В утробе матери и исключая виво Электропорация для экспрессии генов у мыши ганглиозных клеток сетчатки

Summary

Здесь мы приведем два способа манипулирования экспрессии генов в мышиные клетки сетчатки ганглия (РГК) по

Abstract

Сетчатки и ее единственного нейрона выход, ганглиозных клеток сетчатки (РГК), составляют отличную модель, в которой для изучения биологических вопросов, таких как дифференцировка клеток, аксонов руководство, retinotopic организации и формирование синапса [1]. Одним из недостатков является неспособность эффективно и надежно управлять экспрессии генов в РГК в естественных условиях, особенно в противном случае доступны мышиной зрительных путей. Трансгенные мыши могут быть использованы для манипулирования экспрессии генов, однако этот подход часто является дорогостоящим, требует много времени, и может привести к нежелательным побочным эффектам. В куриных, в ово электропорации используется для манипулирования экспрессии генов в РГК для изучения сетчатки и РГК развития. Хотя подобные методы электропорации были разработаны в неонатальном щенков мыши [2], у взрослых крыс [3], и эмбриональных мышиных сетчатки в пробирке [4], ни одна из этих стратегий позволит полной характеристики РГК развития и аксонов прогнозы в естественных условиях. С этой целью мы разработали два приложения электропорации, один в утробе матери и других естественных отл, непосредственно для мышиных эмбриональных РГК [5, 6].

С внутриутробно сетчатки электропорации, мы можем misexpress или подавлять определенные гены в РГК и следовать их проекции аксонов через зрительные пути в естественных условиях, что позволяет рассмотрения руководством решений на промежуточные цели, например, зрительных нервов, или в целевых регионах, таких как латерального коленчатого тела. Пошевелив экспрессии генов в подмножество РГК в противном случае дикого типа фона облегчает понимание функции генов всей сетчатки пути. Кроме того, мы разработали спутник техники для анализа РГК рост аксонов в пробирке. Мы electroporate эмбриональных глав бывших естественных условиях, собирать и инкубировать целом сетчатке, а затем подготовить эксплантов из этих сетчатки через несколько дней. Сетчатки эксплантов может быть использован в разнообразных в пробирке тесты, чтобы выяснить реакцию электропорации РГК аксоны руководством сигналы или других факторов. В общем, это набор методов, усиливает нашу способность misexpress или подавлять гены в РГК и должны очень помочь результаты исследований РГК развития и аксонов прогнозы.

Protocol

Часть 1: Настройка для внутриутробно и бывших естественных сетчатки electroporations

1. Для обоих в утробе матери и исключая виво сетчатки electroporations

• Использование электродов съемник подготовить с острым концом микропипетки и сломать наконечник (или конические наконечник), чтобы угловые точки.
• Подготовка растворов ДНК с желаемой концентрации и добавляют небольшое количество Быстрый Зеленая краска (0,05%) для визуализации инъекций. Я рекомендую 5 мкл раствора ДНК на матери внутриутробно сетчатки electroporations и 1 мкл раствора ДНК на эмбриональной головы для бывших естественных сетчатки electroporations. Включите построить GFP выражение (или другой флуоресцентный белок) для визуализации трансфицированных нейронов.
• Стерилизовать хирургических инструментов с помощью автоклавов.
• Подготовка кетамин-ксилазина анестезии смесь при следующем соотношении (изготовление ~ 0,2 мл для каждой беременной женщины): 1.0:0.2:4.6 объемном соотношении 100 мкг / мл кетамина: 100 мкг / мл ксилазина: физиологический раствор. Другие анестетики могут быть использованы.

2. Для внутриутробно сетчатки electroporations только

• Включите грелку и покрыть ее пеленки площадку.
• Подготовка антибиотикам противогрибковым раствором (1:100) в фосфатном буфере физиологический раствор (PBS) и теплая на грелку. Подготовка ~ 2 мл для каждой плотины.
• Место стерильной фильтрацией PBS в теплую ванну водой.

