Summary
هنا نقدم اثنين من التقنيات لمعالجة الجينات في خلايا الفئران العقدة الشبكية (RGCs) من قبل
Abstract
شبكية العين والخلايا العصبية انتاجها الوحيد الخلية العقدة الشبكية (RGC) ، يشكلون نموذجا ممتازا فيها لدراسة المسائل البيولوجية مثل تمايز الخلايا والتوجيه محور عصبي ، وتنظيم شبكي التوضع وتشكيل المشبك [1]. عيب واحد هو عدم القدرة على التعامل بكفاءة وموثوقية في التعبير الجيني RGCs في الجسم الحي ، وخصوصا في المسارات البصرية في المتناول الفئران. ويمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لمعالجة الجينات ، ولكن هذا النهج كثيرا ما تكون مكلفة ومستهلكة للوقت ، ويمكن ان تنتج الآثار الجانبية غير المرغوب فيها. في الفرخ ، في electroporation البيضة يستخدم للتلاعب في التعبير الجيني لفحص شبكية العين RGCs والتنمية RGC. على الرغم من تطوير تقنيات مماثلة في electroporation الجراء الماوس الولدان [2] ، الفئران الكبار [3] ، وشبكية الفئران الجنينية في المختبر [4] ، فإن أيا من هذه الاستراتيجيات تسمح التوصيف الكامل للتنمية RGC والإسقاطات محوار في الجسم الحي. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير طلبين من electroporation ، واحدة في الرحم وغيرها من فيفو السابقين ، خصيصا لاستهداف RGCs الفئران الجنينية [5 ، 6].
في الرحم مع electroporation الشبكية ، يمكننا misexpress downregulate أو جينات معينة في RGCs التوقعات ومتابعة محور عصبي من خلال المسارات البصرية في الجسم الحي ، مما يتيح فحص قرارات التوجيه على أهداف وسيطة ، مثل chiasm البصرية ، أو في المناطق المستهدفة ، مثل الركبي الوحشي النواة. الاقلاق التعبير الجيني في مجموعة فرعية من RGCs في خلفية خلاف البرية من نوع يسهل فهم وظائف الجينات طوال الطريق في شبكية العين. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير تقنية لتحليل مصاحب RGC النمو محوار في المختبر. نحن electroporate الجنينية فيفو السابقين رؤساء وجمع واحتضان شبكية العين كله ، ثم يعد explants من هذه الأيام عدة الشبكية في وقت لاحق. ويمكن استخدام explants الشبكية في مجموعة متنوعة من فحوصات في المختبر لدراسة استجابة المحاوير RGC electroporated إلى العظة توجيه أو غيرها من العوامل. باختصار ، هذه المجموعة من تقنيات يعزز قدرتنا على misexpress downregulate أو الجينات في RGCs المساعدات بشكل كبير ، وينبغي النظر في وضع الدراسات والتوقعات RGC محور عصبي.
Protocol
الجزء 1 : إعداد لداخل الرحم وخارج الجسم الحي electroporations الشبكية
1. على حد سواء في الرحم وخارج الجسم الحي electroporations الشبكية
- استخدام مجتذب الكهربائي لإعداد غرامة ذات الرؤوس micropipettes وكسر الطرف (أو شطبة غيض) لجعل نقطة الزاوية.
- إعداد الحلول لتركيزات الحمض النووي المطلوب وإضافة كمية صغيرة من الصبغ الأخضر السريع (0.05 ٪) لتصور عن طريق الحقن. أوصي 5 ميكرولتر حل الحمض النووي لكل أم في لelectroporations الرحم الشبكية و 1 ميكرولتر حل الحمض النووي للفرد الجنينية لelectroporations فيفو السابقين في شبكية العين. تشمل بناء GFP التعبير (أو بروتين فلوري أخرى) لتصور transfected الخلايا العصبية.
- تعقيم الأدوات الجراحية عبر الأوتوكلاف.
- تحضير مزيج مخدر الكيتامين - زيلازين مع النسبة التالية (صنع ~ 0.2 مل لكل امرأة حامل) : نسبة حجمية 1.0:0.2:4.6 من 100 ميكروغرام / مل الكيتامين : 100 ميكروغرام / مل زيلازين : المالحة. ويمكن استخدام المسكنات الأخرى.
