Summary
ここではでマウス網膜神経節細胞（RGCs）で遺伝子発現を操作するための2つのテクニックを紹介
Abstract
網膜とその唯一の出力ニューロン、網膜神経節細胞（RGC）は、このような細胞分化、軸索ガイダンス、網膜部位の組織とシナプス形成[1]のような生物学的疑問を調査するための優れたモデルを構成する。一つの欠点は、特にそうでない場合はアクセス可能なマウスの視覚的な経路で、効率的かつ確実にin vivoで RGCsにおける遺伝子発現を操作することができないことである。トランスジェニックマウスは、遺伝子発現を操作するために使用されますが、このアプローチは、しばしば時間がかかり高価であり、そして望ましくない副作用を作り出すことができることができます。ひよこでは、OVOエレクトロポレーションで網膜とRGCの開発を検討するためRGCsにおける遺伝子発現を操作するために使用されます。同様のエレクトロポレーション技術は、新生児マウスの仔で開発されているが[2]、成体ラット[3]、およびin vitroでの胚のマウス網膜[4]、これらの戦略はいずれもin vivoで RGC開発と軸索突起の完全な特性評価を可能にしない。この目的のために、我々は、特に胚のマウスRGCs [5、6]ターゲットに、エレクトロポレーションの2つのアプリケーション、 子宮やその他のex vivoでの 1つを開発した。
子宮内網膜エレクトロポレーションに使用すると、我々のような、misexpressまたはダウンレギュレートするRGCsで特定の遺伝子をし、in vivoでの視覚経路を介して、その軸索突起に従って、このような視交叉などの中間目標、時、または対象地域での指導上の意思決定の検査を可能にすることができます外側膝状核。そうでなければ、野生型バックグラウンドでRGCsのサブセットの遺伝子発現を乱すことはレチナール経路全体の遺伝子機能の理解を容易にします。さらに、我々はin vitroで RGC軸索の成長を分析するためのコンパニオンの技術を開発しました。我々は、胚の頭部ex vivoでのエレクトロ全網膜を収集し、インキュベートして、後でこれらの網膜、数日間から外植片を準備する。網膜外植片は、指導の手がかりやその他の要因へのエレクトロポレーションRGC軸索の応答を調べるために、in vitro試験の用途に使用できます。合計では、技術のこのセットはmisexpressまたはダウンレギュレートする遺伝子をRGCsで、大幅RGC開発と軸索突起を調べる研究を支援する必要が我々の能力を高める。
Protocol
パート1： 子宮内および ex vivo網膜エレクトロポレーションのためのセットアップ
1。 子宮および ex vivo網膜エレクトロの両方のための
- 先の細いピペットを準備し、角度の点を確認するためのヒント（またはベベル先端を）破る電極プラーを使用してください。
- 所望の濃度にDNA溶液を調製し、注射を視覚化するためにファストグリーン染色（0.05％）を少量加える。私は子宮内網膜エレクトロとex vivoでの網膜エレクトロのための胚の頭部ごとに1μlのDNA溶液中でのマザーあたり5μlのDNA溶液をお勧めします。トランスフェクションしたニューロンを可視化するためにGFPの発現構築物を（または他の蛍光タンパク質）が含まれます。
- オートクレーブを介して手術器具を滅菌する。
- 100μg/ mlのキシラジン：：生理食塩水ケタミン100μg/ mlと1.0:0.2:4.6体積比：以下の比率（各妊娠中の女性のために〜0.2 mlを作る）とケタミン - キシラジン麻酔ミックスを調製する。他の麻酔薬を使用することができます。
2。 子宮内網膜エレクトロポレーションのためにのみ
- 加熱パッドをオンにし、おむつのパッドでそれをカバーしています。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と加熱パッド上に暖かいの抗生物質 - 抗真菌剤溶液（1:100）を準備する。各ダムのために〜2 mlを調製。
