No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

Summary

Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs) por

Abstract

Da retina e sua neurônio de saída única, a células ganglionares da retina (RGC), constituem um excelente modelo para examinar questões biológicas, tais como diferenciação celular, axônio orientação, organização e formação de sinapses retinotopic [1]. Uma desvantagem é a incapacidade de maneira eficiente e confiável manipular expressão gênica em RGCs in vivo, especialmente nos de outra forma acessível murino caminhos visual. Camundongos transgênicos podem ser usados ​​para manipular a expressão do gene, mas esta abordagem é muitas vezes caro, demorado e pode produzir efeitos colaterais indesejados. No bico, na eletroporação in ovo é usado para manipular a expressão do gene em RGCs para o exame da retina e desenvolvimento RGC. Embora as técnicas de eletroporação semelhantes foram desenvolvidas em filhotes de rato neonatal [2], ratos adultos [3], e retinae embrionárias murinas in vitro [4], nenhuma dessas estratégias permitirá a caracterização completa de desenvolvimento RGC e projeções axônio in vivo. Para este fim, desenvolvemos duas aplicações de eletroporação, uma no útero e os outros ex vivo, especificamente alvo embrionárias murinas RGCs [5, 6].

Com eletroporação in utero da retina, podemos misexpress ou downregulate genes específicos em RGCs e siga suas projeções de axônio através das vias visuais in vivo, permitindo a análise de decisões de orientação em objectivos intermédios, como o quiasma óptico, ou em regiões-alvo, como o núcleo geniculado lateral. Perturbando a expressão de genes em um subconjunto de RGCs em um fundo de outra forma tipo selvagem facilita a compreensão da função dos genes ao longo do percurso da retina. Além disso, temos desenvolvido uma técnica para analisar companheiro crescimento do axônio RGC in vitro. Nós electroporate embrionárias cabeças ex vivo, recolher e incubar toda a retina, em seguida, preparar explantes de retina estes dias mais tarde. Explantes da retina pode ser usado em uma variedade de ensaios in vitro, a fim de examinar a resposta de electroporated axônios RGC aos sinais de orientação ou de outros fatores. Em suma, este conjunto de técnicas aumenta nossa capacidade de misexpress ou downregulate genes em RGCs e deve ajudar muito o desenvolvimento de estudos examinando RGC e projeções axônio.

Protocol

Parte 1: Preparação para in utero e electroporations ex vivo da retina

1. Para ambos no útero e electroporations ex vivo da retina

• Use um extrator de eletrodo para preparar de ponta fina micropipetas e quebrar a ponta (ou a ponta de bisel) para fazer um ponto angular.
• Preparar soluções de concentrações de DNA desejado e adicionar uma pequena quantidade de Fast Green Dye (0,05%) para visualizar as injeções. Eu recomendo 5 mL de solução DNA por mãe na electroporations utero da retina e uma solução de DNA mL per capita embrionárias para electroporations ex vivo da retina. Incluem uma construção expressão GFP (proteína fluorescente ou outras) para visualizar os neurônios transfectadas.
• Esterilizar instrumentos cirúrgicos através de autoclave.
• Preparar a quetamina-xilazina mix anestésico com a seguinte proporção (0,2 ml ~ fazendo para cada mulher grávida): uma relação 1.0:0.2:4.6 volumétrica de 100 mg / cetamina ml: 100 mg / ml de xilazina: solução salina. Anestésicos podem ser usados ​​outros.

2. No útero da retina apenas electroporations

• Ligue a almofada de aquecimento e cobri-lo com uma almofada de fralda.
• Prepare a solução antibiótica-antimicótica (1:100) em tampão fosfato salina (PBS) e quente na almofada de aquecimento. Prepare ~ 2 ml para cada barragem.
• Lugar estéril filtrado PBS em banho de água quente.

