Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

Summary

Sélection, la microinjection, et l'imagerie de fluorescence étiqueté F-actine fluorescente via chatoiement de microscopie (FSM).

Abstract

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de la microscopie fluorescente chatoiement (FSM) pour capturer des images haute résolution de la dynamique de l'actine dans les cellules PtK1. Un avantage unique de la FSM est sa capacité à capturer le mouvement et la cinétique chiffre d'affaires (montage / démontage) du réseau de la F-actine dans les cellules vivantes. Cette technique est particulièrement utile dans découlant des mesures quantitatives de F-actine dynamiques quand il est associé avec le logiciel de vision par ordinateur (qFSM). Nous décrivons la sélection, la micro-injection et la visualisation des sondes fluorescentes actine dans les cellules vivantes. Surtout, des procédures similaires sont applicables aux assemblées macomolecular visualisant les autres. FSM a été démontrée pour les microtubules, filaments intermédiaires, et des complexes d'adhérence.

Protocol

Section 1: Obtention de votre actine marqués par fluorescence pour le FSM

Matériel requis: purifier l'actine, fluorophore (Alexa, X-rhodamine recommandé). G-tampon, ultracentrifugeuse

1. Un élément clé de l'acquisition des films FSM bonnes nécessite l'étiquetage adéquat de l'actine (ou d'autres protéines du cytosquelette) avec le fluorophore de votre choix.
   Nous vous recommandons d'utiliser des fluorophores d'Alexa (488, 568 longueurs d'onde) et X-rhodamine dérivés d'ester de succinimidyle cette cible exposée résidus lysine sur la surface de l'actine.
2. Lorsque vous choisissez vos fluorophore et sa longueur d'onde appropriée, s'assurer que la configuration de votre microscope a les filtres appropriés (excitation et d'émission) et enlumineurs (arc de mercure de la lampe et / ou les lasers) pour répondre à vos marqueur fluorescent. Nous recommandons de sélectionner les longueurs d'onde dans l'orange pour les longueurs d'onde rouge (560-630 nm) pour minimiser les effets de l'auto-fluorescence et photo-dommages et d'assurer sa compatibilité avec GFP-conjugués.
3. Actine pure peut être extraite de tissus musculaires appartenant à rat ou de poulet, mais nécessite une procédure d'extraction à partir de poudre d'acétone longs muscles. Poudre acétonique musculaires peuvent être achetés chez Invitrogen. La procédure d'étiquetage n'est pas abordé dans ce protocole, mais peut être trouvé ici [1]
4. Alternativement, vous pouvez acheter des protéines actine marqué à partir de plusieurs fournisseurs, y compris du cytosquelette Inc, et Invitrogen. Des services d'étiquetage personnalisées sont également disponibles par le biais d'Invitrogen. Purifiée, non marqué d'actine (actine musculaire et deux non musculaires) peuvent être achetés à partir du cytosquelette Inc
5. Que vous décidiez d'acheter ou de préparer vos propres actine étiquetées, vous voulez vous assurer que le ratio de l'étiquetage se situe autour de 0,3 à 0,7 colorants par monomère d'actine. Trop haut un ratio d'étiquetage peuvent affecter la cinétique chiffre d'affaires (et la liaison aux protéines associées) du filament d'actine, tandis que trop faible le ratio d'étiquetage conduire à une mauvaise speckles recherche (faible signal au bruit) et peut causer des problèmes de micro-injection (voir ci-dessous). Ceci est un facteur critique pour obtenir de bons chatoiement des images.
6. Avant le stockage à long terme, la solution d'actine étiquetés devraient être clarifiés par centrifugation à 75 000 - 80 000 xg pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius. Actine étiquetés doivent être stockés dans G-solution tampon et conservés -80 degrés Celsius. Préparer des aliquotes de 2 pl est fortement recommandé de réduire les effets néfastes de la répétition de congélation-décongélation (conduit à des agrégats insolubles). S'abstenir d'exposer la solution d'actine marqués à la lumière directe (ne sera photoblanchiment des fluorophores). Nous vous recommandons d'utiliser des microtubes opaques pour le stockage à long terme.