- 温水浴で濾過滅菌したPBSを置きます。
3。 ex vivoでの網膜のエレクトロポレーション用のみ
- 95％酸素/≥2時間、5％炭酸ガスによる気泡DMEM/F12 25ml中：網膜のインキュベーションのための酸素を無血清培地（SFM）を準備する。 25ミリリットル酸素培地に、0.25グラムウシ血清アルブミン（BSA）、250μlのITSのサプリメントと50μlのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を加える。滅菌フィルターし、ソリューションをBSAを溶解する溶液を混合。このソリューションは、それぞれのエレクトロポレーション実験のために新鮮なされるべきである。
- オートクレーブ撹拌マグネット付き150mlのボトルでメチルセルロース0.20gの：網膜片のインキュベーションのためにSFM + 0.4％のメチルセルロース培地を準備します。 SFM（上記のように、バブリングせずに）50 mlを調製し、オートクレーブメチルセルロースのボトルに加える。 4℃で一晩、このソリューションを混在させること。滅菌フィルターこの溶液4で、次の日と店舗℃で、このソリューションは、〜1ヶ月間保存することができます。
- 網膜外植片の収穫（その5）の日には、網膜外植片のめっきに料理を準備：コートガラス底培養皿をポリ- L -オルニチン250μlで≥2時間、37℃で（また、料理は前日ポリ- L -オルニチンでコーティングすることができますし、4℃で一晩インキュベートした。）ウォッシュの料理は、PBSで数回、その後10μg/ mlのラミニンの200μlで被覆皿DMEM/F12で≥用37℃で2時間37皿をPBSで数回洗浄℃、外植片は、メッキのための準備が整うまではPBSに残す。
- 国境アッセイでは、ポリ-オルニチンとコートの料理は上記のように、その後蛍光マーカーとともに目的のタンパク質と料理のコートの半分は2時間での境界線（例えばBSA、1:800に共役のAlexa Fluor ® 555など）を可視化する37℃前述のようにラミニンを追加し、PBSで洗浄する。
パート2A： 子宮内網膜エレクトロポレーションでは、in vivoでの E14.5マウス網膜にDNAを注入しelectroporating
- E13.5 - E14.5段階のダムに麻酔薬混合腹腔内（ip）0.15 mlを注入する。母は麻酔の外科平面に到達するまで、それは3-7分かかることがあります。完全に麻酔マウスの後足のピンチに応答しません。
- この時間の間に、パラフィルムの上にDNA溶液の〜5μlのパラフィルムやピペットの小片をカット。 90 °度の角度でプランジャ（金属線を）曲げると引っ張らmicropippetteに挿入します。プランジャーを使用して、（解剖顕微鏡を使用すると、このプロセスを助けることができる）マイクロピペットにDNA溶液を吸引除去する。
- 母は麻酔の外科的平面に達すると、母親の腹部の〜2インチの領域を剃る電気かみそりを使用し、その後加熱パッド上に彼女の背側を下に置きます。準備は、アルコールパッドで拭いて剃毛面積は、ヨウ素パッドの2倍の最低が続く。母親は全身麻酔下にある間、目の角膜潰瘍を防ぐために各眼の眼科の獣医の軟膏のドロップを置きます。
- 鉗子で、皮膚をつかんで、腹膜を露出、腹部の皮膚と筋肉を通して正中線（〜1インチ長い）に沿って縦切開を行うためにハサミを使う。鉗子で腹膜を持ち上げ、腹腔（ 図1）を公開するには、この膜を介して同様の縦切開を行います。その後、連絡して髪の毛が汚染されるから腹部の内容を防ぐためにガーゼパッドで手術野をドレープ動物の。
- 鉗子で皮膚や腹膜を引いて、（ほとんどのアクセス可能な胚を選択する）を切開して胎児を抽出するために解剖スパチュラを使用してください。 2胚の間にヘラを置き、ゆっくりと腹腔の外胚チェーンを引っ張る。あなたの指で胚チェーンを引き出すことができる。
*これ以降、滅菌PBSで胚が水分を保つ* - 加熱パッドで母を保つ、解剖顕微鏡、マッサージ網膜が上を向くように胚の下に彼女を置く。私はそれが簡単に胚を電気穿孔したかを追跡すること、どちらかの最も内側または外側胚から始めることをお勧めします。
