Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

Summary

Selección, la microinyección, y las imágenes de fluorescencia marcado con F-actina a través de microscopía de fluorescencia moteado (FSM).

Abstract

En este protocolo se describe el uso de fluorescentes Speckle Microscopía (FSM) para capturar imágenes de alta resolución de la dinámica de actina en las células PtK1. Una ventaja única del FSM es su capacidad para captar el movimiento y la cinética de rotación (armado / desarmado) de la red de F-actina en las células vivas. Esta técnica es particularmente útil en la obtención de mediciones cuantitativas de la dinámica de actina F-cuando se combina con el software de visión por computador (qFSM). Se describe la selección, la microinyección y la visualización de las sondas fluorescentes de actina en las células vivas. Es importante destacar que procedimientos similares se aplican a la visualización de las otras asambleas macomolecular. FSM ha sido demostrada para los microtúbulos, filamentos intermedios y los complejos de adhesión.

Protocol

Sección 1: La obtención de la etiqueta fluorescente para actina FSM

Materiales necesarios: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga

1. Un componente clave para la adquisición de buenas películas FSM exige el correcto etiquetado de actina (u otras proteínas del citoesqueleto), con el fluoróforo de su elección.
   Se recomienda el uso de fluoróforos Alexa (488, 568 longitudes de onda) y X-rodamina derivados de éster de succinimidilo que se dirigen a los residuos de lisina expuestos en la superficie de la actina.
2. Al elegir su fluoróforo y su longitud de onda apropiada, asegúrese de que la configuración de su microscopio tiene los filtros adecuados (excitación y de emisión) e iluminadores (arco de mercurio de la lámpara y / o láser) para dar cabida a la etiqueta fluorescente. Se recomienda seleccionar las longitudes de onda de la naranja para longitudes de onda roja (560-630 nm) para minimizar los efectos de la auto-fluorescencia y foto-daño y para garantizar su compatibilidad con las buenas prácticas agrarias-conjugados.
3. Actina pura se puede extraer de los tejidos musculares que pertenecen a la rata o el pollo, pero requiere de un procedimiento de extracción de polvo larga del músculo acetona. Polvo de acetona muscular puede ser adquirido de Invitrogen. El procedimiento de etiquetado no se discute en este protocolo, pero se puede encontrar aquí [1]
4. Alternativamente, usted puede comprar etiquetados proteínas actina del citoesqueleto incluyendo varios proveedores Inc., e Invitrogen. Los servicios personalizados de etiquetado también están disponibles a través de Invitrogen. Purificada, no etiquetados actina (actina músculo y no musculares) se pueden adquirir en Citoesqueleto Inc.
5. Ya sea que decida comprar o preparar su propia etiqueta de actina, que quieren asegurarse de que la relación entre el etiquetado es de alrededor de 0,3 a 0,7 colorantes por monómero de actina. Demasiado alto ratio de etiquetado puede afectar la cinética de rotación (y la unión a proteínas asociadas) de los filamentos de actina, mientras que una proporción muy baja de etiquetado dará lugar a los pobres que buscan manchas (baja señal a ruido) y puede causar problemas de microinyección (ver más abajo). Este es un factor crítico para conseguir un buen speckle imágenes.
6. Antes de su almacenamiento a largo plazo, la solución de actina etiqueta debe ser aclarada por girar a 75.000 - 80.000 g durante 20 minutos a 4 grados centígrados. Actina etiquetados deben ser almacenados en una solución de G-buffer y se mantiene -80 grados Celsius. Preparar alícuotas de 2 uL es muy recomendable para reducir los efectos perjudiciales de los ciclos de congelación-descongelación (conduce a agregados insolubles). Abstenerse de exponer la solución de actina etiquetados a la luz directa (se photobleaching de fluoróforos). Recomendamos el uso de tubos de microcentrífuga opaco para el almacenamiento a largo plazo.