3. Para electroporations ex vivo da retina apenas

• Prepare oxigenado meio isento de soro (SFM) para a incubação retina: Bubble 25 ml de DMEM/F12 com 95% de oxigênio / dióxido de carbono de 5% para ≥ 2 horas. Ao meio 25 ml oxigenado, adicionar 0,25 g de albumina sérica bovina (BSA), 250 mL e completar a sua solução de 50 mL penicilina-estreptomicina. Misturar a solução para dissolver a BSA, em seguida, filtrar a solução estéril. Esta solução deve ser feita nova para cada experimento eletroporação.
• Prepare SFM médio metilcelulose + 0,4% para a incubação de explantes da retina: Autoclave 0,20 g de metilcelulose em uma garrafa de 150 ml com um ímã mexa. Prepare 50 ml de SFM (como acima, sem borbulhar) e adicionar ao frasco de metilcelulose autoclavado. Misture esta solução a 4 ° C durante a noite. Filtro estéril essa solução no dia seguinte e armazenar a 4 ° C, essa solução pode ser mantida por ~ 1 mês.
• No dia da coleta do explante de retina (parte 5), preparar pratos para revestimento de explantes da retina: Brasão de vidro placas de cultura de fundo com 250 mL de poli-L-ornitina para ≥ 2 horas a 37 ° C. (Como alternativa, os pratos podem ser revestidos com poli-L-ornitina no dia anterior e incubadas overnight a 4 ° C.) Lavar pratos várias vezes com PBS, em seguida, pratos casaco com 200 mL de 10 mcg / ml em laminina DMEM/F12 para ≥ 2 horas a 37 ° C. Lavar pratos várias vezes com PBS a 37 ° C e deixe em PBS até explantes estão prontos para revestimento.
• Para ensaios de fronteira, pratos casaco com poli-ornitina como acima, então metade casaco do prato com proteína de interesse, juntamente com um marcador fluorescente para visualizar a fronteira (como Alexa Fluor 555 conjugado com BSA, 1:800) por 2 horas a 37 ° C. Lavar com PBS, em seguida, adicione laminina como descrito acima.

2A parte: In utero eletroporação retina injetáveis ​​e electroporating DNA em E14.5 retina de camundongos in vivo

1. Administrar 0,15 ml do anestésico intraperitoneal mix (ip) em uma represa E13.5-E14.5 palco. Deve demorar 3-7 minutos, até que a mãe chegou a um plano cirúrgico de anestesia. Um rato totalmente anestesiado não deve responder a beliscar da pata traseira.
2. Durante este tempo, corte um pequeno pedaço de parafilme e pipeta ~ 5 ul da solução de DNA para o parafilme. Dobrar um êmbolo (fio de metal) em um ângulo de 90 ° e inseri-lo num micropippette puxado. Utilizando o êmbolo, aspirar a solução de DNA na micropipeta (usando um microscópio de dissecação pode ajudar neste processo).
3. Uma vez que a mãe chegou a um plano cirúrgico de anestesia, use um barbeador elétrico para depilar a ~ 2 polegadas região do abdômen da mãe s, em seguida, coloque o seu lado dorsal para baixo sobre o almofada de aquecimento. Prep a área raspada, limpando com uma compressa embebida em álcool seguido de um bloco de iodo no mínimo duas vezes. Coloque uma gota de pomada oftálmica Vet em cada olho para evitar úlceras de córnea dos olhos, enquanto a mãe está sob anestesia geral.
   
