Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

Summary

Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).

Abstract

Neste protocolo, descrevemos o uso de Microscopia fluorescente Speckle (FSM) para capturar imagens de alta resolução de actina na dinâmica PtK1 células. A única vantagem do FSM é sua capacidade de captar o movimento e cinética volume de negócios (montagem / desmontagem) da rede de F-actina dentro de células vivas. Esta técnica é particularmente útil em derivar medidas quantitativas de F-actina dinâmica quando emparelhado com o computador de software de visão (qFSM). Descrevemos a seleção microinjeção, e visualização de sondas fluorescentes de actina em células vivas. Importante, procedimentos semelhantes são aplicáveis ​​a visualizar conjuntos macomolecular outros. FSM tem sido demonstrado por microtúbulos, filamentos intermediários, e os complexos de adesão.

Protocol

Seção 1: Obtenção do seu actina fluorescente etiquetado para FSM

Materiais necessários: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga

1. Um componente chave para a aquisição de filmes FSM boa exige a rotulagem adequada de actina (ou outras proteínas do citoesqueleto) com o fluoróforo de sua escolha.
   Recomendamos o uso de fluoróforos Alexa (488, 568 comprimentos de onda) e X-rodamina derivados de éster succinimidyl que a meta exposta resíduos de lisina sobre a superfície da actina.
2. Ao escolher o seu fluoróforo e seu comprimento de onda adequado, assegurar que sua configuração de microscópio tem os filtros adequados (excitação e emissão) e iluminadores (de vapor de mercúrio da lâmpada e / ou lasers) para acomodar sua etiqueta fluorescente. Recomendamos selecionar comprimentos de onda na laranja para comprimentos de onda vermelho (560-630 nm) para minimizar os efeitos da auto-fluorescência e foto danos e garantir a sua compatibilidade com GFP-conjugados.
3. Actina pura pode ser extraído de tecido muscular pertencente a Rat ou frango, mas requer um longo procedimento de extração do pó de acetona muscular. Pó de acetona muscular pode ser comprado de Invitrogen. O procedimento de rotulagem não é discutido neste protocolo, mas pode ser encontrada aqui [1]
4. Alternativamente, você pode comprar as proteínas actina marcada por vários fabricantes, incluindo Citoesqueleto Inc., e Invitrogen. Serviços de rotulagem personalizadas também estão disponíveis através Invitrogen. Purificada, não-rotulados de actina (actina músculo e nonmuscle) pode ser comprado de Citoesqueleto Inc.
5. Se você decidir comprar ou preparar o seu próprio rótulo de actina, que pretende assegurar que o rácio de rotulagem é algo em torno de 0,3-0,7 por corantes monômero de actina. Muito alto índice de rotulagem podem afetar a cinética de volume de negócios (e ligação às proteínas associadas) do filamento de actina, enquanto uma proporção muito baixa rotulagem vai levar a manchas pobres procurando (baixo sinal de ruído) e pode causar problemas microinjeção (veja abaixo). Este é um fator crítico para conseguir boas imagens speckle.
6. Antes do armazenamento a longo prazo, a solução de actina rotulados devem ser esclarecidas por girando a 75.000 - 80.000 xg por 20 minutos a 4 graus Celsius. Actina rotulado deve ser armazenado em G-buffer solução e mantidos -80 graus Celsius. Preparando-se alíquotas de 2 uL é altamente recomendado para reduzir os efeitos prejudiciais de congelamentos e descongelamentos repetidos (leva a agregados insolúveis). Abster-se de expor a solução actina marcados à luz direta (será fotobranqueamento de fluoróforos). Recomendamos a utilização de tubos de microcentrífuga opaco para armazenamento a longo prazo.

