La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

Summary

Aquí se presentan dos técnicas para manipular la expresión génica en las células ganglionares de la retina murina (CGR) por

Abstract

La retina y su neurona de salida única, la de las células ganglionares retinianas (CGR), constituyen un modelo excelente para estudiar las cuestiones biológicas como la diferenciación celular, para guía de axones, la organización retinotópica y la formación de sinapsis [1]. Un inconveniente es la imposibilidad de manipular de manera eficiente y segura la expresión génica en la CGR en vivo, especialmente en el acceso de otro modo las vías visuales murino. Los ratones transgénicos se puede utilizar para manipular la expresión génica, pero este enfoque es a menudo costoso, consume mucho tiempo, y puede producir efectos secundarios no deseados. En pollo, en la electroporación in ovo se utiliza para manipular la expresión génica en la CGR para el examen de la retina y el desarrollo de RGC. Aunque las técnicas de electroporación similares se han desarrollado en las crías de ratón recién nacido [2], las ratas adultas [3], y la retina embrionaria murino in vitro [4], ninguna de estas estrategias permiten la caracterización completa de desarrollo RGC axón y las proyecciones en vivo. Con este fin, hemos desarrollado dos aplicaciones de electroporación, una en el útero y los otros ex vivo, para actuar específicamente sobre embriones murinos CGR [5, 6].

Con la electroporación en el útero de retina, que puede regular a la baja misexpress o genes específicos en CGR y seguir sus proyecciones axón a través de las vías visuales en vivo, lo que permite el examen de las decisiones de orientación a objetivos intermedios, tales como el quiasma óptico, o en regiones específicas, como la núcleo geniculado lateral. Perturbar la expresión génica en un subconjunto de la CGR en un fondo de tipo salvaje de lo contrario facilita el entendimiento de la función de genes a lo largo de la vía de la retina. Además, hemos desarrollado una técnica de compañía para el análisis de crecimiento de los axones CGR in vitro. Nos electroporar embrionarias cabezas ex vivo, recoger e incubar toda la retina, a continuación, preparar explantes de estos días retinas más tarde. Explantes de retina se pueden utilizar en una variedad de ensayos in vitro con el fin de examinar la respuesta de la electroporación axones de CGR a las señales de orientación u otros factores. En suma, este conjunto de técnicas de mejora nuestra capacidad de misexpress o regular a la baja en los genes CGR y en gran medida debería ayudar a los estudios que examinan el desarrollo y las proyecciones RGC axón.

Protocol

Parte 1: Configuración en el útero y ex vivo electroporations retina

1. Por tanto en el útero y ex vivo electroporations retina

• Use un extractor de electrodos para preparar de punta fina micropipetas y romper la punta (o bisel de la punta) para hacer una punta afilada.
• Preparar las soluciones de ADN para las concentraciones deseadas y añadir una pequeña cantidad de tinte verde rápido (0,05%) para visualizar las inyecciones. Recomiendo solución de ADN 5 l por la madre en el útero electroporations la retina y una solución de ADN l por cabeza de embriones para la ex electroporations vivo retina. Incluyen un constructo de expresión de GFP (proteína fluorescente o de otro tipo) para visualizar las neuronas transfectadas.
• Esterilizar los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave.
• Prepare la mezcla de ketamina-xilazina anestésico con la siguiente relación (lo que aproximadamente 0.2 ml por cada mujer embarazada): una relación 1.0:0.2:4.6 aforado de 100 mg / ml de ketamina: 100 mg / xilazina ml: solución salina. Otros anestésicos pueden ser utilizados.

2. En el útero electroporations retina sólo

• A su vez sobre el cojín eléctrico y cubrir con una plataforma de pañal.
• Prepare la solución de antibiótico-antimicótico (1:100) en tampón fosfato salino (PBS) y caliente en una almohadilla térmica. Prepare ~ 2 ml por cada presa.
• Lugar esterilizada por filtración PBS en un baño de agua tibia.