4. Com a pinça, segure a pele e use a tesoura para fazer uma incisão vertical ao longo da linha média (~ 1 polegada de comprimento) através da pele e do músculo do abdômen, expondo o peritônio. Elevador do peritoneu com a pinça e fazer uma incisão semelhante vertical através desta membrana para expor a cavidade abdominal (Figura 1). Em seguida, armar o campo cirúrgico com compressas de gaze para impedir que o conteúdo abdominal de entrar em contato e sendo contaminadas pelos cabelosdo animal.
5. Puxar para trás a pele e peritônio com a pinça e usar a espátula de dissecação para extrair um embrião através da incisão (escolha o embrião mais acessível). Coloque a espátula entre 2 embriões e puxe a cadeia embrionárias para fora da cavidade abdominal. Você pode retirar da cadeia embrionárias com os dedos.
   * A partir deste ponto em diante, manter os embriões hidratados com PBS estéril *
6. Manter a mãe na almofada de aquecimento, colocá-la sob o microscópio de dissecação e massagem um embrião para que a retina está voltado para cima. Eu recomendo começar com um embrião o mais medial ou lateral, tornando mais fácil manter o controle de que os embriões foram electroporated.
7. Pegue a micropipeta em sua mão dominante e estabilizar o embrião com a outra mão. Com a micropipeta, perfurar a retina através da parede uterina e saco amniótico. Dependendo da nitidez da micropipeta, pode levar uma quantidade razoável de pressão para penetrar na parede uterina, mas uma vez que através dos micropipeta entrará no embrião e, idealmente, a retina. Pode ser difícil de controlar e avaliar a profundidade da micropipeta, uma vez que entra no embrião. Minimizar a quantidade de movimento micropipeta uma vez que tenha perfurado a membrana para evitar alargando o buraco de entrada, resultando no vazamento de líquido amniótico e morte do embrião. Evite vasos penetrantes de sangue na parede uterina, pois isso irá resultar em hemorragia e morte do embrião.
8. Uma vez que você está confiante que a micropipeta entrou na retina, você está pronto para expulsar a solução de DNA na retina. Pressione o êmbolo lentamente e, simultaneamente, retirar a micropipeta, garantindo que o DNA é injetado ao longo do caminho da micropipeta, como muitas vezes micropipeta penetra profundamente para a retina. Se você está na retina, expulsar 0,5 mL (pode ser medido pela 1 mL marcas na micropipeta) no espaço extraretinal entre a camada externa da retina e do epitélio pigmentar da retina (EPR). Você deve observar corante verde enchendo a retina e vaza para o líquido amniótico (Figura 1).
9. As pás eletroporação devem ser mantidos em uma placa de Petri PBS-cheia durante a cirurgia. Delicadamente, coloque as pás nas laterais da cabeça do embrião com o paddle (+) positivo no mesmo lado do olho injetado. Aplicar uma quantidade moderada de pressão para estabilizar a cabeça, mas não pressione muito, pois isso irá aparecer o saco amniótico e resultar em morte do embrião. Quando os eletrodos estão em vigor, entregar 5 40-V, 50 pulsos ms quadrados em uma freqüência de 60 Hz. Não é incomum para a mãe a se contorcer devido ao escape de corrente para a pele e os músculos.
10. Repita os passos 7-9 para cada embrião deve ser injetado e electroporated. Eu costumo electroporate 4-8 embriões por mãe, dependendo da quantidade de DNA, o número de embriões, a condição de mãe, ea quantidade de tempo sob anestesia. Alternativamente, vários embriões pode ser injetado e, em seguida electroporated, ao contrário de injetáveis ​​e electroporating cada embrião separadamente.
11. Depois electroporating os embriões, use a pinça e espátula para substituir a cadeia embrionárias de volta para a cavidade abdominal. Despeje ~ 2 ml da solução antibiótica-antimicótica na cavidade abdominal.
12. Use o hemostat e uma pinça para sutura o peritônio, começando com um nó duplo na parte anterior da incisão e continuar com um padrão de sutura simples contínua com a porção posterior da incisão. Use o laço final para amarrar a sutura e sutura cortar o excesso.
13. Para grampear a incisão fechada, levante a pele na porção anterior da incisão com uma pinça sem corte, tendo o cuidado de separar a pele do peritônio. Coloque os dentes do grampeador em torno da pele e pressionar o grampeador. Continue grampeamento a incisão fechada até o fim posterior, que geralmente requer grampos 5-7. Limpe a ferida ao redor do grampos com uma compressa embebida em álcool.
14. Deixe a mãe se recuperar no teclado de aquecimento (geralmente leva entre 15-90 minutos para ela despertar) e quando ela começa a rolar, coloque-a em um lado da gaiola nova abdominal para cima.
15. Para minimizar a dor e desconforto, as mães recebem buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg, sc), ao acordar, e posteriormente durante se o desconforto continua. Para evitar a desidratação, injetar a mãe com 1,0 ml solução salina por via subcutânea (sc) ~ 2-4 horas pós-cirurgia, e novamente se a noite eo dia seguinte, se necessário. 24 horas pós-cirurgia, a mãe deve recuperar o comportamento normal e estar bebendo e comendo regularmente.

