekler var. Stres elyaf ve lamellipodia noktalı görünümünü kaybedersiniz.
7. Altı microinjected hücreleri uzak (> 10 benekler dışında) ve dağınık rastgele görünen benekler içeren, mercek ile çok loş görünecektir. Stres elyaf ve lamellipodia bu hücrelerin ayırt edilemez.
8. 'Iyi' elde etmek için Anahtar filmleri odaklanmayı sürdürürken speckle. Bu akışı ve ciro ölçümleri speckle içeren sonrası analizi için özellikle önemlidir. Bu nedenle kantitatif analiz kalitesini geçen zaman süresi için odak kilitleme bağlıdır. Görüntü düzlemi oldukça ince ise özellikle zor olabilir. Diğer faktörler mikroskop sistemi istikrar, özellikle sahne konut ve görüntüleme odası bağlıdır. Kontrast-tabanlı odaklama, görüntü aralığı uzunlukları bu özelliği karşılamak için yeterli olup olmadığı kullanılabilir. Diğer seçenekler, güvenilir ve gerçek zamanlı odak ayarlamaları sağlar bir yakın-kızılötesi tabanlı odaklama sistemi satın içerir. Nikon, Olympus ve ASI bu teklifleri bulabilirsiniz.

Bölüm 5: qFSM analizi

Bu bölümde ayrıntılı olarak ele değil, ancak analiz yazılımı bilgi burada [5] bulunabilir. Yazılım yükleme isteklerini web sitemizi (lccb.scripps.edu) yapılabilir.

Konu Başlıkları:

• Gürültü kalibrasyon
• Algılama speckle
• Kaba hareket görüntü korelasyonu tabanlı izleme melez bir yaklaşım kullanarak Takip, bireysel benekler ayrıntılı hareket alanları ve tek bir parçacık izleme speckle.
• Hesaplama sırasında yoğunluk dalgalanmaları polimer montaj ve demontaj oranları görünüm ve ortadan kaybolma olayları speckle.

Discussion

Başarıyla speckle görüntüler elde etmek için birkaç anahtar faktör çok önemlidir, ancak iyi benekler floresan etiketli aktin kalitesi ile başlar ve biter. Etiketli protein kendisi çözünür ve agrega ücretsiz olmalıdır 0,7 0,4 çevresinde aktin monomeri, boya, yüksek bir etiketleme oranı, benekler ve ayrık parlak görünmesini sağlayacaktır. Aynı derecede önemli olan mikroenjeksiyon işlemi. Normal hücre homeostazının sağlamak için (ve hayatta kalma), hücreler tanıtan etiketli protein konsantrasyonu düşük, düşük akış basıncı ile enjekte edilir. Bu mikroenjeksiyon sisteminin kullanımı ile ilgili bazı teknik uzmanlık / deneyim derecesi gerektirir. Genel bir kural olarak, kısa enjeksiyon süreleri (<1sn) uzun enjeksiyon defadan fazla tercih edilmektedir. En son önemli bir bileşeni mikroskop. En temel tesislerinde bulunan cıva lambası epi-ışığı, eşleştirilmiş bir inverted mikroskop, görüntüleme speckle için uygun bir platform olarak hizmet verecek. Uygun floresan filtreleri yerine varsayarak kombinasyonu yüksek NA objektif ve soğutmalı bir CCD kamera, yüksek çözünürlüklü görüntüler parlak benek üretecektir. Biz, üstün çözünürlük ve parlaklık sağlayacaktır yüksek büyütme (100X), yüksek NA (> 1.3), plan-apochromat hedefleri kullanmanızı öneririz. Ideal bir enjeksiyon koşullar altında, büyütme piksel başına parlaklık ve SNR artan, 60X için düşürülmüştür olabilir. ~ 6.5 mikron piksel boyutları ile düşük gürültü, yüksek kuantum verimli, soğutmalı CCD kamera, ideal dedektörleri ve bazı durumlarda düşük kaliteli floresan problar için telafi edebilir. Ayrıca, floresan etiketli protein probları aynı hücre içinde ifade GFP / RFP konjuge proteinler cDNA yapıları (nucleoinjection) ile birlikte enjekte edilir. Bu, ikinci bir enjeksiyon yoluyla çevreleyen sitoplazma hücre çekirdekleri içine cDNA nucleoinjection gerektirir. Özetle, FSM sitoskeleton dinamikleri benzeri görülmemiş anlayışlar sağlar. Iyi benekler elde edilmesi uygun probları, ekipman ve biraz sabır (eğitim) gerektirir.

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C