Seção 2: Preparação de Células e microinjeção de actina rotulados

Materiais necessários: agulhas microinjeção, micro, microloaders, a mídia celular pré-aquecida, buffer de injeção, balde de gelo, microscópio (anel fase, o objetivo de contraste de fase 40X, transjector, agulha extrator, micromanipulador)

1. Muitos tipos de células são passíveis de FSM, mas ficando bom speckle imagens é diretamente dependente do sucesso do procedimento microinjeção. Ao selecionar células para FSM, as células devem ser grandes (> 50 um de diâmetro), deve se espalhar quando banhado, e ser naturalmente aderente sobre substratos (ou placas de cultura de tecido de plástico). Também ajuda se citosol da célula ocupa uma área maior do que o seu núcleo. Os critérios acima referidos assegurar que as células são passíveis de microinjeção. Linhagens de células bem sucedidos candidatos incluem (mas não limitado a) PtK1 [2,3], as células do pulmão newt [4], neurônios e Aplysia [3].
2. As células devem ser semeadas em lamínulas quadrados (22 x 22 mm;. 1-1/2 não) que tenham sido lavada com ácido. Revestimento de substrato padrão pode ser aplicado para as lamelas e não afetará microinjeção.
3. A correta seleção de agulhas microinjeção é dependente do tamanho da abertura da ponta. Normalmente, o tamanho buraco pode muito em tamanho de 0,5 UM para tão grande como 3 um. No entanto, recomendamos que a injeção de actina requer um tamanho de abertura ideal entre 0,5-1 um. Se os problemas de entupimento são encontradas de forma consistente, tamanhos maiores podem acomodar buraco para a entrega de monomérica, bem como indesejados filamentos de actina polimerizada. Microinjeção agulhas podem ser adquiridos através de vários fornecedores, incluindo sistemas de Eppendorf que fazem agulhas microinjeção femtotip. Alternativamente, se um extrator de agulhas comercial está disponível, tubos de vidro pode microinjeção comprado de Sutter, e puxou a especificação. Para os iniciantes, é recomendável ter puxado 20/10 agulhas na mão antes de iniciar o procedimento de injeção.
4. "Concentração de injecção" ideal (concentração final de actina carregado em sua agulha) de actina é entre 0,5-1,0 ug / ul baseado em uma relação de rotulagem de 40% de corante para monômero de actina. Uma baixa relação de rotulagem de seu actina pode ser compensada pela injeção em concentrações mais elevadas (1-3 ug / ul). No entanto, a freqüência do seu entupimento da agulhaser aumentado. Isto pode ser parcialmente aliviado pelo uso de agulhas com aberturas maiores. Concentração de ações de actina pode ser diluído adicionando gelada buffer de injeção. Gelada ddH2O também pode ser usado para diluir para injectáveis ​​rápido. Neste ponto todas as soluções de trabalho devem ser mantidos em gelo.
5. Carga 0,5-1,0 uL da solução de actina, utilizando uma micro (de bitola estreita - Hamilton), ou, alternativamente, usando um microloader ponta da pipeta.
6. Cuidadosamente dispensar a solução de actina, liberando suavemente a solução. Bolhas devem ser evitadas, mas podem ser facilmente removidas, tomando-se o excesso de líquido ao redor da bolha.
7. Garantir que a solução de actina está descansando completamente na ponta da agulha. Excesso de solução em qualquer lugar ao longo do capilar da agulha pode interromper o fluxo de injeção.
8. Agora, coloque a agulha com cuidado, evitando contato com a ponta da agulha, ao titular do injetor. Posição do suporte, de modo que a agulha faz um ângulo de 35-50 para a base do palco microscópio. Ângulos inferiores são preferidas.
9. Abaixe a ponta da agulha até que mal rompe a superfície da mídia banhos suas células.