Sección 2: Preparación de las células y la microinyección de actina etiquetados

Materiales necesarios: agujas de microinyección, microjeringa, microloaders, los medios de comunicación precalentado celular, buffer de inyección, un cubo de hielo, un microscopio (anillo de fase, el objetivo de contraste de fase 40x, transjector, extractor de aguja, micromanipulador)

1. Muchos tipos de células son susceptibles de FSM, pero conseguir un buen speckle imágenes está directamente relacionada con el éxito del procedimiento de microinyección. Al seleccionar las células de Estados Federados de Micronesia, las células deben ser grandes (> 50 um de diámetro), se extendió cuando se siembran y se adhiere a sustratos naturales (de plástico o cajas de cultivo de tejidos). También ayuda si el citosol de la célula ocupa un área mayor que su núcleo. Los criterios antes mencionados asegurar que las células son susceptibles a la microinyección. El éxito de las líneas celulares candidatos incluyen (pero no limitados a) PtK1 [2,3], las células tritón de pulmón [4], y las neuronas Aplysia [3].
2. Las células deben ser chapada en cubreobjetos de vidrio cuadrados (22 x 22 mm;. No 1-1/2) que han sido lavados con ácido. Recubrimiento del sustrato norma se puede aplicar a la cubreobjetos y no afectará a la microinyección.
3. La correcta selección de las agujas de microinyección depende del tamaño de la abertura de la punta. Por lo general, los tamaños de agujero puede muy en tamaño de 0,5 um a tan grande como 3 um. Sin embargo, se recomienda que la inyección de actina requiere un tamaño de abertura óptimo entre 0,5 y 1 um. Si los problemas de obstrucción se encuentran constantemente, mayor tamaño de los agujeros con capacidad para el suministro de monómero no deseados, así como los filamentos de actina polimerizada. Agujas de microinyección se pueden comprar a través de varios proveedores, incluidos los sistemas Eppendorf que hacen que las agujas Femtotip microinyección. Alternativamente, si un extractor de aguja comercial está disponible, los tubos de cristal de microinyección se puede comprar a partir de Sutter, y sacó a la especificación. Para los principiantes, se recomienda tener 10 a 20 agujas se puso la mano antes de iniciar el procedimiento de inyección.
4. 'Concentración de inyección' Ideal (concentración final de actina cargado en la aguja) de la actina es de entre 0,5 a 1,0 ug / ul sobre la base de una relación de etiquetado del 40% de medio de contraste para monómeros de actina. Menor proporción de etiquetado de la actina puede ser compensada mediante la inyección en concentraciones más altas (3.1 ug / ul). Sin embargo, la frecuencia de la obstrucción de la agujaser mayor. Esto puede reducirse en parte mediante el uso de agujas con grandes aberturas. Concentración de la actina puede ser diluido mediante la adición de tampón helado de la inyección. Helada ddH2O también puede ser utilizado para diluir para inyección rápida. En este punto, todas las soluciones de trabajo deben mantenerse en hielo.
5. De carga desde 0,5 hasta 1,0 l de la solución de actina con una microjeringa (de vía estrecha - Hamilton), o, alternativamente, mediante el uso de una punta de pipeta microloader.
6. Cuidadosamente dispensar la solución de actina, con cuidado la liberación de la solución. Las burbujas se debe evitar, pero se puede quitar fácilmente por ocupar el exceso de líquido que rodea la burbuja.
7. Asegúrese de que la solución de actina se apoya completamente en la punta de la aguja. El exceso de solución en cualquier lugar a lo largo de los capilares de la aguja puede interrumpir el flujo de inyección.
8. Ahora, con cuidado ponga la aguja, evitando el contacto con la punta de la aguja, al titular de la inyección. Coloque el soporte de forma que la aguja que hace un ángulo de 35 a 50 a la base de la platina del microscopio. Ángulos más bajos son los preferidos.
9. Baje la punta de la aguja hasta que apenas rompe la superficie de los medios de comunicación de baño de las células.