3. Для бывших естественных сетчатки electroporations только

• Подготовка кислородом бессывороточной среде (ССМ) для сетчатки инкубации: Bubble 25 мл DMEM/F12 с 95% кислорода / 5% углекислого газа в течение ≥ 2 часа. Для 25 мл кислородом среде, добавить 0,25 г бычьего сывороточного альбумина (БСА), 250 мкл ЕГО дополнять и 50 мкл пенициллин-стрептомицина решение. Смешайте решение о роспуске BSA, то стерильный фильтр решение. Это решение должно быть свежей для каждого электропорации эксперимента.
• Подготовка УЛ + 0,4% метилцеллюлозы средой для сетчатки инкубации эксплантов: Автоклав 0,20 г метилцеллюлозы в 150 мл флакон с размешать магнита. Подготовка 50 мл SFM (как указано выше, без восходящей) и добавить в автоклаве бутылку метилцеллюлозы. Смешайте это решение при 4 ° С в течение ночи. Стерильный фильтр это решение на следующий день и хранить при 4 ° С, это решение может храниться в течение ~ 1 месяц.
• В день уборки сетчатки эксплантов (часть 5), готовить блюда для сетчатки покрытие эксплантов: Пальто стеклянная посуда нижней культуры с 250 мкл поли-L-орнитина в течение ≥ 2 часа при температуре 37 ° C. (В качестве альтернативы, блюда могут быть покрыты с поли-L-орнитин предыдущего дня и инкубировали в течение ночи при 4 ° С), мыть посуду несколько раз PBS, затем слой блюда с 200 мкл 10 мкг / мл ламинин в DMEM/F12 в течение ≥ 2 часа при температуре 37 ° C. Мыть посуду несколько раз PBS при 37 ° С и оставляют на PBS до эксплантов готовы к обшивке.
• За границу анализы, пальто блюда с поли-орнитин, что и выше, то пальто половине блюдо с белок вместе с флуоресцентного маркера для визуализации границы (например, Alexa Fluor 555 конъюгированных с BSA, 1:800) в течение 2 часов при 37 ° C. Промыть PBS, затем добавить ламинин как описано выше.

Части 2А: Внутриутробное сетчатки электропорации инъекционных и electroporating ДНК в мышиных E14.5 сетчатки в естественных условиях

1. Inject 0,15 мл внутрибрюшинно анестезии смеси (ф) в E13.5-E14.5 этапе плотины. Это должно занять 3-7 минуты, пока мать достигла хирургических плоскости анестезии. Полностью под наркозом мышь не должна реагировать на ущемление hindpaw.
2. За это время, вырезать небольшой кусочек парафильмом и пипетки ~ 5 мкл раствора ДНК на парафильмом. Бенд поршень (металлический провод) на 90 ° градусов и вставить его в потянул micropippette. Использование поршень, аспирации раствора ДНК в микропипетки (с использованием рассекает микроскоп может помочь этому процессу).
3. Как только мать достигла хирургической анестезии плоскости, используйте электрическую бритву, чтобы побрить ~ 2 дюйма области живота матери с, затем поместите ее спинной стороной вниз на грелку. Подготовка бритой области, протирая спиртом площадку затем йодом площадку как минимум в два раза. Место падения глазной мази Vet на каждый глаз, чтобы предотвратить изъязвление роговицы глаза, а мать находится под общим наркозом.
   