3. Para ex vivo electroporations retina sólo

• Prepare oxigenada medio libre de suero (SFM) para la incubación de la retina: Bubble 25 ml de DMEM/F12 con un 95% de oxígeno / 5% de dióxido de carbono por ≥ 2 horas. Para el medio de 25 ml oxigenada, añadir 0,25 g de albúmina sérica bovina (BSA), 250 l de su suplemento y 50 l solución de penicilina-estreptomicina. Mezcle la solución para disolver la BSA, a continuación, filtrar la solución estéril. Esta solución debe ser fresca para cada experimento de electroporación.
• Prepare SFM + 0,4% de metilcelulosa medio para la incubación de explantes de retina: Autoclave 0,20 g de metilcelulosa en un frasco de 150 ml con un imán revuelo. Prepare 50 ml de la ordenación forestal sostenible (como el anterior, sin burbujas) y añadir a la botella de metilcelulosa en autoclave. Mezcle esta solución a 4 ° C durante la noche. Filtro estéril esta solución al día siguiente y se almacenan a 4 ° C, esta solución puede conservarse durante aproximadamente 1 mes.
• En el día de la cosecha de explantes de retina (parte 5), la preparación de platos para la siembra de explantes de retina: Escudo de vidrio placas de cultivo de fondo con 250 l de poli-L-ornitina de ≥ 2 horas a 37 ° C. (Por otra parte, los platos pueden ser recubiertas con poli-L-ornitina el día anterior y se incubó durante la noche a 4 ° C) Lave los platos varias veces con PBS, y luego los platos abrigo con 200 l de 10 mg / ml laminina en DMEM/F12 de ≥ 2 horas a 37 ° C. Lave los platos varias veces con PBS a 37 ° C y dejar en PBS hasta explantes están listos para la siembra.
• Para los ensayos de la frontera, platos capa con poli-ornitina como arriba, entonces la mitad de la capa de la cápsula con la proteína de interés junto con un marcador fluorescente para visualizar la frontera (como Alexa Fluor 555 conjugado con BSA, 1:800) durante 2 horas a 37 ° C. Lavar con PBS, a continuación, agregar la laminina como se describió anteriormente.

Parte 2A: En la retina de electroporación in utero por vía intravenosa y electroporating ADN en E14.5 retinas murino in vivo

1. Inyectar 0,15 ml de la mezcla de anestésicos por vía intraperitoneal (ip) en una presa de E13.5-E14.5 etapa. Se debe tener 3-7 minutos hasta que la madre ha llegado a un plano quirúrgico de anestesia. Un ratón completamente anestesiado no se debe responder a los pellizcos de la pata trasera.
2. Durante este tiempo, cortar un pequeño trozo de parafilm y pipeta de ~ 5 ul de solución de ADN a la parafina. Doblar un émbolo (alambre) en un ángulo de 90 ° y la inserta en un micropippette tiró. Utilizando el émbolo, aspirado de la solución de ADN en la micropipeta (utilizando un microscopio de disección puede contribuir a este proceso).
3. Una vez que la madre ha llegado a un plano quirúrgico de anestesia, use una afeitadora eléctrica para afeitarse a ~ 2 pulgadas de la región del abdomen de la madre de s, entonces el lugar de su cara dorsal hacia abajo sobre el cojín eléctrico. Preparación de la zona afeitada frotando con un algodón con alcohol seguido por una plataforma de yodo con un mínimo de dos veces. Coloque una gota de ungüento oftálmico veterinario en cada ojo para evitar ulceración de la córnea de los ojos mientras la madre está bajo anestesia general.
   