10. Ahora la posición de la punta de la aguja (sin bajar) para que se apoye directamente sobre el centro del objetivo. Si la punta de la aguja se alinea con el objetivo, debería ver un halo brillante a través del ocular. Este es el final de la punta de la aguja. Que se mueve lentamente al lado a lado la aguja (usando el manipulador) puede ayudar a localizar mejor el halo.
11. Ajuste el z-se centran en el microscopio hasta que sus células están a la vista. Ahora, baje lentamente la punta hasta que el halo se contrae gradualmente hasta que finalmente convergen en la punta de la aguja - se necesita para controlar el foco (z-posición) al mismo tiempo. Una característica adicional que buscar es el eje de la aguja, que proyectará sombras lineales. La reducción de la aguja poco a poco definir el eje de la aguja. Cuando se hace correctamente el extremo de la aguja y las células deben ser ambos a la vista. Ligero ajuste del anillo de fase puede ser necesaria para mejorar el contraste.
12. Al navegar, asegurar la punta de la aguja es muy superior a las células para evitar que se rompa la punta de la aguja.
13. Al seleccionar las células que se inyectan, las células con bordes libres debe estar mirando hacia la punta de la aguja. Esto asegurará que la disminución de la pendiente de la célula (del punto más grueso, donde reside el núcleo, la parte más delgada del borde de ataque) se reunirá con la punta de la aguja, en lugar de correr paralela a ella.
14. La presión de la aguja debe ser fijado en 0,3 a 0,8 psi. La constante presión aplicada se traducirá en un flujo constante de la solución de actina.
15. Después de decidir sobre una célula de inyectar, la posición de la aguja de modo que la punta está al lado del núcleo (región perinuclear, la parte más gruesa de la célula donde el núcleo no se encuentra justo debajo).
16. Baje lentamente, y reajustar la posición de la aguja hasta que la punta es deprimente de la membrana, ahora progresivamente menor hasta que la punta de la aguja ha perforado la membrana. Si la aguja ha traspasado completamente la membrana, la célula será más brillante, tan pronto como usted ve esta diferencia levantar la aguja hasta que ya no es tocar la célula. La perforación actual y el proceso de inyección se llevará 0,5 a 2 segundos.
17. Cuando se hace correctamente, la forma de la célula aparece sin cambios, mientras que la inyección demasiado dará lugar a la retracción rápida del borde de la celda y en algunos casos, usted verá realmente la célula explotar.
18. Si usted no ve cambios en la célula cuando la microinyección (no más brillante), la punta de la aguja puede ser cerrado. Usted puede probar esto presionando la "limpia" botón si está disponible en transjector. Si está abierto, esto aumentará significativamente el flujo de la presión constante que se puede ver a través de los oculares - que aparecerá como olas y los escombros cerca se puede ver la dispersión.
19. Si la punta de la aguja está cerrada, puede optar por insertar una aguja de microinyección nuevo o intentar romper la punta de la aguja con cuidado bajar la aguja hasta la punta de la aguja presiona contra el portaobjetos de vidrio, lo que provoca el final de la punta de romper. La zona de rotura no debe ser más que un ^ª 1 / 5 de la zona de la punta de la aguja (la parte de la aguja que comienza a converger a un punto).
20. Continuar con la inyección, el gasto de no más de 20 - 45 minutos para cada sesión de microinyección (dependerá del tipo de célula). Como regla general, se recomiendan sesiones más cortas para minimizar el estrés en las células.
21. Después de terminar la microinyección, cambiar los medios de comunicación celular en el plato mediante la adición de nuevos medios de comunicación precalentado. A continuación, permiten a las células para recuperarse durante 30 minutos en una incubadora antes de exponer. Esto también permitirá a los filamentos de actina a integrarse en la red del citoesqueleto existentes.