2. في الرحم لelectroporations الشبكية فقط
- بدوره على وسادة التدفئة وذلك مع غطاء وسادة الحفاض.
- يعد حل للمضادات الحيوية مضاد فطري (1:100) في الفوسفات عازلة المالحة (PBS) والحارة على وسادة التدفئة. إعداد ~ 2 مل لكل السد.
- مكان معقم ، تمت تصفيتها في برنامج تلفزيوني في حمام ماء دافئ.
3. لelectroporations فيفو السابقين الشبكية فقط
- إعداد الاوكسيجين المتوسطة مجانا المصل (SFM) لحضانة الشبكية : فقاعة 25 مل من DMEM/F12 مع الأكسجين 95 ٪ / 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لساعات ≥ 2. في المتوسط 25 مل الاوكسيجين ، إضافة 0،25 ز ألبومين المصل البقري (BSA) ، و 250 ميكرولتر ملحقها و 50 ميكرولتر حل البنسلين ، الستربتوميسين. مزيج الحل بحل جيش صرب البوسنة ، ثم تصفية العقيمة الحل. وينبغي بذل هذا الحل لكل تجربة جديدة electroporation.
- إعداد SFM المتوسطة methylcellulose + 0.4 ٪ عن حضانة يزدرع الشبكية : الأوتوكلاف 0.20 غرام من methylcellulose في زجاجة 150 مل مع تحريك المغناطيس. تحضير 50 مل من SFM (كما ذكر أعلاه ، دون فقاعات) وإضافة إلى زجاجة methylcellulose تعقيمها. مزيج هذا الحل عند 4 درجات مئوية خلال الليل. تصفية العقيمة هذا الحل في اليوم التالي وتخزينها في 4 درجات مئوية ، ويمكن إبقاء هذا الحل لمدة شهر 1 ~.
- يوم الحصاد يزدرع الشبكية (الجزء 5) ، وإعداد أطباق لطلاء يزدرع الشبكية : مع 250 ميكرولتر من بولي - L - الأورنيثين معطف الأطباق ثقافة أسفل الزجاج لعدة ساعات في 2 ≥ 37 درجة مئوية. (بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مغلفة مع أطباق بولي - L - الأورنيثين في اليوم السابق وبين عشية وضحاها المحتضنة في درجة مئوية 4) اغسل الأطباق عدة مرات مع برنامج تلفزيوني ، ثم معطف الأطباق مع 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل في laminin DMEM/F12 ل≥ 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. غسل الأطباق عدة مرات مع برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية ، وترك في برنامج تلفزيوني explants حتى تكون جاهزة للطلاء.
- لفحوصات الحدود ، والأطباق مع معطف الأورنيثين بولي على النحو الوارد أعلاه ، ثم نصف معطف من البروتين مع طبق من الاهتمام مع علامة فلوري لتصور الحدود (مثل اليكسا فلور 555 مترافق لجيش صرب البوسنة ، 1:800) لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية. يغسل مع برنامج تلفزيوني ، ثم إضافة laminin كما هو موضح أعلاه.
2A الجزء : في الرحم electroporation الشبكية وحقن الحمض النووي في electroporating E14.5 شبكية الفئران في الجسم الحي
- ضخ 0.15 مل من مزيج مخدر داخل الصفاق (IP) إلى سد E13.5 - E14.5 المرحلة. وينبغي أن يستغرق 3-7 دقائق حتى وصلت الأم طائرة الجراحية للتخدير. وينبغي أن يكون كاملا تخدير الماوس لا يستجيب للhindpaw معسر.
- خلال هذا الوقت ، وقطع قطعة صغيرة من parafilm والماصة ~ 5 من المجاهدين على الحمض النووي في حل parafilm. ينحني المكبس (سلك معدني) بزاوية 90 درجة درجة وأدخلها في micropippette انسحبت. باستخدام الغواص ، نضح الحل الحمض النووي في micropipette (باستخدام مجهر تشريح يمكن أن تساعد هذه العملية).