4. С щипцами возьмитесь за кожей и с помощью ножниц, чтобы сделать вертикальный разрез по средней линии (~ 1 мм в длину), через кожу и мышцы живота, обнажив брюшины. Поднимите брюшины с пинцетом и сделать аналогичный вертикальный разрез через эту мембрану, чтобы разоблачить брюшной полости (рис. 1). Потом портьера операционного поля с марлевой прокладки для предотвращения содержимого брюшной полости в контакт и быть загрязненные волосыживотного.
5. Оттянуть кожу и брюшину с пинцетом и использовать рассекает шпателя извлечь эмбрион через разрез (выберите наиболее доступных эмбриона). Место шпателем от 2 эмбрионов и осторожно потяните эмбриональных цепь из брюшной полости. Вы можете вытащить эмбриональной цепи пальцами.
   * Начиная с этого момента, держать эмбрионов гидратированных стерильной PBS *
6. Держите мать на грелку, положите ее под микроскопом и рассекает массаж эмбриона, так что сетчатка вверх. Я рекомендую начинать с любой самой медиальной или латеральной эмбриона, что делает его легче отслеживать, какие эмбрионы были электропорации.
7. Возьмите микропипетки в вашей доминирующей руки и стабилизировать эмбриона другой рукой. С микропипетки, прокалывают сетчатки через стенку матки и околоплодных мешка. В зависимости от остроты микропипетки, это может занять изрядное количество давлением проникают в стенку матки, но как только на основе, микропипетки войдет эмбриона и, в идеале сетчатки. Это может быть трудно контролировать и оценить глубину микропипетки поскольку это входит в эмбрион. Минимизировать количество микропипетки движение, как только он пронзил мембрана, которая препятствует расширению входного отверстия, в результате утечки околоплодных вод и зародыш смерти. Избегайте пирсинг кровеносных сосудов в стенке матки, так как это может привести к кровотечению и смерти эмбриона.
8. После того как вы уверены, что микропипетки вступил сетчатки, вы готовы изгнать раствора ДНК в сетчатке. Медленно нажмите поршень и одновременно снять микропипетки, гарантируя, что ДНК вводят по всему пути микропипетки, как микропипетки часто глубоко проникает к сетчатке. Если вы находитесь в сетчатке, изгнать 0,5 мкл (может быть измерен 1 мкл делений на микропипетки) в extraretinal пространство между внешней сетчатки слоя и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). Вы должны наблюдать зеленого красителя заполнения сетчатки и просачивается в амниотической жидкости (рис. 1).
9. Электропорации весла должны храниться в PBS заполненные чашке Петри во время операции. Аккуратно лопастями по бокам головы эмбриона с положительной (+) веслом на той же стороне, вводят глаз. Применяют умеренное количество давление для стабилизации головы, но не нажимайте слишком сильно, поскольку это будет поп амниотической полости и привести к смерти эмбриона. Когда электроды в месте, доставить пять 40-В, 50 мс прямоугольные импульсы с частотой 60 Гц. Это не является необычным для матери дергаться из-за тока бежать в коже и мышцах.
10. Повторите шаги 7-9 для каждого эмбриона, который будет введен и электропорации. Я обычно electroporate 4-8 эмбрионов на одну женщину, в зависимости от количества ДНК, количество эмбрионов, состояние матери, и количество времени, под наркозом. Кроме того, несколько эмбрионов может быть введен, а затем электропорации, в отличие от инъекций и electroporating каждого эмбриона отдельно.
11. После electroporating эмбрионы, использование щипцов и шпатель для замены эмбриональной цепи обратно в брюшную полость. Налейте ~ 2 мл антибиотикам противогрибковым раствора в брюшной полости.
12. Использование кровоостанавливающего и щипцы для шва брюшины, начиная с двойным узлом на передней части разреза и приступить к простым непрерывным швом узор на задней части разреза. Используйте окончательного цикла галстук и аккуратный шов превышение шва.
13. Для основной разрез закрыты, поднимите кожу в передней части разреза с тупым пинцетом, осторожно отделить кожу от брюшины. Место зубы степлер вокруг кожи и угнетают степлера. Продолжить сшивание разрез закрыт для заднему концу, который обычно требует 5-7 скрепок. Протрите намотанной скобы с алкоголем площадку.
14. Позвольте матери восстановиться на грелку (как правило, занимает от 15-90 минут для нее, чтобы пробудить), и когда она начинает переворачиваться, место ее в новую клетку брюшной стороной вверх.
15. Чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт, матери получают бупренорфин (0,05-0,1 мг / кг, подкожно) после пробуждения, и в более поздние моменты времени, если дискомфорт не проходит. Чтобы избежать обезвоживания, вводить мать с 1,0 мл физиологического раствора подкожно (п) ~ 2-4 часов после операции, и снова, если вечер и следующий день, если необходимо. 24 часов после операции, мама должна восстановить нормальное поведение и быть питья и еды на регулярной основе.