- あなたの利き手でマイクロピペットを取り、もう片方の手で胚を安定化させる。マイクロピペット、ピアス子宮壁と羊膜嚢を介して網膜と。マイクロピペットの鋭さに応じて、それが子宮壁を貫通する圧力のかなりの量がかかることがありますが、一度を通じて、マイクロピペットは、胚と理想的に網膜を入力します。それが胚に入るとマイクロピペットの深さを制御して測定することは困難です。それは羊水と胎児の死亡の漏れ、その結果、入り口の穴を大きくしないようにするために細胞膜を貫通した後にマイクロピペットの移動量を最小限に抑える。これは、出血と胎児の死亡につながるように、子宮壁の貫通血管を避けてください。
- 一度マイクロピペットは、網膜に入ったことを確信していると、網膜にDNA溶液を追放する準備が整いました。ゆっくりプランジャーを押し下げると同時に、マイクロピペットを撤回する、マイクロピペットはしばしば網膜に深く浸透するようにDNAは、マイクロピペットのパスを通して注入されることを保証する。あなたが網膜内にある場合、外側の網膜層と網膜色素上皮（RPE）の間に網膜外の空間に0.5μlのを（マイクロピペットで1μlの目盛りで測定することができます）追放する。あなたは羊水（ 図1）に網膜やリークを記入する緑色色素を観察する必要があります。
- エレクトロポレーションのパドルは、手術中にPBSを充填したシャーレに維持する必要があります。ゆっくりと注入眼と同じ側の正（+）パドルで胚の頭部の両側にパドルを配置。ヘッドを安定させるために圧力の適度な量を適用するが、これは胚の死で羊膜嚢とその結果をポップアップ表示されますと、あまりにもハード押さないでください。電極が所定の位置にある場合、60 Hzの周波数で5 40 V、50 msの矩形パルスを実現。母親が現在の皮膚や筋肉に脱出のためにけいれんするのは珍しいことではない。
- それぞれの胚に注入し、エレクトロポするための手順7-9を繰り返します。私は通常、DNAの量は、胚の数、母の状態、および麻酔下での時間の量に応じて、母ごとに4月8日胚のエレクトロ。また、複数の胚を注入することができますし、エレクトロポレーション、として別々にそれぞれの胚を注入し、electroporatingに反対した。
- 胚をelectroporatingした後、腹腔内に戻す胚のチェーンを交換するために鉗子やヘラを使用してください。腹腔内に抗生物質 - 抗真菌液〜2mlを注ぐ。
- 切開の前方部分でダブルノットで始まる、腹膜を縫合し、切開の後方部分に、単純な連続縫合パターンを続行するために止血剤とピンセットを使用してください。縫合とトリム過剰縫合をオフ結びつける最後のループを使用してください。
- 切開を閉じて主食に、腹膜から皮膚を分離するように注意して、鈍鉗子で切開の前方部分で皮膚を持ち上げる。皮膚の周りにホッチキスの歯を配置し、ステープラーを押し下げる。切開は、通常5月7日ステープルを必要と後端に閉じステープル続ける。アルコール綿でステープルの周り傷を拭いてください。
- 母は、加熱パッド（通常は彼女は目覚めさせるために15から90分の間）に回復すると彼女はロールオーバーを開始すると、上に新しいケージ腹部側で彼女を置いてみましょう。
- 不快感が継続していれば痛みや不快感を最小限に抑えるために、母親は、起床時のブプレノルフィン（0.05〜0.1 mg / kg体重、皮下）を受信し、後の時点で。必要に応じて脱水を防ぐために、夕方と翌日の場合は、再度皮下（sc）1.0mlの生理食塩水で〜2-4時間後に手術を母親を注入し、そして。 24時間後に手術、母親は正常な動作を取り戻す必要があり、飲んで、定期的に食べること。
パート2B：E18.5におけるエレクトロポレーション網膜の子宮内網膜エレクトロ検索で