- الأم مرة واحدة وصلت طائرة من التخدير الجراحي ، استخدام الحلاقة الكهربائية لحلاقة ~ 2 بوصة من منطقة البطن والأم ، ثم ضع جانبها الظهرية لأسفل على وسادة التدفئة. الإعدادية تليها منطقة حلق بواسطة المسح مع الكحول وسادة على وسادة اليود الحد الأدنى من مرتين. وضع قطرة للعين مرهم البيطرية على كل عين لمنع تقرح القرنية في العين في حين أن الأم هي تحت التخدير العام.
- مع ملقط ، فهم على الجلد واستخدام المقص لإجراء شق عمودي على طول خط الوسط (~ 1 بوصة طويلة) من خلال الجلد والعضلات من البطن ، مما يعرض في الغشاء البريتوني. رفع الصفاق مع ملقط وجعل شق عمودي مماثلة خلال هذا الغشاء لفضح تجويف البطن (الشكل 1). ثم ثنى الجراحي الميداني مع قطع من الشاش لمنع محتويات البطن من الاتصال وتلوثها من الشعرمن الحيوان.
- سحب الجلد أو الغشاء البريتوني مع ملقط واستخدام ملعقة لاستخراج تشريح الجنين من خلال شق (اختيار الأجنة في متناول معظم). مكان ما بين 2 ملعقة الأجنة وبرفق سلسلة الجنينية من تجويف البطن. يمكنك سحب سلسلة الجنينية بأصابعك.
* من هذه النقطة إلى الأمام ، والحفاظ على الأجنة رطب مع برنامج تلفزيوني العقيمة * - إبقاء الأم على لوحة التدفئة ، مكانها تحت المجهر والتدليك تشريح الجنين بحيث الشبكية يكون مواجها لها. أوصي بدءا الجنين إما أكثر أو الإنسي الوحشي ، مما يجعل من الاسهل لتعقب التي كانت electroporated الأجنة.
- اتخاذ micropipette في يدك المهيمنة وتحقيق الاستقرار في جنين مع يدك الأخرى. مع micropipette ، يخترق الشبكية من خلال جدار الرحم والكيس الأمنيوسي. اعتمادا على حدة من micropipette ، قد يستغرق قدرا كبيرا من الضغط على اختراق جدار الرحم ، ولكن من خلال مرة واحدة ، سوف يدخل micropipette الجنين والشبكية مثالي. يمكن أن يكون من الصعب السيطرة عليها وقياس عمق micropipette كما يدخل الجنين. تقليل كمية الحركة micropipette بمجرد اخترقت الغشاء لمنع توسيع فتحة المدخل ، مما أدى إلى تسرب السائل الذي يحيط بالجنين وفاة الجنين. تجنب الأوعية الدموية ثقب في جدار الرحم ، وهذا سوف يؤدي إلى النزيف وفاة الجنين.
- مرة كنت على ثقة من أن micropipette دخلت شبكية العين ، وكنت على استعداد لطرد حل الحمض النووي في شبكية العين. خفض ببطء وسحب الغواص في وقت واحد micropipette ، وضمان أن يتم حقن الحمض النووي في جميع أنحاء مسار micropipette ، حيث غالبا ما تخترق micropipette العميق لشبكية العين. إذا كنت في شبكية العين ، وطرد 0.5 ميكرولتر (يمكن قياسها من خلال وضع علامة علامات 1 ميكرولتر على micropipette) في الفضاء extraretinal بين طبقة الشبكية الخارجي والظهارة الصبغية الشبكية (RPE). يجب الانتباه صبغة خضراء ملء شبكية العين وتتسرب الى السائل الذي يحيط بالجنين (الشكل 1).
- ينبغي أن تظل المجاذيف electroporation في طبق بتري PBS مليئة أثناء الجراحة. المكان برفق المجاذيف على جانبي الرأس الجنين مع مجداف (+) إيجابي على نفس جانب حقن العين. تطبيق كمية معتدلة من الضغط لتحقيق الاستقرار في رأسه ، ولكن لا تضغط من الصعب جدا ، لأن هذا سوف البوب الكيس الأمنيوسي ويسفر عن وفاة الجنين. عندما الأقطاب في مكانها ، وتقديم 5 40 - V ، و 50 مللي البقول مربع على تردد 60 هرتز. ليس من غير المعتاد للأم أن نشل بسبب الهروب الحالي على الجلد والعضلات.