Sección 3: Montaje de la Cámara de imágenes

Materiales necesarios: Cinta de cubre objetos, de doble cara, q-tips, pinzas, valap, kim limpiar, oxyrase, los medios de comunicación de imagen, hoja de afeitar, p200 piPette, etanol puro

1. Empiece por precalentar los medios de comunicación de imagen y descongelar una alícuota de 15 uL de Oxyrase. Asegúrese de proteger la oxyrase fotosensibles de la luz. La adición de oxyrase reducirá en gran medida los efectos de photobleaching.
2. Precalentar el valap, mediante el establecimiento de la temperatura de la placa caliente a baja. No sobrecalentar / quemar la valap de que perderá su eficacia como un sellador.
3. Limpie un cubreobjetos con un Kimwipe rociado con etanol puro para limpiar y eliminar los desechos pequeños.
4. Pila de dos longitudes de igual tamaño (2,5 cm de largo) de cinta de doble cara en la parte superior de cada uno, con una superficie plana y limpia como una plataforma. Pulse cualquier burbuja de aire atrapada para crear un plano completamente plana.
5. Usando una hoja de afeitar, cortar dos tiras de recta a lo largo del eje longitudinal, de manera que cada tira mide 0,5 cm de ancho.
6. Con unas pinzas, coloque cada tira contra el borde largo de su cubreobjetos de modo que las dos tiras de cinta crea un vacío en el centro de su cubre objetos. Presione suavemente en la cinta para sellar bien con el vidrio. Las tiras de cinta actúan como espaciadores entre el cubre objetos y cubreobjetos los.
7. Asegúrese de que el valap esté completamente licuado antes de comenzar el siguiente paso.
8. Recuperar sus medios de comunicación imágenes de precalentado, añadiendo 15 ul de oxyrase de cada 500 uL de los medios de comunicación.
9. Kimwipes veces en forma de triángulos para crear tres bordes duros. Esto será utilizado para crear una superficie seca de la cinta para pegar en.
10. Recuperar las células de la incubadora. Con unas pinzas, agarre una esquina del cubreobjetos. Rápidamente coloque el cubreobjetos en una Kimwipe (lado célula es hacia arriba, sin tocar el tejido), y el uso de la Kimwipe doblado para limpiar dos lados opuestos del cubreobjetos para crear una superficie semi-seca (en la superficie, donde su descanso las células).
11. Con unas pinzas, agarre una esquina del cubreobjetos y se coloca sobre el cubreobjetos de modo que las superficies secas están alineados con las dos tiras de cinta. Observe que ahora tiene dos lados cerrados y dos ranuras abiertas. Poco a poco pipeta 200 uL de la solución de imagen, los medios de comunicación oxyrase cerca de una abertura. Es importante destacar que no queden burbujas de aire debe ser introducido. La solución debe ser aspirado en la cámara de nuevo reunidos por las fuerzas de capilaridad, sumergiendo sus células en una solución.
12. Usando un toque Q-tip las cuatro esquinas de su cubreobjetos con valap fundido para fijar y estabilizar rápidamente el portaobjetos. Se dará cuenta de que se seque el valap instante (en cuestión de segundos a temperatura ambiente).
13. Ahora comienzo con los lados abiertos (sin cinta lateral), había una delgada franja de valap usando un Q-tip y simula un accidente cerebrovascular el cepillado. Repita para el lado cerrado. Poco a poco construir el escudo de valap, reforzando así el sello mediante la repetición de las etapas de recubrimiento. El valap debe limitarse a los bordes, dejando el centro del cubreobjetos claro.
14. Limpie suavemente la parte central del cubreobjetos con un Q-tip con ddH2O de extraer cualquier soporte residual, siendo consciente de no aplastar las células. Repita el paso de limpieza con etanol puro.
15. Ahora tendrá una cámara de imágenes completamente cerrado optimizado para speckle imágenes. Tener una caja completamente sellada para evitar que su fluoróforos de forma rápida photobleaching.

Sección 4: las células de imagen

Materiales necesarios: microscopio invertido de campo amplio, lámpara mecury, los filtros adecuados, enfriado cámara CCD con 6,7 micron píxeles, apertura numérica, de inmersión en aceite los objetivos del plan-Apocromático (60X a 100X, fase o CID). Vibraciones mesa. Software de imágenes.

1. Precaliente la platina del microscopio a 37 grados. Coloque la cámara de imágenes recién terminado, y esperar 10-15 minutos para que la temperatura se estabilice antes de exponer.
2. Empezar por centrarse en las células de campo brillante, y luego encontrar las células inyectadas por alternar la configuración correcta de fluorescencia. Trate de minimizar el tiempo de exposición de fluorescencia para reducir photobleaching.
3. Verificar si hay células que se han inyectado saludable bordes de ataque curvado. Más de inyección de las células (despiece) se caracteriza por los bordes dentados y se retractó, asemejándose a numerosos filopodios - evitar la imagen de estas células.
4. Ajustes de adquisición dependerá del tipo de célula, la calidad de la actina etiquetados, y los componentes del microscopio. Sin embargo, los ajustes de exposición no debe ser mayor de 2 segundos, y el intervalo de tiempo entre los fotogramas se debe establecer entre 5 y 10 segundos. Tiempo típico de una serie de tiempo (por celda imágenes) puede variar entre 10 a 30 minutos, y está limitado por los efectos de photobleaching. Ajustes de ganancia de la cámara se puede girar hacia arriba para aumentar la relación señal-ruido.
5. Ideal speckle características debe tener cada uno de manchas separadas por ~ 2 speckle diámetros para los próximos vecinos de manchas. Esto garantiza óptima de muestreo espacial y temporal de la estructura de la actina. Para las células epiteliales, la red de actina moteada aparece homogéneo, con puntos uniformemente separados. Las líneas celulares que contienen fibras de densidad estrés o lamellipodiase distinguen, sino que tendrá un aspecto de puntos / moteado. Ajustes de la exposición se debe ajustar para obtener las mejores imágenes moteado.
6. El exceso de microinyección de células tendrán manchas densas que no parecen ser discretos. Fibras de estrés y lamellipodia la perderá su aspecto de puntos.
7. Menores de microinyección de células aparecerá muy oscura a través del ocular, que contiene manchas que están muy alejados (> 10 motas de separación) y que aparecen dispersos al azar. Fibras de estrés y lamellipodia en estas células se distinguen.
8. Clave para obtener "buenas" películas speckle es mantener la atención. Esto es particularmente importante para los análisis posteriores de la participación de manchas de flujo y las mediciones de volumen de negocio. Por lo tanto la calidad del análisis cuantitativo dependerá de bloqueo en el centro de la duración del lapso de tiempo. Esto puede ser especialmente difícil si el plano de la imagen es muy delgada. Otros factores que dependen de la estabilidad del sistema de microscopio, en particular la vivienda escenario y la cámara de imágenes. Basado en el contraste de enfoque se puede utilizar si las longitudes de la imagen de intervalo son suficientes para dar cabida a esta función. Otras opciones incluyen la compra de un infrarrojo cercano sistema basado enfoque que proporciona fiable en tiempo real los ajustes de enfoque. Usted puede encontrar estas ofertas de Nikon, Olympus y ASI.