2B parte: In utero Retrieval eletroporação da retina de retina em electroporated E18.5

1. Prepare paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS, fazendo ~ 5 ml por embrião. Perfusões pode ser feito com um sistema de infusão ou gravidade baseado em uma bomba de seringa. (Alternativamente, E18.5 cabeças podem simplesmente ser imerso em PFA 4% durante a noite.)
2. Injetar a mãe com0,2 ml de anestésico mix ip e garantir que ela está totalmente sob anestesia. Use uma tesoura para cortar a pele e peritônio sob os grampos para expor a cavidade abdominal e cornos uterinos.
3. Remover um embrião electroporated e pin-lo lado ventral para cima. Cortar as porções abdominal pele, peritônio, diafragma e lateral da caixa torácica para expor o coração. Pierce ventrículo esquerdo com a agulha borboleta ligado à instalação de perfusão, e corte o átrio direito com uma microtesoura. Iniciar a perfusão e permitir PFA a fluir para ~ 60 segundos; sangue deve sair do átrio direito eo embrião deve tornar-se pálida, se a perfusão for bem sucedida. Decapitar o embrião e recolher cabeça em PFA 4% em 15 ml-frasco cônico. Repita esse procedimento para todos os embriões electroporated. Manter a cabeça em PFA 4% durante a noite a 4 ° C, e depois lavar em PBS durante vários dias. Euthanize mãe através de deslocamento cervical, quando todos os embriões são coletados.

Removendo retina

1. Após lavagens PBS, pino a cabeça em um prato com dissecção da retina para cima e mergulhar na PBS. Remover a pele de todo o retina para revelar o RPE. Usando uma agulha 26G1 / 2 punção, a retina ventral na junção da lente RPE. Inserir uma borda de uma microtesoura neste buraco e fazer uma incisão vertical através da retina ventral para o disco óptico. Isto irá permitir-lhe orientar a retina quando você removê-lo.
2. Remover o RPE com multa de ponto fórceps. Agarre o RPE na incisão ventral com uma pinça e utilize uma pinça outros para descascar o RPE longe da retina, especificamente na junção RPE lente, onde o RPE está bem encaixada. Depois de retirar o RPE, segure a lente com uma pinça fina e puxar para cima e para fora para remover o cristalino. Remover retina, colocando uma pinça em torno da cabeça do nervo óptico e beliscar fora retina. Transferência de retina para um PBS-cheia bem, se manter a par dos quais vieram de retina que lidera.
3. Repita os passos 4-5 para a retina contralateral, e para todos os outros embriões electroporated. A retina não injetados serve como um controle para a imunocoloração.
4. Use um microscópio de fluorescência de dissecação para verificar todos os retinae para GFP + células (verde retina). Para todos + GFP retina, o eletroporação foi bem sucedido neste embrião, e estes cérebro e retina correspondente (com o sistema visual intacto) pode ser processado para posterior análise (ou seja, de corte e imunocoloração) (Figura 1).