Section 2: Préparation des cellules et microinjection de l'actine étiquetés

Matériel requis: aiguilles de microinjection, microseringue, microloaders, les médias cellules préchauffée, tampon d'injection, un seau de glace, un microscope (anneau de phase, l'objectif à contraste de phase 40x, transjector, aiguille extracteur, micromanipulateur)

1. Nombreux types cellulaires sont susceptibles d'être FSM, mais obtenir de bonnes images de speckle est directement dépendante de la réussite de la procédure de micro-injection. Lors de la sélection des cellules pour le FSM, les cellules doivent être de grande taille (> 50 um de diamètre), devrait propager lorsque plaqué, et être naturellement adhérente sur des substrats (ou en plastique des boîtes de culture de tissu). Il aide également si le cytosol de la cellule occupe une superficie plus grande que son noyau. Les critères susmentionnés garantissent que les cellules se prêtent à la microinjection. Le succès des lignées cellulaires candidats comprennent (sans s'y limiter) PtK1 [2,3], les cellules pulmonaires Newt [4], et les neurones aplysie [3].
2. Les cellules doivent être plaqués sur des lamelles en verre carré (22 x 22 mm;. Aucune 1-1/2) qui ont été lavés à l'acide. Revêtement de substrat standard peuvent être appliquées à la lamelle et n'affectera pas la microinjection.
3. La sélection correcte des aiguilles de microinjection est dépendante de la taille de l'ouverture. Typiquement, la taille des trous peuvent très en taille de 0,5 um à aussi grande que 3 um. Cependant, nous recommandons que l'injection de l'actine nécessite une taille d'ouverture optimale entre 0,5 à 1 um. Si des problèmes sont rencontrés régulièrement colmatage, tailles de trou plus grand peut accueillir pour la livraison des monomères ainsi que les filaments d'actine polymérisée indésirables. Aiguilles de microinjection peuvent être achetés par plusieurs fournisseurs, y compris les systèmes qui font Eppendorf aiguilles de microinjection Femtotip. Alternativement, si un extracteur d'aiguilles commerciale est disponible, les tubes de verre peuvent microinjection achetés auprès de Sutter, et a tiré à la spécification. Pour les débutants, nous recommandons d'avoir tiré sur des aiguilles de 10 à 20 la main avant de commencer la procédure d'injection.
4. «La concentration d'injection 'Idéal (concentration finale de l'actine chargé dans votre aiguille) d'actine est entre 0,5 et 1,0 ug / ul basé sur un ratio de 40% d'étiquetage de colorant au monomère d'actine. Baisse du ratio de l'étiquetage de vos actine peut être compensé en injectant à des concentrations plus élevées (ug 1-3 / ul). Toutefois, la fréquence colmatage de votre aiguilleêtre augmenté. Ceci peut être partiellement atténué par l'utilisation d'aiguilles avec des ouvertures plus grandes. Concentration de stock de l'actine peut être dilué par addition de tampon d'injection glacée. Glacée ddH2O peut également être utilisé pour diluer pour injection rapide. A ce moment toutes les solutions de travail doivent être conservés sur la glace.
5. Charge de 0,5 à 1,0 uL de votre solution d'actine à l'aide d'une microseringue (à voie étroite - Hamilton), ou encore en utilisant une astuce microloader pipette.
6. Soigneusement passer la solution d'actine, par un léger libérant la solution. Bubbles devrait être évitée, mais peuvent être facilement enlevés en prenant l'excès de liquide entourant la bulle.
7. Assurez-vous que la solution d'actine se repose complètement à la pointe de l'aiguille. Excès de solution partout le long du capillaire de l'aiguille peut perturber le flux d'injection.
8. Maintenant, soigneusement fixer l'aiguille, en évitant tout contact avec la pointe de l'aiguille, à la porte-injecteur. Positionnez le support de sorte que l'aiguille fait un angle de 35 à 50 degrés à la base de la platine du microscope. Angles inférieurs sont préférés.
9. Abaissez la pointe de l'aiguille jusqu'à ce qu'il casse à peine la surface du média baigner vos cellules.