10. Agora posicione a ponta da agulha (sem baixar) para que ela repousa diretamente acima do centro do objetivo. Se a ponta da agulha está alinhada com o objetivo, você deve ver um halo luminoso através da ocular. Este é o fim da ponta da agulha. Se movendo lentamente para o lado da agulha para o lado (usando o manipulador) pode ajudar a localizar o melhor halo.
11. Ajustar o foco z-on do microscópio até as suas células estão em visão clara. Agora, abaixe lentamente a ponta até o halo constricts gradualmente até que finalmente convergindo para a ponta da agulha - você terá que controlar o foco (z-posição) simultaneamente. Uma característica adicional é a olhar para o eixo da agulha, que vai lançar sombras linear. Abaixando a agulha irá gradualmente define o eixo da agulha. Quando feito corretamente a ponta da agulha e suas células devem ser ambos na visão clara. Ligeiro ajuste do anel de fase pode ser necessária para melhorar o contraste.
12. Quando estiver navegando, certifique-se da ponta da agulha está bem acima de suas células para impedir a quebra da ponta da agulha.
13. Ao selecionar células para injetar, as células com bordas livres deve estar voltado para a ponta da agulha. Isso irá garantir inclinação declínio da célula (do ponto mais espesso, onde reside o núcleo, para o ponto mais fino da borda) se reunirá na ponta da agulha, ao invés de correr paralela a ele.
14. A pressão da agulha deve ser fixada em 0,3-0,8 psi. A constante pressão aplicada resultará em um fluxo constante de solução de actina.
15. Depois de decidir sobre uma célula para injetar, a posição de sua agulha para a ponta fica ao lado do núcleo (região perinuclear, parte mais grossa da célula onde o núcleo não está diretamente abaixo).
16. Abaixe lentamente, e reajustar a posição da agulha até que a ponta é deprimente a membrana, agora um pouco mais baixa até a ponta da agulha perfurou a membrana. Se a agulha estiver completamente perfurado a membrana, a célula irá aparecer mais brilhante, assim como você vê essa diferença levantar a agulha até que não é mais tocar no celular. O piercing reais e processo de injeção terá 0,5-2 segundos.
17. Quando feito corretamente, a forma da célula aparecerá inalterado, ao passo que injeções muito vai resultar em retração rápida da borda da célula e, em alguns casos, você vai realmente ver o celular explodir.
18. Se você não vê mudanças na célula quando microinjecting (não fica mais brilhante), a ponta da agulha pode ser fechado. Você pode testar isso pressionando o botão 'clean' se disponível no seu transjector. Se abrir, isso irá aumentar significativamente o fluxo constante pressão que pode ser visto através da ocular - ele irá aparecer como ondulações e detritos nas proximidades pode ser visto dispersar.
19. Se a ponta da agulha está fechado, você pode optar por inserir uma agulha microinjeção novo ou tentar quebrar a ponta da agulha delicadamente abaixar a agulha até que a ponta da agulha pressiona contra a lamela de vidro, causando assim o fim da ponta para quebrar. A área de quebra não deve ser mais do que um ^dia 05/01 da área da ponta da agulha (a parte da agulha que começa a convergir para um ponto).
20. Continue com a injeção, não gastar mais de 20-45 minutos para cada sessão de microinjeção (vai depender do tipo de célula). Como regra geral, as sessões mais curtas são recomendadas para minimizar o estresse nas células.
21. Depois de terminar a microinjeção, alterar a mídia celular no prato, adicionando novas mídias pré-aquecido. Em seguida, permitem que as células para recuperar por 30 minutos em uma incubadora antes de imagem. Isso também irá permitir a actina para se integrar na rede de citoesqueleto existente.