3a parte: Ex eletroporação in vivo da retina injetáveis ​​e electroporating DNA em E14.5 retinae murino in vitro

1. Anestesiar uma mãe E13.5-E14.5 palco com 0,2 ml da mistura de anestésicos e garantir que ela está totalmente sob anestesia. Use uma tesoura para cortar através da pele e da cavidade abdominal para expor os embriões. Levante cadeia embrionárias com uma pinça e cortar tecido conjuntivo para eliminar totalmente cadeia embrionárias toda da mãe. Coloque cadeia embrionárias em uma placa de Petri com DMEM/F12 no gelo. Euthanize mãe através de deslocamento cervical.
2. Atravessam toda a parede do útero com uma microtesoura. Em seguida, utilize uma pinça para remover cada embrião a partir do saco amniótico e beliscar fora placenta. Decapitar cada embrião e recolher cabeças em outra placa de Petri com DMEM/F12 no gelo.
3. Usando pipeta boca ou pipeta êmbolo, preencha micropipeta com quantidade desejada de solução de DNA (veja Parte 1).
4. Neste protocolo, o DNA será injetado na retina periférica dorsal. Pode-se alvo de outras regiões da retina, ajustando o local da injeção do DNA e do posicionamento das pás eletrodos.
5. Transferência de um prato de cabeça para dissecar com PBS e pino do lado dorsal da cabeça para cima. Use uma pinça para remover a pele acima retina.
6. Segurando a micropipeta ~ 10 ° a partir da posição horizontal (essencialmente paralela à curvatura da retina dorsal), push micropipeta através do RPE, para que a ponta é entre o EPR ea camada retinal exterior. Expulsar ~ 0,1-0,4 mL de solução de DNA para este espaço; líquido verde deve ser observável preencher o espaço inteiro e vazando através de buraco na RPE. Repita de injecção para a retina contralateral.
7. Com cuidado, mas rapidamente remover os pinos e (mantendo a cabeça imersa na PBS) pás lugar eletrodo em torno da cabeça, com a pá positivo (+) no lado ventral da cabeça. Entregar 4 40-V, 50 pulsos ms a 60 Hz, em seguida, coloque a cabeça para trás em um prato com DMEM/F12 no gelo (Figura 2).
   
8. Repita os passos 5-7 para todos os chefes e para todas as soluções de DNA. Após completar electroporations, adicionar 1,5 ml ~ de solução SFM oxigenado para um prato de 4 bem e manter em gelo (um bem para cada solução de DNA diferentes injetado).
9. Transferência de uma cabeça para um prato de dissecação com DMEM/F12, com uma retina voltada para cima. Na retina ventral (ou do lado oposto região de destino), utilize uma pinça fina para pitadae rasgar um buraco no RPE. Insira uma extremidade do fórceps por esse buraco para descascar o RPE longe da retina, especificamente na junção da lente retina. Não cortar ou danificar a retina, porque isso irá causar retina a entrar em colapso sobre si mesmo durante a incubação. Depois de retirar RPE, utilize uma pinça para sair retina pelo nervo óptico beliscar na base da retina (deixe a lente intacta). Transferência de retina para SFM oxigenado. Virar de cabeça e repetir para o olho contralateral.
10. Concluir a etapa 9 para todas as cabeças electroporated. Incubar retina em SFM oxigenada a 37 ° C para 40-48 horas.

3b: Ex vivo colheita eletroporação da retina e chapeamento de GFP + explantes da retina (2 dias após a eletroporação)