- كرر الخطوات 7-9 لكل جنين ليتم حقنه وelectroporated. أنا electroporate 4-8 أجنة لكل أم ، اعتمادا على كمية من الحمض النووي ، وعدد الأجنة ، حالة من الأم ، وكمية من الوقت تحت تأثير مخدر. بدلا من ذلك ، يمكن حقن أجنة متعددة وelectroporated ثم ، بدلا من الحقن وelectroporating كل جنين منفصل.
- بعد electroporating الأجنة ، استخدم ملقط وملعقة ليحل محل سلسلة الجنينية العودة الى تجويف البطن. ~ صب 2 مل من محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية في تجويف البطن.
- استخدام ملقط مرقئ ولخياطة البريتوني ، بدءا من عقدة مزدوجة على الجزء الأمامي من شق والمضي قدما مع وجود نمط مستمر خياطة بسيطة إلى الجزء الخلفي من شق. استخدام الحلقة الاخيرة لادراك التعادل والخروج من خياطة الدرز الزائدة تقليم.
- التيلة إلى شق مغلقة ، ورفع الجلد في الجزء الأمامي من شق بالملقط حادة ، والحرص على فصل الجلد من البريتوني. مكان للأسنان من مختلف أنحاء دباسة الجلد وكساد دباسة. يواصل شق تدبيس مغلقة حتى نهاية الخلفي ، الأمر الذي يتطلب عادة الدبابيس 5-7. يمسح الجرح حول المواد الغذائية مع منصة الكحول.
- السماح للأم استرداد على لوحة التدفئة (عادة ما يستغرق ما بين 15-90 دقيقة لها أن توقظ) وعندما يبدأ ليتدحرج ، مكانها في جانب القفص الجديد يصل البطن.
- للحد من الألم والانزعاج ، والأمهات تلقي البوبرينورفين (0،05-،1 ملغم / كغم ، SC) عند الاستيقاظ ، وفي وقت لاحق من النقاط الزمنية إذا الانزعاج لا يزال مستمرا. لمنع الجفاف ، وضخ الأم مع 1.0 مل من المياه المالحة تحت الجلد (SC) ~ 2-4 ساعات ما بعد الجراحة ، ومرة أخرى إذا مساء اليوم التالي ، وإذا لزم الأمر. 24 ساعة بعد الجراحة ، ويجب أن تستعيد الأم السلوك العادي ويكون الأكل والشرب بانتظام.
2B الجزء : في استرجاع الرحم electroporation الشبكية للشبكية في electroporated E18.5
- إعداد بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني ، مما يجعل من ~ 5 مل في الجنين. ويمكن القيام Perfusions مع نظام ضخ الجاذبية أو المستندة إلى مضخة الحقنة. (بدلا من ذلك ، يمكن ببساطة E18.5 رؤساء تكون مغمورة في PFA 4 ٪ بين عشية وضحاها).
- حقن الأم معمزيج 0.2 مل من مخدر الملكية الفكرية وضمان أنها تماما تحت تأثير مخدر. استخدام المقص لقطع الجلد أو الغشاء البريتوني تحت المواد الغذائية للكشف عن تجويف البطن والرحم قرون.
- إزالة الجنين electroporated ويعلقون عليه الجانب البطني تصل. قطع طريق أجزاء الجلد ، والصفاق ، والحجاب الحاجز والبطن الجانبي من القفص الصدري لكشف القلب. تخترق البطين الأيسر مع إبرة فراشة تعلق على الإعداد التروية ، وقطع الأذين الأيمن مع microscissors. بدء نضح والسماح لتدفق PFA عن 60 ثانية ~ ؛ الدم وينبغي الخروج من الأذين الأيمن والجنين ينبغي أن تصبح باهتة إذا نضح الناجحة. قطع رأس الجنين ورأسه في جمع PFA 4 ٪ في 15 مل فيال المخروطية. كرر هذا الإجراء لجميع الأجنة electroporated. في الحفاظ على رؤساء PFA 4 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ، ثم يغسل في برنامج تلفزيوني لعدة أيام. أم الموت ببطء عبر خلع عنق الرحم عند جمع كل الأجنة.