10. Maintenant la position de l'aiguille (sans baisser) afin qu'il repose directement au-dessus du centre de l'objectif. Si l'aiguille est alignée avec l'objectif, vous devriez voir un halo lumineux dans l'oculaire. C'est la fin de la pointe de l'aiguille. Lentement le côté aiguille à l'autre (en utilisant le manipulateur) peut aider à mieux localiser le halo.
11. Réglez le z-se concentrer sur le microscope jusqu'à ce que votre cellules sont bien en vue. Maintenant, abaissez lentement la pointe jusqu'à l'auréole resserre graduellement jusqu'à ce que finalement converger dans la pointe de l'aiguille - vous aurez besoin pour contrôler la mise au point (z-position) simultanément. Une autre caractéristique à rechercher est l'arbre de l'aiguille, qui projettent des ombres linéaires. Abaisser l'aiguille va progressivement définir la tige de l'aiguille. Une fois fait correctement la fin de l'aiguille et vos cellules devraient tous deux être bien en vue. Léger ajustement de l'anneau de phase peut être nécessaire pour améliorer le contraste.
12. Lors de la navigation, d'assurer la pointe de l'aiguille est bien au-dessus de vos cellules pour éviter la rupture de la pointe de l'aiguille.
13. Lors de la sélection des cellules à injecter des cellules avec des bords libres doit être orientée vers l'aiguille. Cela permettra d'assurer la pente décroissante de la cellule (du point le plus épais, où le noyau réside, au point le plus mince de la pointe) se réunira le bout de l'aiguille, plutôt que de courir parallèlement à elle.
14. La pression aiguille doit être fixé à 0,3 à 0,8 psi. La pression constante appliquée se traduira par un flux régulier de la solution d'actine.
15. Après avoir statué sur une cellule d'injecter, la position de l'aiguille de sorte que le pourboire est à côté de la noyau (région périnucléaire, partie la plus épaisse de la cellule où le noyau n'est pas directement ci-dessous).
16. Abaissez lentement, et réajuster la position de l'aiguille jusqu'à la pointe est déprimant la membrane, maintenant progressivement plus faible jusqu'à la pointe de l'aiguille a percé la membrane. Si l'aiguille est totalement percé la membrane, la cellule va apparaître plus claires, dès que vous voyez cette différence lever l'aiguille jusqu'à ce qu'elle ne touche plus la cellule. Le piercing réelle et le processus injection prendra 0,5 à 2 secondes.
17. Quand c'est fait correctement, la forme des cellules apparaissent inchangés, alors que les injections trop se traduira par la rétraction rapide de la bordure des cellules et dans certains cas, vous verrez réellement la cellule exploser.
18. Si vous ne voyez pas des changements dans la cellule lors de micro-injection (ne pas obtenir plus lumineux), la pointe de l'aiguille peut être fermé. Vous pouvez tester cela en appuyant sur le «propre» bouton si disponible sur votre transjector. S'il est ouvert, cela permettra d'accroître considérablement le flux de la pression constante qui peut être vu à travers les oculaires - il apparaîtra comme ondulations et les débris à proximité peut être vu se disperser.
19. Si l'aiguille est fermé, vous pouvez choisir d'insérer une aiguille de microinjection nouvelles ou tenter de briser la pointe de l'aiguille en douceur abaisser l'aiguille jusqu'à la pointe de l'aiguille contre la presse lamelle de verre, provoquant ainsi la fin de la pointe à briser. La zone de rupture ne doit pas être plus d'un ^siècle 1 / 5 de la zone de la pointe de l'aiguille (la partie de l'aiguille qui commence à converger vers un point).
20. Continuer avec l'injection, ne pas dépenser plus de 20 - 45 minutes pour chaque session de la micro-injection (dépendra du type de cellule). En règle générale, des sessions plus courtes sont recommandés pour minimiser le stress sur les cellules.
21. Après avoir terminé la micro-injection, changer le support de cellule dans le plat en ajoutant Fresh Media préchauffée. Ensuite permettre aux cellules de récupérer pendant 30 minutes dans un incubateur avant l'imagerie. Cela permettra également de l'actine à s'intégrer dans le réseau de cytosquelette existants.