4. Con las pinzas, agarre la piel y el uso de las tijeras para hacer una incisión vertical a lo largo de la línea media (aproximadamente 1 pulgada de largo) a través de la piel y los músculos del abdomen, dejando al descubierto el peritoneo. Levantar el peritoneo con la pinza y hacer una incisión vertical similar a través de esta membrana para exponer la cavidad abdominal (Figura 1). A continuación, cubrir el campo quirúrgico con gasas para evitar que el contenido abdominal en contacto y estar contaminado por los pelosdel animal.
5. Tire hacia atrás la piel y el peritoneo con las pinzas y el uso de la espátula de disección para extraer un embrión a través de la incisión (elegir el embrión más accesible). Coloque la espátula entre dos embriones y tire de la cadena de embriones fuera de la cavidad abdominal. Usted puede sacar la cadena de embriones con los dedos.
   * A partir de este punto en adelante, mantener los embriones hidratados con PBS estéril *
6. Mantener a la madre sobre el cojín eléctrico, su lugar bajo el microscopio de disección y el masaje de un embrión para que la retina esté hacia arriba. Yo recomiendo empezar con cualquiera de los embriones más medial o lateral, por lo que es más fácil seguir la pista de que los embriones fueron electroporated.
7. Tome la micropipeta en su mano dominante y estabilizar el embrión con la otra mano. Con la micropipeta, perforar la retina a través de la pared del útero y el saco amniótico. En función de la nitidez de la micropipeta, es posible que una buena cantidad de presión para penetrar la pared del útero, pero una vez que a través de la micropipeta entrará en el embrión y lo ideal es la retina. Puede ser difícil de controlar y medir la profundidad de la micropipeta, ya que entra en el embrión. Minimizar la cantidad de movimiento micropipeta una vez que ha atravesado la membrana para evitar que la ampliación del agujero de entrada, lo que resulta en la pérdida de líquido amniótico y la muerte del embrión. Evitar los vasos sanguíneos en la perforación de la pared uterina, ya que esto dará lugar a la hemorragia y la muerte del embrión.
8. Una vez que esté seguro de que la micropipeta ha entrado en la retina, ya está listo para expulsar a la solución de ADN en la retina. Lentamente el émbolo y al mismo tiempo retirar la micropipeta, asegurando que el ADN es inyectado a través del camino de la micropipeta, como la micropipeta a menudo penetra profundamente en la retina. Si usted está en la retina, expulsar a 0,5 l (se puede medir por el 1 marcas l en la micropipeta) en el espacio extraretinal entre la capa externa de la retina y el epitelio pigmentario retiniano (EPR). Usted debe observar tinte verde llenado la retina y se escapa en el líquido amniótico (Figura 1).
9. Las paletas de electroporación se debe mantener en un plato lleno de PBS-Petri durante la cirugía. Con cuidado, coloque las paletas a los lados de la cabeza del embrión con el polo positivo (+) remar en el mismo lado que el ojo inyectado. Aplique una cantidad moderada de la presión para estabilizar la cabeza, pero no presione demasiado fuerte, ya que esto abrirá el saco amniótico y provocar la muerte del embrión. Cuando los electrodos están en su lugar, entregar 5 de 40 V, 50 ms pulsos cuadrados con una frecuencia de 60 Hz. No es raro que la madre de contracción por escape de corriente en la piel y los músculos.
10. Repita los pasos 7-9 para cada embrión para ser inyectada y electroporación. Por lo general electroporar embriones 4-8 por la madre, dependiendo de la cantidad de ADN, el número de embriones, la condición de madre, y la cantidad de tiempo bajo anestesia. Por otra parte, los embriones múltiples se puede inyectar y electroporated entonces, en lugar de la inyección y electroporating cada embrión por separado.
11. Después de electroporating los embriones, el uso del fórceps y una espátula para reemplazar la cadena de embriones en la cavidad abdominal. Vierta ~ 2 ml de la solución de antibiótico-antimicótico en la cavidad abdominal.
12. Utilice la pinza y la pinza de sutura el peritoneo, comenzando con un nudo doble en la parte anterior de la incisión y proceder con un patrón de sutura continua simple a la parte posterior de la incisión. Utilice el último bucle para atar la sutura y sutura de recortar el exceso.
13. De primera necesidad se cierra la incisión, levantar la piel en la parte anterior de la incisión con una pinza roma, teniendo cuidado de separar la piel del peritoneo. Coloque los dientes de la grapadora alrededor de la piel y presione la grapadora. Continuar grapado se cierra la incisión con el extremo posterior, que normalmente requiere grapas 5-7. Limpie la herida alrededor de las grapas con una gasa con alcohol.
14. Deje que la madre se recuperan en el cojín de la calefacción (por lo general tarda entre 15-90 minutos para que su despertar) y cuando empieza a rodar, su lugar en un lado de la jaula abdominal nueva formación.
15. Para minimizar el dolor y el malestar, las madres reciben buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg, sc) al despertar, y más tarde en los puntos de tiempo si continúa el malestar. Para prevenir la deshidratación, se inyecta a la madre con 1,0 ml de solución salina por vía subcutánea (sc) ~ 2-4 horas después de la cirugía, y otra vez si por la noche y el día siguiente si es necesario. 24 horas después de la cirugía, la madre debe recuperar el comportamiento normal y que beber y comer regularmente.