Seção 3: Montagem da Câmara de imagem

Materiais necessários: lamela, fita dupla face, q-dicas, fórceps, valap, kim wipe, oxyrase, mídia de imagem, lâmina de barbear, p200 piPette, etanol puro

1. Comece por pré-aquecimento a mídia de imagens e descongelamento de uma alíquota de 15 uL de Oxyrase. Certifique-se de proteger o oxyrase fotossensíveis da luz. A adição de oxyrase vai reduzir muito os efeitos da fotodegradação.
2. Pré-aquecer o valap, definindo a temperatura da placa quente para baixo. Não sobreaquecer / queimar o valap para ela perderá sua eficácia como um selante.
3. Limpe uma lamela com uma kimwipe encharcados com etanol puro para limpar e remover detritos de pequeno porte.
4. Empilhar duas iguais comprimentos de tamanho (2,5 cm de comprimento) de fita dupla face em cima uns dos outros, usando uma superfície limpa e plana como uma plataforma. Pressione para fora todas as bolhas de ar aprisionadas para criar um avião completamente plana.
5. Usando uma lâmina de barbear, cortar duas tiras retas ao longo do eixo, de modo que cada tira medidas 0,5 cm de largura.
6. Utilizando uma pinça, coloque cada tira contra a borda longa de sua lamela para que as duas tiras de fita cria uma lacuna no centro de sua lamela. Pressione suavemente a fita para fazer um selo agradável com o vidro. As tiras de fita irá atuar como espaçadores entre a lamínula ea lamela.
7. Verifique se o valap completamente liquefeito antes de começar o próximo passo.
8. Recuperar sua mídia de imagens pré-aquecida, adicionar 15 ul de oxyrase a cada 500 uL de mídia.
9. Kimwipes vezes em triângulos para criar três arestas duras. Isso será usado para criar uma superfície seca para a fita de pau-a.
10. Recuperar as células da incubadora. Utilizando uma pinça, pegue um canto da lamela. Rapidamente colocar a lamela numa kimwipe (lado da pilha é virada para cima, sem tocar no tecido), e usar o kimwipe dobrado para limpar dois lados opostos da lamela para criar uma superfície semi-seca (na superfície onde seu descanso células).
11. Utilizando uma pinça, pegue um canto a lamela e colocá-lo em seu lamínula de forma que as superfícies secas são alinhados com as duas tiras de fita. Observe agora você tem dois lados fechados e duas fendas abertas. Lentamente pipeta 200 uL de sua solução de imagem-media-oxyrase perto de uma abertura. Importante, sem bolhas de ar deve ser introduzido. A solução deve ser sugado para dentro da câmara recém-montado por forças capilares, mergulhando assim por completo as suas células em solução.
12. Usando um dab Q-Tip os quatro cantos da sua lamela com valap derreteu rapidamente apor e estabilizar as lamelas. Você notará que a seca valap instantaneamente (dentro de segundos à temperatura ambiente).
13. Começando agora com as laterais abertas (fita não-lateral), coloque uma tira fina de valap usando um Q-Tip e imitando um derrame escovação. Repita o procedimento para as laterais fechadas. Lentamente construir o brasão de valap, reforçando assim o selo repetindo as etapas de revestimento. O valap deve ser confinada às bordas, deixando o centro da lamela claro.
14. Limpar delicadamente a parte central da lamela usando um Q-ponta com ddH2O de remover qualquer mídia residual, estar atento para não esmagar as células. Repita o passo de limpeza com etanol puro.
15. Você agora terá uma câmara de imagem completamente fechado otimizado para speckle imagem. Ter um gabinete totalmente fechado irá impedir o seu fluoróforos de forma rápida fotodegradação.

Seção 4: células de imagem

Materiais necessários: microscópio invertido campo amplo, lâmpada Mecury, filtros apropriados, resfriado CCD da câmera com 6,7 micron pixels, abertura numérica de alta, o óleo de imersão plano Apocromático objectivos (60X a 100X fase ou DIC). Mesa de vibração. Software de imagem.

1. Pré-aquecer o palco microscópio para 37 graus. Coloque a sua câmara de imagem recém-concluído, e esperar 10-15 minutos para a temperatura se estabilize antes de imagem.
2. Comece por focar suas células no campo-Bright, e depois encontrar o seu células injetadas, alternando as configurações corretas de fluorescência. Tentar minimizar o tempo de exposição de fluorescência para reduzir a fotodegradação.
3. Procure por células injetadas que têm curvas saudáveis ​​bordos de ataque. Over-injetaram células (células explodiu) será caracterizado por bordas irregulares e retraído, assemelhando-se filopodia numerosos - evitar imagens dessas células.
4. Configurações aquisição vai depender do tipo de célula, a qualidade da actina rotulados, e os componentes do microscópio. No entanto, as configurações de exposição não deve ser superior a 2 segundos, e intervalo de tempo entre os quadros devem ser fixados entre 5 e 10 segundos. Comprimentos típico para uma série de tempo (por célula imaged) pode variar entre 10 a 30 minutos, e está limitada por efeitos de fotodegradação. Ajustes de ganho na câmera pode ser girado para cima para aumentar o sinal ao ruído.
5. Ideal speckle características deve ter cada speckle espaçadas por ~ 2 speckle diâmetros para a vizinha próxima speckle. Isto garante amostragem espacial e temporal ideal da estrutura de actina. Para células epiteliais, a rede de actina salpicado aparecerá homogênea, com manchas uniformemente separados. Linhagens de células que apresentam fibras de stress densa ou lamellipodiaserão distinguíveis, mas terá uma aparência pontilhada / salpicada. As configurações de exposição deve ser ajustado para obter as melhores imagens salpicada.
6. Over-microinjeção células terão manchas densamente que não parecem ser discretos. Fibras de stress e as lamellipodia perderá sua aparência pontilhada.
7. Sub-microinjeção células aparecerá muito fraca através da ocular, contendo manchas que estão distantes (> 10 manchas de intervalo) e aparecendo aleatoriamente dispersos. Fibras de stress e as lamellipodia nessas células serão indistinguíveis.
8. Chave para a obtenção de "bom" speckle filmes é manter o foco. Isto é particularmente importante para o pós-análise envolvendo speckle fluxo e medições de volume de negócios. Assim, a qualidade da análise quantitativa dependerá de bloqueio no foco para a duração do lapso de tempo. Isto pode ser particularmente difícil se o plano de imagem é bastante fino. Outros fatores dependerá da estabilidade do sistema microscópio, particularmente a carcaça de palco e da câmara de imagem. Baseado em contraste com foco pode ser usado se comprimentos intervalo de imagem são suficientes para acomodar esse recurso. Outras opções incluem a compra de um infravermelho próximo sistema baseado focando confiável que fornece ajustes em tempo real foco. Você pode encontrar essas ofertas da Nikon, Olympus e ASI.