1. Transferir todas as retinas de um poço de SFM oxigenada em uma placa de Petri com tampa DMEM/F12. Selecione uma retina e uso do escopo dissecar fluorescente GFP + para visualizar porção (verde) da retina.
2. Usando um microscalpel e fórceps, dissecar e descartar a porção não-GFP + da retina para que apenas um GFP + pedaço de retina permanece. É útil para melhorar continuamente a alternar entre luz fluorescente e regular durante todo o dissecção especificamente para selecionar a GFP + retina. Transferir a GFP + retina a um poço com DMEM/F12.
3. Repita o passo 2 para todos os retina de um bem. Para cada condição de DNA (cada bem diferentes), use uma placa de Petri novo e DMEM/F12 médio.
4. Estes GFP + retinae deve agora ser dissecado em pequenos explantes da retina para revestimento. De acordo com um escopo de dissecação, corte grande pedaço de GFP + retina em explantes menores com um microscalpel. Explantes deve ser retangular, ~ 200-300 mM de comprimento e largura. Colete todos os explantes em um poço com DMEM/F12. Um GFP + pedaço de retina deve produzir GFP ~ 4-10 + explantes da retina dependendo do tamanho do tecido. Repita este passo para todas as regiões GFP + da retina que foram colhidas.
5. Depois de preparar toda a GFP + explantes da retina, juntar 250 mL de SFM + metilcelulose 0,4% (mantida a 4 ° C) a pratos laminina revestido cultura (ver parte 1). Transferência 4-8 GFP + explantes para a placa de cultura e usar a pinça para gentilmente organizar os explantes em um polígono, com explantes localizado a meio caminho entre o centro ea borda do prato.
6. Determinar qual o lado do explante é a camada RGC. Às vezes, cristais RPE permanecer solidários com a camada externa da retina, indicando que o lado oposto é a camada RGC. Além disso, o lado RGC geralmente tem alguns restos celulares que podem auxiliar na orientação do explante adequado.
7. Com a camada RGC para baixo, utilize uma pinça para pressionar firmemente o centro do explante para que ele irá aderir à lamínula de vidro. Um recuo no explante do fórceps pode ser visível, o que é normal.
8. Após o plaqueamento todos os explantes em uma placa de cultura, a transferência para a 37 ° C incubadora. Axônios da retina são observadas pela primeira vez de 4-6 horas após o plaqueamento e explantes permanecem saudáveis ​​por vários dias, mas pode ocorrer supercrescimento significativa após 24 horas. Explantes podem ser usados ​​para inúmeros ensaios in vitro, fixada com PFA 4% por 30 minutos e imunocoradas (Figura 2).

Ensaio de fronteira

8. Alternativamente, a transferência de quatro GFP + explantes para um prato que foi preparado para o ensaio de fronteira (ver parte 1). Organizar os explantes em uma linha vertical no centro do prato, aproximando a localização da fronteira.
9. Sob um microscópio de fluorescência de dissecação da placa, os explantes de modo que sejam ~ 50-150 milímetros da fronteira fluorescente. Incubar pratos a 37 ° C por 24 horas, permitindo tempo suficiente para atingir os axônios RGC substrato fronteira. Explantes pode ser fixado em PFA 4% por 30 minutos, seguido por imunocoloração (Figura 2).

Resultados representativos

Discussion

Neste vídeo, demonstramos técnicas de eletroporação, tanto no útero e ex vivo, para entrega de genes em embriões murinos RGCs. In utero eletroporação retinal fornece um mecanismo para a manipulação de expressão gênica em RGCs e visualizar suas projeções de axônio in vivo. Permitindo que os embriões de sobreviver após o nascimento permite a avaliação desses GFP + projeções RGC em seu alvo, o núcleo geniculado lateral (LGN). Ex eletroporação in vivo da retina fornece uma capacidade mais controlada para atingir regiões específicas da retina para uso com ensaios in vitro. Combinando in vivo e in vitro análises derivadas dessas técnicas permite a caracterização completa de desenvolvimento RGC e projeções axônio em um subconjunto de RGCs em um fundo de outra maneira normal. Enquanto a nossa manifestação se concentra em RGC orientação axônio no quiasma óptico, tanto no útero e electroporations ex vivo da retina pode ser benéfico para estudar como perturbações no gene de diferenciação efeito expressão RGC, morfologia dendrítica, propriedades eletrofisiológicas, formação de sinapses e adequada focalização em zonas de rescisão como o LGN e colículo superior.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)	Harvard Apparatus	450052
Round tweezer electrodes	Nepa Gene	CUY650-5 or CUY650-7
Silk Sutures	Henry Schein	101-2636
Glass micropipettes with plungers	Drummond Scientific	5-000-1001-X10
Antibiototic-antimycotic	Invitrogen	15240096
DMEM/F12 medium	GIBCO, by Life Technologies	11330057
Albumin bovine serum	Sigma-Aldrich	A8806-5G
ITS supplement	Sigma-Aldrich	I-1884
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015