Parte 2B: En la recuperación de la electroporación in utero la retina de la retina electroporated en E18.5

1. Prepare 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS, por lo que ~ 5 ml por embrión. Perfusiones se puede hacer con un sistema de infusión por gravedad o una bomba de jeringa. (Por otra parte, E18.5 cabeza simplemente se puede sumergir en el 4% PFA durante la noche.)
2. Inyectar a la madre0,2 ml de anestésico mezcla de IP y asegurarse de que ella está completamente bajo anestesia. Utilice unas tijeras para cortar la piel y el peritoneo por debajo de las grapas para exponer la cavidad abdominal y los cuernos uterinos.
3. Eliminar un embrión electroporated y el pin lado ventral hacia arriba. Corte a través de las porciones de la piel abdominal, el peritoneo, el diafragma y el lateral de la caja torácica para exponer el corazón. Perforar el ventrículo izquierdo con la aguja de mariposa unida a la configuración de la perfusión, y cortar la aurícula derecha con un micro tijeras. Iniciar la perfusión y permitir que el flujo de PFA de 60 segundos, la sangre debe salir de la aurícula derecha y el embrión debe ser claro si la perfusión es satisfactoria. Decapitar al embrión y recoger la cabeza en el 4% PFA en 15 ml frasco cónico. Repita este procedimiento para todos los embriones electroporated. Mantener la cabeza en el 4% PFA durante la noche a 4 ° C, y luego lavar en PBS durante varios días. Eutanasia madre a través de la dislocación cervical cuando todos los embriones.

La eliminación de la retina

1. Después de lavados con PBS, el pin de la cabeza en un plato con la disección de la retina hacia arriba y sumergirse en PBS. Quite la piel de alrededor de la retina para revelar la RPE. Usando una aguja 26G1 / 2, la punción de la retina ventral en la unión de lentes EPR. Inserte uno de los bordes de un micro tijeras en este agujero y hacer una incisión vertical a través de la retina ventral del disco óptico. Esto le permitirá orientar la retina cuando se retire.
2. Quitar el EPR con pinzas de punta fina. Coge la RPE en la incisión ventral con una pinza y el uso de fórceps otros a pelar el EPR a la retina, específicamente en el cruce de RPE-lente que está firmemente conectado el EPR. Después de retirar la RPE, sujete la lente con unas pinzas finas y tire hacia arriba y afuera para extraer el cristalino. Retire la retina mediante la colocación de pinzas alrededor de la cabeza del nervio óptico y una pizca de retina. La transferencia de la retina a una PBS-llena, así, llevar la cuenta de que provenía de retina que se dirige.
3. Repita los pasos 4-5 para la retina contralateral, y para todos los embriones electroporated otros. La retina no inyecta sirve como control de la inmunotinción.
4. Utilizar un microscopio de fluorescencia de disección para examinar todos los retinas de GFP + células (verde retina). Para todas las buenas prácticas agrarias + retinas, la electroporación fue un éxito en este embrión, y estos cerebros y retinas correspondiente (con el sistema visual intactos) puede ser procesada para su posterior análisis (es decir, corte y tinción) (Figura 1).