- 胚あたり〜5 mlを作り、PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を準備する。 Perfusionsは重力ベースの輸液システムまたはシリンジポンプで行うことができます。 （あるいは、E18.5ヘッドは単に4％PFAで一晩浸漬することができます。）
- と母親を注入する麻酔薬0.2mlのは、IPを混在させると、彼女は麻酔下で完全であることを確認してください。腹腔および子宮角を露出するステープルの下に皮膚や腹膜をカットするはさみを使用してください。
- エレクトロポレーション胚を取り外し、腹側をピン。心臓を露出させる胸郭の腹部皮膚、腹膜、横隔膜と横方向の部分をカットスルー。ピアースは蝶の針で左心室は、血流のセットアップに取り付けられ、そしてmicroscissorsと右心房をカット。灌流を開始し、PFAが〜60秒間流れるように、血液は右心房を終了する必要がありますし、灌流が成功した場合、胚が蒼白になるはず。胚の首を切ると15 mlコニカルバイアルに4％PFAで頭を収集する。すべてのエレクトロ胚に対して、この手順を繰り返します。数日間PBSで洗浄後、4℃で一晩4％PFA ° Cで頭を保持し、。すべての胚が回収されている頸椎脱臼を経由して母を安楽死させる。
網膜の削除
- PBSの洗浄の後、網膜を上に向けて解剖皿に頭を固定し、PBSに浸す。 RPEを明らかにするために網膜の周りからお肌を取り外します。 26G1 / 2針を使用して、穿刺レンズ- RPE接合における腹側網膜。この穴にmicroscissorsの一方の端を挿入し、視神経乳頭に腹側網膜を介して垂直切開を行います。あなたがそれを削除するときにこれが東洋に網膜を使用できるようになります。
- 細かい点鉗子でRPEを削除します。 one鉗子による腹部切開でRPEを取得し、具体的にRPEがしっかりと接続されてRPE -レンズの接合部で、離れて網膜からRPE剥離するために他の鉗子を使用してください。 RPEを除去した後、微細な鉗子でレンズをつかんで、レンズを取り外すまでと引き離します。網膜から視神経頭とピンチの周りに鉗子を配置することにより、網膜を削除します。網膜がどのヘッドから来たを追跡する、ウェルのPBS -埋めに網膜を転送します。
- 対側網膜4-5の手順を繰り返し、そして他の全てのエレクトロポレーション胚のために。非注入網膜は、免疫染色のコントロールとして機能します。
- GFP +細胞（緑網膜）のためのすべての網膜をスキャンする蛍光解剖顕微鏡を使用してください。すべてのGFP +網膜の場合は、エレクトロポレーションは、この胚に成功し、これらの網膜と対応する脳（視覚システムを持つ無傷の）さらなる分析（すなわち、切片と免疫染色）（ 図1）のために処理することができます。
パート3a：in vitroでの E14.5マウス網膜にDNAを注入し、electroporating エクスビボ網膜エレクトロ
- 麻酔薬の混合液0.2 mlでE13.5 - E14.5段階の母親を麻酔し、彼女は麻酔下で完全であることを確認してください。胚を露出する皮膚と腹腔を通してカットするはさみを使用してください。鉗子で胚チェーンを持ち上げ、完全に母親から全体胚チェーンを削除するには、結合組織を介してカット。氷の上にDMEM/F12でシャーレに胚チェーンを置きます。頸椎脱臼を経由して母を安楽死させる。
- microscissorsと全体の子宮の壁を通ってカット。その後、胎盤から羊膜嚢とピンチから各胚を削除するにはピンセットを使用してください。それぞれの胚を刎ねると氷の上にDMEM/F12で別のシャーレにヘッドを収集する。
- 口のピペットまたはプランジャーのピペットを使用して、DNA溶液の所望の量（パート1を参照）でマイクロピペットを埋める。
- このプロトコルでは、DNAは末梢背側網膜に注入されます。一つは、DNAの注射部位と電極パドルの位置を調整することによって、他の網膜の地域をターゲットにすることができます。
- PBSで解剖皿につの頭を転送し、頭部背側をピン。網膜の上に皮膚を除去するために鉗子を使用してください。