Seção 5: Análise qFSM

Esta seção não é discutido em detalhe, mas a informação sobre o software de análise pode ser encontrada aqui [5]. Pedidos de download do software podem ser feitas em nosso site (lccb.scripps.edu).

Tópicos abordados:

• Calibração do ruído
• Speckle detecção
• Rastreamento usando uma abordagem híbrida de monitoramento de imagem de correlação baseado do movimento grosseiros das áreas speckle e rastreamento única partícula do movimento detalhado de manchas individuais.
• Computação da assembléia de polímero e as taxas de desmontagem das flutuações de intensidade durante speckle aparência e eventos desaparecimento.

Discussion

Vários fatores importantes são cruciais para o êxito da obtenção de imagens speckle, manchas no entanto bom começar e terminar com a qualidade do seu actina fluorescente etiquetado. A relação de rotulagem elevado de tintura para actina monômero, situado em torno de 0,4-,7 irá garantir que os salpicos aparecerá brilhante e discreta, enquanto a proteína em si deve ser rotulado solúvel e livre de agregados. Igualmente importante é o procedimento de microinjeção. Para garantir a homeostase celular normal (e sobrevivência), as células precisam para ser injetado com uma pressão de baixa vazão, apresentando uma baixa concentração de proteína rotulados. Isto requer algum grau de conhecimento técnico / experiência com relação ao uso do sistema de microinjeção. Como regra geral, menor tempo de injeção (<1s) têm preferência sobre tempos mais longos de injeção. O último componente crucial é o microscópio. Um microscópio invertido emparelhado com uma lâmpada de mercúrio, epi-iluminador, encontrado na maioria das instalações do núcleo, servirá como uma plataforma adequada para speckle imagem. Assumindo que os filtros adequados de fluorescência estão no lugar, a combinação de um objectivo NA alta e uma câmera CCD refrigerado irá produzir imagens de alta resolução de tonalidades claras. Recomendamos o uso de grande aumento (100X), alta NA (> 1,3), plano de Apochromat-objectivos que irá proporcionar uma resolução superior e brilho. Em condições de injeção ideal, a ampliação pode ser reduzido para 60X, aumentando o brilho eo SNR por pixel. Baixo ruído, alta eficiência quântica, câmeras CCD refrigerado, com tamanhos de pixel de ~ 6,5 microns são detectores ideal, e em alguns casos, podem compensar as sondas fluorescentes de baixa qualidade. Além disso, as sondas proteína fluorescente etiquetado pode ser co-injetados com construções de cDNA (nucleoinjection) para expressar GFP / RFP proteínas conjugadas dentro da mesma célula. Isso requer o nucleoinjection de cDNA para o núcleo das células, seguido por uma segunda injecção no citoplasma circundante. Em resumo, FSM fornece insights sem precedentes na dinâmica do citoesqueleto. Obtenção de bons manchas requer as sondas adequadas, equipamentos e um pouco de paciência (treinamento).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C