3a parte: Ex electroporación in vivo la retina y la inyección de ADN en electroporating E14.5 retinas murino in vitro

1. Anestesiar a una madre E13.5-E14.5 etapa con 0,2 ml de la mezcla de anestésico y asegurarse de que está totalmente bajo anestesia. Utilice unas tijeras para cortar a través de la piel y la cavidad abdominal para exponer los embriones. Levante la cadena de embriones con unas pinzas y cortar a través del tejido conectivo para eliminar por completo la cadena de embriones todo de la madre. Lugar de la cadena de embriones en una placa de Petri con DMEM/F12 en el hielo. Eutanasia madre a través de la dislocación cervical.
2. Corte a través de toda la pared del útero con un micro tijeras. A continuación, el uso de fórceps para extraer cada embrión del saco amniótico y una pizca de placenta. Decapitar a cada embrión y recoger la cabeza en otra placa de Petri con DMEM/F12 en el hielo.
3. Usando una pipeta la boca o una pipeta de émbolo, micropipeta llenar con la cantidad deseada de solución de ADN (ver Parte 1).
4. En este protocolo, el ADN se inyecta en la retina periférica dorsal. Permite afrontar otras regiones de la retina mediante el ajuste del sitio de la inyección de ADN y la colocación de las paletas.
5. Transferencia de una cabeza a la disección de plato con PBS y el pasador del lado dorsal de la cabeza hacia arriba. El uso de fórceps para quitar la piel por encima de la retina.
6. La celebración de la micropipeta ~ 10 ° desde la posición horizontal (esencialmente paralela a la curvatura de la retina dorsal), empuje a través de la micropipeta EPR para que la punta es entre el EPR y la capa exterior de retina. Expulsar a ~ 0.1-0.4 l solución de ADN en este espacio, un líquido verde debe ser observable llenar todo el espacio y se escape a través del agujero en el RPE. Repetir la inyección de la retina contralateral.
7. Con cuidado pero rápidamente retirar los broches y (cabeza manteniendo inmersos en PBS) palas de electrodos lugar alrededor de la cabeza, con el polo positivo (+) pala en el lado ventral de la cabeza. Entregar 4 de 40 V, 50 pulsos ms a 60 Hz, a continuación, coloque la cabeza hacia atrás en un plato con DMEM/F12 en hielo (Figura 2).
   
8. Repita los pasos 5-7 para todos los jefes y para todas las soluciones de ADN. Después de completar electroporations, añadir aproximadamente 1,5 ml de solución de SFM oxigenada a un plato de 4 bien y mantener en hielo (un bien para cada solución de ADN diferentes inyectada).
9. Transferencia de una cabeza a la disección de un plato con DMEM/F12, con una retina hacia arriba. En la retina ventral (o región lado opuesto de destino), use unas pinzas finas para pellizcary abrir un agujero en el EPR. Inserte un extremo de la pinza a través de este agujero de la cáscara del EPR a la retina, específicamente en el cruce de la lente-retina. No cortar o dañar la retina, porque esto hará que la retina a colapsar sobre sí mismo durante la incubación. Después de la eliminación de RPE, el uso de fórceps para que salga por la retina del nervio óptico pellizcos en la base de la retina (deje el objetivo intacto). Transferencia de retina a la ordenación forestal sostenible oxigenada. Pon tu cabeza y repita para el ojo contralateral.
10. Completar el paso 9 para todos los jefes electroporación. Incubar retina en SFM oxigenada a 37 ° C durante 40-48 horas.

3b parte: Ex cosecha vivo retina electroporación y de las planchas de GFP + explantes de retina (2 días después de la electroporación)