Sección 5: Análisis qFSM

Esta sección no se discute en detalle, pero la información sobre el software de análisis se puede encontrar aquí [5]. Peticiones de descarga de software se pueden realizar en nuestro sitio web (lccb.scripps.edu).

Temas tratados:

• El ruido de calibración
• Moteado de detección
• El seguimiento mediante una aproximación mixta de la imagen basada en la correlación de seguimiento del movimiento grueso de las áreas de manchas y el seguimiento de una sola partícula del movimiento detallado de manchas individuales.
• Cálculo de la asamblea de polímero y las tasas de desmontaje de las fluctuaciones de intensidad durante la aparición de manchas y eventos desaparición.

Discussion

Varios factores clave son cruciales para el éxito de la obtención de imágenes de manchas, manchas por bueno comenzar y terminar con la calidad de la actina marcados con fluorescencia. Una proporción alta de etiquetado de tinte a la actina monómero, en torno a 0,4 a 0,7 se asegurará de que van a aparecer manchas brillantes y discreto, mientras que la proteína marcada en sí debe ser soluble y libre de los agregados. Igualmente importante es el procedimiento de microinyección. Para asegurar la homeostasis celular normal (y supervivencia), las células necesitan para ser inyectado con una presión de bajo caudal, la introducción de una baja concentración de proteína marcada. Esto requiere un cierto grado de conocimientos técnicos / experiencia con respecto a la utilización del sistema de microinyección. Como regla general, menores tiempos de inyección (<1 s) se prefieren los tiempos de inyección más. El último componente crucial es el microscopio. Un microscopio invertido junto con un lámpara de mercurio-epi-iluminación, que se encuentra en la mayoría de las instalaciones básicas, servirá como una plataforma adecuada para imágenes de manchas. Suponiendo que los filtros de fluorescencia están en su lugar, la combinación de un alto objetivo NA y una cámara CCD enfriado se produce imágenes de alta resolución de motas brillantes. Recomendamos el uso de gran aumento (100X), de alto NA (> 1,3), los objetivos del plan apocromático, que proporcionan una resolución superior y brillo. En condiciones ideales de la inyección, la ampliación se puede bajar a 60X, lo que aumenta el brillo y el SNR por píxel. De bajo ruido, alta eficiencia cuántica cámaras CCD enfriado, con un tamaño de pixel de ~ 6.5 micras son los detectores de ideal, y en algunos casos puede compensar las sondas fluorescentes de calidad pobre. Además, la etiqueta fluorescente sondas de proteína puede ser co-inyectados con las construcciones de cDNA (nucleoinjection) para expresar GFP / RFP proteínas conjugadas en la misma celda. Esto requiere la nucleoinjection de ADNc en el núcleo de las células, seguida por una segunda inyección en el citoplasma circundante. En resumen, los Estados Federados de Micronesia proporciona una visión sin precedentes de la dinámica del citoesqueleto. La obtención de manchas bien requiere de las sondas adecuadas, equipo y un poco de paciencia (de entrenamiento).

Materials

Injection buffer (IB) 50 mM potassium glutamate 0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A) Store up to 2 years at −20° C G-buffer 2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A) 0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A) Add just before use: 0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM) 0.5 mM 2-mercapt–thanol Store up to 1 day at 4° C