- マイクロピペットを保持〜10 °の水平位置（背側網膜の曲率に実質的に平行）から、その先端はRPEと外側の網膜の層の間にあることがRPEを通してマイクロピペットを押してください。この空間に〜0.1から0.4μlのDNA溶液を排出する、緑色の液体は、全体の空間を充填し、RPEの穴から漏れて観測する必要があります。対側網膜のための注射を繰り返します。
- 慎重が、すぐに頭の腹側に正（+）パドルで、頭の周りにピンと（PBSに浸漬頭部を保つ）場所電極パドルを削除します。 4 40 - V、60 Hzで50 msのパルスを提供し、氷（ 図2）でDMEM/F12で皿に戻って頭を置きます。
- すべてのヘッド用とすべてのDNA溶液5-7の手順を繰り返します。エレクトロポレーションを完了した後、4ウェルディッシュに酸素SFM溶液を〜1.5 mlを加えると氷（よくそれぞれ異なるDNA溶液は注入用）を続ける。
- one網膜を上に向けて、DMEM/F12と解剖皿につのヘッドを転送する。腹側網膜（または、標的領域と反対側）に、ピンチに微細な鉗子を使用してくださいとRPEの穴を開ける。特にレンズ、網膜の接合部で、離れて網膜からRPEピールするために、この穴を通して鉗子の一端を挿入します。これは網膜のインキュベーション中に自身に崩壊してしまうので、網膜を切ったり、損傷しないでください。 RPEを除去した後、網膜のベース（レンズはそのまま残しておく）で視神経をつまんで網膜を飛び出すために鉗子を使用してください。酸素SFMに網膜を転送します。頭を裏返し、反対側の眼のために繰り返す。
- すべてのエレクトロポレーションヘッドの手順9を完了します。 40〜48時間、37℃で酸素SFMで網膜をインキュベートする。
パート3b：GFP の ex vivoでの網膜エレクトロの収穫とメッキ+網膜片（2日後にエレクトロポレーション）
- DMEM/F12でペトリ皿の蓋に酸素SFMの1つのウェルからすべての網膜を転送します。 one網膜を選択して、網膜のGFP +（緑）の部分を可視化する蛍光解剖スコープを使用してください。
- microscalpelと鉗子を使用して、細かく分析し、唯一のGFP +チャンク網膜のが残っているように、網膜の非GFP +の部分を捨てる。継続的に特にGFP +網膜を選択するために解剖を通して蛍光灯と通常光の切り替えに便利です。 DMEM/F12でよくするためにGFP +網膜を転送します。
- よくいずれかから、すべての網膜について、手順2を繰り返します。それぞれのDNAの状態（それぞれ別のウェル）の場合は、新しいペトリ皿とDMEM/F12培地を使用してください。
- これらのGFP +網膜は今メッキのための小さな網膜の外植片に解剖されている必要があります。解剖範囲の下、microscalpelと小さな片にGFP +網膜の大部分をカット。外植片は長方形でなければ、長さと幅の〜200から300程度。 DMEM/F12でうまく内のすべての外植片を収集する。 One GFP +網膜の塊が〜40から10 GFP +組織のサイズに応じて網膜の外植片を生成する必要があります。すべてのGFP +収穫された網膜の領域ごとにこの手順を繰り返します。
- すべてのGFP +網膜外植片を調製した後、SFMの250μlを追加する+ 0.4％のメチルセルロースをラミニンコート培養皿に（パート1参照）。（4℃で保管）転送4月8日GFP +片培養皿へと緩やかに多角形に植片を配置するために鉗子を使用し、中央と皿の端の中間に位置する植付。
- 外植片のどの側面を決定するRGC層です。時にはRPE結晶は反対側がRGC層であることを示し、外側の網膜層に接続されたまま。さらに、RGC側は通常、適切な植向きに役立てることができるいくつかの細胞の破片を持っています。
- ダウンRGC層と、それはガラスのカバースリップに付着するように、しっかりと外植片の中央を抑制するために鉗子を使用する。鉗子から外植片にくぼみが表示されることがありますが、これは正常です。