إزالة الشبكية
- يغسل بعد برنامج تلفزيوني ، على رأس دبوس في طبق تشريح شبكية العين مع مواجهة وتزج في برنامج تلفزيوني. إزالة الجلد من جميع أنحاء شبكية العين للكشف عن RPE. باستخدام إبرة 26G1 / 2 ، ثقب في شبكية العين عند مفترق بطني عدسة RPE. إدراج أحد حافة microscissors في هذا الثقب وجعل شق عمودي عن طريق الشبكية بطني إلى القرص البصري. هذا سيسمح لك لتوجيه شبكية العين عند إزالته.
- إزالة RPE مع غرامة نقطة ملقط. الاستيلاء على RPE في شق بطني واحد واستخدام ملقط ملقط أخرى لقشر RPE بعيدا عن الشبكية ، وتحديدا عند مفرق RPE عدسة حيث تعلق بحزم RPE. بعد إزالة RPE ، فهم مع عدسة ملقط الغرامة وسحب ما يصل ، وبعيدا لإزالة العدسة. إزالة الشبكية من خلال وضع ملقط حول رأس العصب البصري والشبكية قرصة قبالة. نقل الشبكية لبرنامج تلفزيوني مملوءة جيدا ، والتي تتبع الشبكية التي جاءت من رؤساء.
- كرر الخطوات 4-5 لشبكية العين المقابل ، وعلى جميع electroporated الأجنة الأخرى. في شبكية العين غير حقن بمثابة الرقابة على immunostaining.
- استخدام المجهر الفلورسنت تشريح لفحص كل لخلايا الشبكية + GFP (أخضر الشبكية). للجميع + GFP الشبكية ، كان electroporation ناجحة في هذا الجنين ، ويمكن معالجة هذه الدماغ وشبكية المقابلة (مع النظام البصري سليمة) لمزيد من التحليل (أي sectioning وimmunostaining) (الشكل 1).
3A الجزء : تحويلة electroporation فيفو الشبكية عن طريق الحقن وelectroporating الحمض النووي في E14.5 الشبكية الفئران في المختبر
- تخدير الأم E13.5 - E14.5 المسرح مع 0.2 مل من مزيج التخدير والتأكد من أنها تحت التخدير الكامل. استخدام المقص لقطع طريق الجلد ، وتجويف البطن لفضح الأجنة. ترفع سلسلة الجنينية مع ملقط وقطع طريق النسيج الضام لإزالة تماما الجنينية سلسلة كاملة من الأم. مكان سلسلة الجنينية في طبق بيتري مع DMEM/F12 على الجليد. أم الموت ببطء عبر خلع عنق الرحم.
- قطع طريق جدار الرحم بالكامل مع microscissors. ثم استخدم الملقط لإزالة كل جنين من الكيس الأمنيوسي وقرصة قبالة المشيمة. قطع رأس الجنين وجمع كل رؤساء أخرى في طبق بيتري مع DMEM/F12 على الجليد.
- باستخدام الماصة الفم أو الماصة المكبس ، وملء micropipette مع المبلغ المطلوب من محلول الحمض النووي (انظر الجزء 1).
- في هذا البروتوكول ، سيتم حقن الحمض النووي في شبكية العين الظهرية الطرفية. يمكن للمرء أن استهداف مناطق الشبكية الأخرى من خلال تعديل الحمض النووي في موقع الحقن والمواقع من المجاذيف الكهربائي.
- نقل رئيس واحد لطبق تشريح مع برنامج تلفزيوني ودبوس رئيس الجانب الظهري تصل. استخدام الملقط لإزالة الجلد فوق الشبكية.
- عقد micropipette ~ 10 درجة من الوضع الأفقي (الموازية أساسا إلى انحناء شبكية العين الظهرية) ، ودفع من خلال micropipette RPE بحيث غيض من بين طبقة الشبكية RPE والخارجي. طرد ~ 0،1-0،4 حل DNA ميكرولتر في هذا الفضاء ، وينبغي ملاحظتها السائل ملء كامل المساحة الخضراء ، وتتسرب من خلال ثقب في RPE. تكرار الحقن لشبكية العين المقابل.