Section 3: Assemblage de la Chambre d'imagerie

Matériel requis: lamelle, ruban adhésif double face, Q-tips, forceps, valap, Kim essuyer, oxyrase, l'imagerie des médias, lame de rasoir, p200 PIPette, l'éthanol pur

1. Commencez par préchauffer les médias d'imagerie et de décongélation une aliquote 15 uL de Oxyrase. Assurez-vous de protéger le oxyrase photosensibles de la lumière. L'ajout de oxyrase permettra de réduire considérablement les effets de photoblanchiment.
2. Préchauffer le valap, en définissant la température de la plaque chaude à basse. Ne pas surchauffer / brûler les valap pour elle perdra son efficacité comme un mastic.
3. Essuyer une lamelle avec un Kimwipe aspergé avec de l'éthanol pur pour nettoyer et enlever les débris de petite taille.
4. Empiler deux longueurs égales de taille (2,5 cm de long) de scotch double-face sur le dessus de l'autre, en utilisant une surface plane et propre comme une plateforme. Appuyer les bulles d'air piégées pour créer un plan complètement plat.
5. En utilisant une lame de rasoir, couper deux bandes droites long du grand axe, de sorte que chaque bande mesure 0,5 cm de largeur.
6. En utilisant des pinces, placer chaque bande contre le bord long de votre lamelle afin que les deux bandes de ruban crée un vide dans le centre de votre lamelle. Appuyez doucement sur le ruban pour faire un joint bien avec le verre. Les bandes de ruban agira comme entretoises entre la lamelle et la lamelle.
7. Assurez-vous que l'valap a complètement liquéfié avant de commencer l'étape suivante.
8. Récupérez vos médias d'imagerie préchauffée, ajouter 15 ul d'oxyrase à chaque uL 500 de médias.
9. Kimwipes Pliez en triangles de créer trois arêtes dures. Il sera utilisé pour créer une surface sèche pour le ruban à coller sur.
10. Récupérez vos cellules de l'incubateur. En utilisant une pince, saisir un coin de la lamelle. Placez rapidement la lamelle sur une Kimwipe (côté pile est orientée vers le haut, ne pas toucher le tissu), et utiliser le Kimwipe plié pour essuyer deux côtés opposés de la lamelle pour créer une surface semi-sec (sur la surface où votre repos cellules).
11. En utilisant une pince, saisir un coin de la lamelle et la placer sur votre lamelle sorte que les surfaces sèches sont alignés sur les deux bandes de ruban. Remarquez maintenant que vous avez deux côtés fermés et deux fentes ouvertes. Lentement la pipette 200 ul de solution d'imagerie-media-oxyrase près d'un ouvrant. Surtout, pas de bulles d'air doivent être introduits. La solution doit être aspiré dans la chambre nouvellement assemblés par les forces capillaires, pour immerger vos cellules en solution.
12. L'utilisation d'un Q-tip tamponner les quatre coins de votre lamelle avec valap fondre rapidement apposer et de stabiliser la lamelle. Vous remarquerez que le sèche instantanément valap (quelques secondes à la température ambiante).
13. Maintenant en commençant par les côtés ouverts (non-bandes latérales), déposent une mince bande de valap en utilisant un coton-tige et de mimer un coup de brosse. Répétez l'opération pour les côtés fermés. Lentement construire la couche de valap, renforçant ainsi le sceau en répétant les étapes de revêtement. Le valap devrait être confinées aux bords, de quitter le centre de la lamelle claire.
14. Nettoyez délicatement la partie centrale de la lamelle en utilisant un coton-tige avec ddH2O pour enlever tout résidu des médias, en étant attentif à ne pas écraser les cellules. Répétez étape de nettoyage avec de l'éthanol pur.
15. Vous aurez maintenant une chambre d'imagerie entièrement clos optimisé pour l'imagerie speckle. Ayant une enceinte totalement étanche empêchera votre fluorophores partir rapidement photoblanchiment.

Section 4: Des cellules d'imagerie

Matériel requis: microscope inversé grand champ, lampe Mecury, des filtres appropriés, caméra CCD refroidie à 6,7 microns pixels, haute ouverture numérique, l'huile d'immersion plan-apochromatique objectifs (60X à 100X, la phase ou DIC). Table de vibration. Logiciels d'imagerie.

1. Préchauffer la platine du microscope à 37 degrés. Placez votre chambre d'imagerie récemment achevé, et attendre 10-15 minutes pour que la température se stabilise avant d'imagerie.
2. Commencez par concentrer vos cellules à Bright-champ, et ensuite trouver vos cellules injectées en basculant les paramètres corrects de fluorescence. Essayez de minimiser le temps d'exposition de fluorescence pour réduire photoblanchiment.
3. Cherchez cellules injectées qui ont sains courbes bords d'attaque. Plus-injecté des cellules (cellules explosé) sera caractérisée par des bords rentrés et déchiquetés, ressemblant à de nombreux filopodes - éviter l'imagerie de ces cellules.
4. Paramètres d'acquisition dépendra du type cellulaire, la qualité de l'actine étiquetés, et les composants de microscope. Cependant, les paramètres d'exposition ne doit pas être supérieure à 2 secondes, et l'intervalle de temps entre les images doivent être mis entre 5 et 10 secondes. Longueurs typiques pour une série chronologique (imagés par cellule) peut varier entre 10 à 30 minutes, et est limité par les effets de photoblanchiment. Réglages de gain sur la caméra peut être tourné pour augmenter le rapport signal-bruit.
5. Idéal chatoiement caractéristiques devraient avoir chaque speckle espacées de ~ 2 chatoiement diamètres vers les pays voisins prochaines chatoiement. Cela justifie optimale échantillonnage spatial et temporel de la structure de l'actine. Pour les cellules épithéliales, le réseau d'actine mouchetée apparaîtra homogène, avec des mouchetures uniformément écartées. Les lignées cellulaires qui comportent des fibres de stress dense ou lamellipodes, se distinguent, mais aura un aspect pointillé / moucheté. Paramètres d'exposition devraient être ajustées pour obtenir les meilleures images mouchetées.
6. Plus-microinjectés cellules auront taches denses qui ne semblent pas être discrets. Fibres de stress et les lamellipodes perdra son apparition en pointillés.
7. Sous-microinjectés cellules apparaissent très sombres à travers l'oculaire, contenant taches qui sont éloignés (> 10 taches d'intervalle) et apparaissant aléatoirement dispersées. Fibres de stress et les lamellipodes dans ces cellules seront indiscernables.
8. La clé de l'obtention de «bons» chatoiement films est maintenant au point. Ceci est particulièrement important pour la post-analyse impliquant chatoiement des flux et des mesures de chiffre d'affaires. Ainsi, la qualité de l'analyse quantitative dépendra de blocage dans la mise au point pour la durée de la time-lapse. Cela peut être particulièrement difficile si le plan d'imagerie est assez mince. D'autres facteurs dépendent de la stabilité du système de microscope, en particulier les maisons de transition et la chambre de l'imagerie. Contraste à base de focalisation peut être utilisée que si l'intervalle des longueurs d'images sont suffisantes pour accueillir cette fonctionnalité. D'autres options incluent l'achat d'un proche infrarouge système basé concentrant qui fournit fiables ajustements se concentrer en temps réel. Vous pouvez trouver ces offres de Nikon, Olympus et ASI.