1. La transferencia de todas las retinas de un pozo de SFM oxigenada en una tapa de caja de Petri con DMEM/F12. Seleccione una retina y el uso de fluorescentes alcance de disección para visualizar GFP + (verde) parte de la retina.
2. El uso de un microscalpel y pinzas, diseccionar y deseche la porción no-GFP + de la retina de manera que sólo una GFP + trozo de retina permanece. Es útil para cambiar continuamente entre la luz fluorescente y regular a lo largo de la disección para seleccionar específicamente la GFP + retina. La transferencia de la GFP + retina a un pozo con DMEM/F12.
3. Repita el paso 2 para todos los retina de un pozo. Para cada condición de ADN (cada una bien diferente), utiliza una nueva placa de Petri y medio DMEM/F12.
4. Estas buenas prácticas agrarias + retinas ahora debe ser disecado en pequeños explantes de retina para la siembra. Bajo un microscopio de disección, corte pedazo grande de las buenas prácticas agrarias retina + en pequeños explantes con una microscalpel. Explantes debe ser rectangular, ~ 200-300 micras de longitud y anchura. Recoge todos los explantes en un pozo con DMEM/F12. Una GFP + trozo de retina se produce ~ 4.10 GFP + explantes de retina, dependiendo del tamaño del tejido. Repita este paso para todas las regiones de la retina GFP + que fueron cosechados.
5. Después de preparar todas las buenas prácticas agrarias + explantes de retina, añadir 250 l de SFM + 0,4% de metilcelulosa (mantenido a 4 ° C) a los platos de la cultura laminina recubierto (véase la Parte 1). Transferencia de buenas prácticas agrarias 8.4 + explantes de la placa de cultivo y el uso de las pinzas para arreglar suavemente los explantes en un polígono, con explantes encuentra a medio camino entre el centro y el borde del plato.
6. Determinar qué lado del explante es la capa de CGR. A veces los cristales RPE de permanecer unidos a la capa exterior de retina, lo que indica que el lado opuesto se encuentra la capa de CGR. Además, el lado RGC por lo general tiene algunos restos celulares que pueden ayudar en la orientación del explante adecuado.
7. Con la capa RGC abajo, el uso de fórceps para presionar firmemente el centro de la explante para que se adhieran a la cubreobjetos. Una muesca en el explante de las pinzas pueden ser visibles, esto es normal.
8. Después de sembrar todos los explantes en una placa de cultivo, el traslado a una incubadora de 37 ° C. Axones retinianos se observó por primera vez 4-6 horas después de la siembra y los explantes se mantendrán sanos durante varios días, pero el crecimiento excesivo significativo puede ocurrir después de 24 horas. Los explantes se puede utilizar para numerosos ensayos in vitro, se fijaron con PFA al 4% durante 30 minutos y immunostained (Figura 2).

Ensayo de la frontera

8. Por otra parte, la transferencia de buenas prácticas agrarias + 4 explantes a un plato que se ha preparado para el ensayo de la frontera (ver Parte 1). Organizar los explantes en una línea vertical en el centro del plato, la aproximación de la ubicación de la frontera.
9. Bajo un microscopio de disección fluorescentes, placa de los explantes de modo que son aproximadamente 50 a 150 mm del borde fluorescentes. Incubar los platos a 37 ° C durante 24 horas, dando tiempo suficiente para que los axones RGC sustrato para llegar a la frontera. Los explantes se fija en el 4% PFA durante 30 minutos, seguido de tinción (Figura 2).

Los resultados representativos

Discussion

En este video, que han demostrado las técnicas de electroporación, tanto en el útero y ex vivo, para la entrega de genes en embriones murinos CGR. En el útero de la electroporación retina proporciona un mecanismo para la manipulación de la expresión génica en CGR y visualizar sus proyecciones de axones in vivo. Permitiendo que los embriones para sobrevivir después del nacimiento permite el examen de estas buenas prácticas agrarias + proyecciones RGC en su objetivo, el núcleo geniculado lateral (LGN). Ex electroporación in vivo retina proporciona una capacidad de más controlado para las regiones objetivo específico de la retina para su uso con los ensayos in vitro. La combinación in vivo e in vitro en los análisis derivados de estas técnicas permite la caracterización rigurosa del desarrollo RGC axón y las proyecciones en un subconjunto de la CGR en un segundo plano por lo demás normal. Mientras que nuestra manifestación se centra en la RGC para guía de axones en el quiasma óptico, tanto en el útero y ex vivo electroporations retina podría ser beneficioso para el estudio de cómo las perturbaciones en la diferenciación de efecto de la expresión génica RGC, morfología dendrítica, propiedades electrofisiológicas, la formación de sinapsis y la adecuada focalización en las zonas de terminación como el LGN y colliculus superior.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)	Harvard Apparatus	450052
Round tweezer electrodes	Nepa Gene	CUY650-5 or CUY650-7
Silk Sutures	Henry Schein	101-2636
Glass micropipettes with plungers	Drummond Scientific	5-000-1001-X10
Antibiototic-antimycotic	Invitrogen	15240096
DMEM/F12 medium	GIBCO, by Life Technologies	11330057
Albumin bovine serum	Sigma-Aldrich	A8806-5G
ITS supplement	Sigma-Aldrich	I-1884
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015