- إزالة بعناية ولكن سرعان ما ودبابيس (رئيس حفظ منغمسين في PBS) المجاذيف القطب مكان حول الرأس ، مع مجداف (+) ايجابية على الجانب البطني من الرأس. تسليم 4 40 - V ، و 50 مللي البقول في 60 هرتز ، ثم ضع يعودون الى الطبق مع DMEM/F12 على الجليد (الشكل 2).
- كرر الخطوات من 5-7 لجميع رؤساء وحلول لجميع الحمض النووي. بعد الانتهاء من electroporations ، إضافة ~ 1.5 مل من محلول SFM المؤكسج إلى صحن 4 - جيدا والحفاظ على الجليد (واحد من كل حل جيد لحقن الحمض النووي مختلفة).
- نقل رئيس واحد لطبق تشريح مع DMEM/F12 ، مع واحد الشبكية مواجهة. على شبكية العين بطني (أو المنطقة المستهدفة الجانب المعاكس) ، استخدم ملقط غرامة لقرصةواحداث ثغرة في RPE. إدراج واحدة من نهاية ملقط من خلال هذا الثقب لقشر RPE بعيدا عن الشبكية ، وتحديدا عند مفرق عدسة العين. لا قطع أو تلف شبكية العين لأن هذا سوف يتسبب في انهيار الشبكية على نفسه أثناء الحضانة. بعد إزالة RPE ، استخدم ملقط لموسيقى البوب من شبكية العين بواسطة العصب البصري معسر في قاعدة شبكية العين (اترك عدسة سليمة). نقل الشبكية لSFM الاوكسيجين. الوجه والرأس فوق العين لتكرار المقابل.
- إكمال الخطوة 9 لجميع رؤساء electroporated. احتضان الشبكية في SFM الاوكسيجين عند درجة 37 ل40-48 ساعة.
3B الجزء : تحويلة فيفو حصاد electroporation الشبكية وتصفيح GFP + explants الشبكية (2 يوما بعد electroporation)
- نقل جميع الشبكية من بئر واحد من الاوكسيجين الى SFM غطاء صحن بيتري مع DMEM/F12. حدد أحد شبكية العين واستخدام الفلورسنت نطاق تشريح لتصور GFP + (الأخضر) جزء من شبكية العين.
- باستخدام microscalpel والملقط ، تشريح وتجاهل الجزء + غير GFP الشبكية بحيث سوى GFP + قطعة من شبكية العين لا يزال قائما. ومن المفيد للتبديل باستمرار بين ضوء الفلورسنت والعادية في جميع أنحاء تشريح لتحديد على وجه التحديد GFP + الشبكية. نقل GFP + الشبكية لبئر مع DMEM/F12.
- كرر الخطوة 2 لجميع الشبكية من بئر واحد. لكل شرط الحمض النووي (كل بئر مختلفة) ، واستخدام طبق بتري والمتوسطة الجديدة DMEM/F12.
- ويجب الآن هذه GFP + تشريح شبكية تكون في explants أصغر لشبكية العين الطلاء. تحت نطاق تشريح ، وقطع قطعة كبيرة من شبكية العين + GFP إلى أصغر explants مع microscalpel. Explants ينبغي مستطيلة ، ~ 200-300 ميكرون في الطول والعرض. جمع كل explants في بئر مع DMEM/F12. ينبغي للمرء أن GFP + قطعة من شبكية العين إنتاج ~ 40-10 GFP + explants الشبكية بالاعتماد على حجم الأنسجة. كرر هذه الخطوة بالنسبة لجميع المناطق + GFP الشبكية التي تم حصادها.
- بعد إعداد جميع GFP + explants الشبكية ، إضافة 250 ميكرولتر من SFM methylcellulose + 0.4 ٪ (يحتفظ بها في 4 درجات مئوية) لأطباق ثقافة laminin المغلفة (انظر الجزء 1). نقل 4-8 GFP + explants إلى صحن الثقافة واستخدام ملقط لترتيب بلطف explants الى مضلع ، مع explants تقع في منتصف بين المركز وحافة الطبق.