Section 5: Analyse qFSM

Cette section n'est pas discuté en détail, mais l'information sur le logiciel d'analyse peut être trouvé ici [5]. Demandes de téléchargement du logiciel peuvent être faites sur notre site (lccb.scripps.edu).

Thèmes abordés:

• Bruit de calibration
• Chatoiement de détection
• Suivi en utilisant une approche hybride de l'image de corrélation basée sur le suivi du mouvement du speckle grossière et le suivi des zones particule unique de la proposition détaillée de mouchetures individuels.
• Calcul de l'assemblage de polymères et les taux de démontage de la fluctuation d'intensité au cours de speckle l'apparence et les événements disparition.

Discussion

Plusieurs facteurs clés sont indispensables pour réussir à obtenir des images de speckle, taches aussi bonne commencent et finissent avec la qualité de votre actine marqués par fluorescence. Un ratio élevé de l'étiquetage de teinture à l'actine monomère, autour de 0,4 à 0,7 veillera à ce que taches apparaissent lumineux et discret, tandis que la protéine marquée elle-même doit être soluble et libre de granulats. Tout aussi importante est la procédure la microinjection. Pour assurer l'homéostasie cellulaire normale (et de survie), les cellules ont besoin d'être injecté avec une pression faible débit, l'introduction d'une faible concentration de protéine marquée. Cela nécessite un certain degré d'expertise technique / expérience par rapport à l'utilisation du système de micro-injection. En règle générale, les temps d'injection plus courte (<1s) est préféré au temps d'injection plus. Le dernier élément crucial est le microscope. Un microscope inversé couplé à une lampe à mercure épi-enlumineur, trouvé dans la plupart des installations de base, servira de plate-forme adéquate pour le chatoiement d'imagerie. En supposant que les filtres appropriés fluorescence sont en place, la combinaison d'un objectif de grande ouverture numérique et une caméra CCD refroidie va produire des images haute résolution de mouchetures brillantes. Nous vous recommandons d'utiliser un fort grossissement (100X), haute NA (> 1,3), Plan-Apochromat objectifs qui fournissent une résolution et une luminosité accrue. Dans des conditions idéales d'injection, le grossissement peut être abaissé à 60X, ce qui augmente la luminosité et le SNR par pixel. Faible bruit, haute efficacité quantique, caméras CCD refroidies, avec des tailles de pixel de 6,5 microns ~ sont des détecteurs idéal, et dans certains cas, ne peut compenser pour des sondes fluorescentes de mauvaise qualité. En outre, les sondes de protéines marquées par fluorescence peuvent être co-injectées avec des constructions d'ADNc (nucleoinjection) pour exprimer la GFP / RFP protéines conjuguées au sein de la même cellule. Cela nécessite la nucleoinjection d'ADNc dans les noyaux des cellules, suivie par une deuxième injection dans le cytoplasme environnant. En résumé, EFM fournit un aperçu sans précédent sur la dynamique du cytosquelette. Obtenir de bonnes taches nécessite des sondes appropriées, l'équipement et un peu de patience (formation).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C