- 培養皿上のすべての外植片をめっきした後、37に転送℃のインキュベーターを。網膜軸索は、第1のめっき後の4-6時間を観察しているし、外植片は、数日間健康なままですが、かなりの増殖は、24時間後に発生する可能性があります。外植片を30分と免疫染色（ 図2）を4％PFAで固定し、in vitroアッセイを多数使用することができます。
国境アッセイ
- また、（パート1を参照）国境のアッセイのために準備された皿に4 GFP +外植片を移す。境界線の位置を近似する、皿の中央に縦線で外植片を手配。
- 蛍光解剖顕微鏡下で、プレートは蛍光国境から〜50〜150ミリメートルになるように植。境界の基板に到達するRGC軸索のための十分な時間を可能に、24時間、37℃で料理をインキュベート。外植片を免疫染色（ 図2）に続いて、30分間、4％PFAで固定することができます。
代表的な結果
Discussion
このビデオでは、我々は胚のマウスRGCsへの遺伝子送達のために、両方の子宮内および ex vivoで 、エレクトロポレーション技術を実証している。 子宮内網膜エレクトロ RGCsでの遺伝子発現を操作するためのメカニズムを提供し、 生体内でその軸索突起を可視化する。胚は出生後に生き残るために許可すると、これらのGFP +彼らのターゲットにRGC突起、外側膝状核（LGN）の検査を可能にする。 エクスビボ網膜エレクトロポレーションは、in vitroでのアッセイで使用するために特定の網膜の領域を標的とするより多くの制御機能を提供します。 生体内で 、これらの技術から派生したin vitroの解析で組み合わせることで、それ以外の場合は、通常バックグラウンドでRGCsのサブセットでRGC開発と軸索突起の徹底した特性評価が可能になります。私たちのデモでは、視交叉でのRGC軸索誘導に焦点を当てているが、 子宮および ex vivo網膜エレクトロポレーションの両方は、そのような終了のゾーンにターゲティング遺伝子の発現の効果RGC分化、樹枝状形態、電気生理学的特性、シナプス形成と適切でどのように摂動を研究するための有益かもしれないLGNおよび上丘など。
Acknowledgments
我々は、このプロトコルでのコメントの子宮内および ex vivo網膜エレクトロポレーション技術を、それぞれ、と博士は櫻井でのヘルプは博士リチャードヴァレとBrikhaシュレスタに感謝。この作品は、健康補助金の国立研究所F31 NS051008（超えないこと）、財団原子核Medicale、とヒューマンフロンティアサイエンスプログラム（AR）とR01 EY12736（CM）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle) | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Round tweezer electrodes | Nepa Gene | CUY650-5 or CUY650-7 | |
| Silk Sutures | Henry Schein | 101-2636 | |
| Glass micropipettes with plungers | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
| Antibiototic-antimycotic | Invitrogen | 15240096 | |
| DMEM/F12 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11330057 | |
| Albumin bovine serum | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| ITS supplement | Sigma-Aldrich | I-1884 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
References
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