- تحديد أي جانب من يزدرع هي طبقة RGC. أحيانا بلورات RPE تظل مرتبطة طبقة الشبكية الخارجي ، مشيرا إلى أن الجانب الآخر هو طبقة RGC. بالإضافة إلى ذلك ، الجانب RGC عادة بعض الحطام الخلوية التي يمكن أن تساعد في توجيه يزدرع المناسبة.
- مع طبقة RGC أسفل ، واستخدام ملقط لخفض بشدة وسط يزدرع بحيث تلتزم ساترة الزجاج. قد المسافة البادئة في يزدرع من ملقط تكون مرئية ، وهذا أمر طبيعي.
- بعد طلاء جميع explants على طبق والثقافة ، ونقل إلى 37 درجة مئوية الحاضنة. ويلاحظ المحاور الشبكية first 4-6 بعد ساعات من الطلاء ، وexplants البقاء بصحة جيدة لعدة أيام ، ولكن يمكن أن يحدث فرط كبيرة بعد 24 ساعة. يمكن استخدامها في العديد من Explants لفحوصات المختبر ، ثابت مع PFA 4 ٪ لمدة 30 دقائق ، وimmunostained (الشكل 2).
الحدود الفحص
- بدلا من ذلك ، نقل 4 GFP + explants إلى الطبق الذي تم إعداده لفحص الحدود (انظر الجزء 1). ترتيب explants في خط عمودي في وسط الصحن ، وتقريب الموقع من الحدود.
- تحت الفلورسنت تشريح لوحة ، والمجهر explants بحيث تكون ~ 50-150 ملم من الحدود الفلورسنت. احتضان الصحون في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، مما يتيح وقتا كافيا للوصول إلى المحاوير RGC الركيزة الحدود. يمكن ان تكون ثابتة في Explants PFA 4 ٪ لمدة 30 دقيقة ، تليها immunostaining (الشكل 2).
ممثل النتائج
Discussion
في هذا الفيديو ، لقد أثبتنا تقنيات electroporation ، سواء في داخل الرحم وفيفو السابقين ، لتوصيل الجينات في الفئران الجنينية RGCs في الرحم electroporation الشبكية يوفر آلية لمعالجة التعبير الجيني في RGCs ووضع تصور لإسقاطات محوار في الجسم الحي. السماح للأجنة البقاء على قيد الحياة بعد الولادة ، تصاريح دراسة هذه التوقعات GFP + RGC الى هدفهم ، والنواة الركبية الجانبية (LGN). electroporation الشبكية خارج الجسم ويوفر المزيد من القدرة على السيطرة على المناطق المستهدفة شبكية محددة للاستخدام مع المقايسات في المختبر. الجمع في الجسم الحي في التحليلات المختبرية والمستمدة من هذه التقنيات تسمح توصيف دقيق للوضع RGC والإسقاطات محوار في مجموعة فرعية من RGCs في خلفية طبيعية على خلاف ذلك. في حين يركز على مظاهرة لدينا توجيهات محوار RGC في chiasm البصرية ، سواء في داخل الرحم وخارج الجسم الحي electroporations الشبكية يمكن أن تكون مفيدة لدراسة كيفية حدوث اضطرابات في التعبير الجيني تمايز تأثير RGC ، مورفولوجيا الجذعية ، والخصائص الكهربية ، وتشكيل المشبك والسليم الاستهداف في مناطق مثل هذا الإنهاء كما LGN وأكيمة متفوقة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ريتشارد وفاليه شريستا Brikha للمساعدة في داخل الرحم وخارج الجسم الحي electroporation التقنيات الشبكية ، على التوالي ، والدكتور T. ساكوراي للتعليق على هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح F31 NS051008 (TJP) ، ومؤسسة من أجل لا ميديكال بحوث والعلوم الحدودي برنامج الإنسان (ع) وEY12736 R01 (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle) | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Round tweezer electrodes | Nepa Gene | CUY650-5 or CUY650-7 | |
| Silk Sutures | Henry Schein | 101-2636 | |
| Glass micropipettes with plungers | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
| Antibiototic-antimycotic | Invitrogen | 15240096 | |
| DMEM/F12 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11330057 | |
| Albumin bovine serum | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| ITS supplement | Sigma-Aldrich | I-1884 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
References
- Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).
- Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection. J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).