Часть 2В: Внутриутробное сетчатки поиска электропорации электропорации сетчатки на E18.5

1. Подготовка 4% параформальдегида (PFA) в PBS, что делает ~ 5 мл на эмбрион. Перфузии можно сделать с помощью гравитации система на основе инфузии или шприцевой насос. (В качестве альтернативы E18.5 головки могут быть просто погружен в 4% PFA в течение ночи.)
2. Inject матери0,2 мл анестетика сочетание IP и убедитесь, что она полностью находится под наркозом. Используйте ножницы, чтобы вырезать кожу и брюшину под скобы подвергать брюшной полости и рогов матки.
3. Удалить электропорации эмбриона и пин-код его вентральной стороной вверх. Избавьтесь от брюшной части кожи, брюшины, диафрагмы и боковой грудной клетки подвергать сердце. Пирс левого желудочка с бабочкой игла прилагается к перфузионной установке, а также сокращение правого предсердия с microscissors. Начало перфузии и позволяют PFA течь в течение ~ 60 секунд; кровь должна выйти правое предсердие и эмбрион должен стать бледным, если перфузия успешным. Обезглавьте эмбриона и собирать головы в 4% PFA в 15-мл конические пробирки. Повторите эту процедуру для всех электропорации эмбрионов. Держите голову в 4% PFA в течение ночи при 4 ° С, а затем промыть в PBS в течение нескольких дней. Эвтаназии матери через шейки дислокации, когда все эмбрионы были собраны.

Удаление сетчатки

1. После мойки PBS, контактный голову рассечение блюдо с сетчатки вверх и опустите в PBS. Удалить кожу со всего сетчатку выявить ППД. Использование 26G1 / 2 иглы, прокол брюшной сетчатки в объектив-НПП перехода. Вставьте один край microscissors в это отверстие и сделать вертикальный разрез через брюшную сетчатки диска зрительного нерва. Это позволит вам сориентироваться сетчатки, когда вы удалите его.
2. Удалить РПЭ с тонкой точке щипцами. Захватите НПП на вентральной разрез с одним пинцетом и использовать другие щипцы чистить НПП от сетчатки, особенно на РПЭ-объектив перекрестке, где НПП прочно держится в гнезде. После удаления НПП, держитесь объектив с прекрасной щипцы и тянуть вверх и в сторону, чтобы удалить линзы. Удалить сетчатки путем размещения щипцы вокруг зрительного нерва и сетчатки отщипывать. Передача сетчатки PBS заполненные хорошо, отслеживая которые пришли из сетчатки, который возглавляет.
3. Повторите шаги 4-5 для контралатеральной сетчатки, и для всех других электропорации эмбрионов. Неинъекционные сетчатки служит для контроля иммунной окраски.
4. Использование флуоресцентного микроскопа рассекает для сканирования всех сетчатки для GFP + клеток (зеленые сетчатки). Для всех GFP + сетчатки, электропорации был успешным в этом эмбрион, и эти сетчатки и соответствующие мозга (с визуальным систему без изменений) могут быть обработаны для дальнейшего анализа (например, секционирования и иммунной) (рис. 1).

Часть 3а: Ex естественных сетчатки электропорации инъекционных и electroporating ДНК в мышиных E14.5 сетчатки в пробирке

1. Обезболить E13.5-E14.5 этапе мать с 0,2 мл смеси анестетика и убедитесь, что она полностью находится под наркозом. Используйте ножницы, чтобы вырезать через кожу и брюшной полости подвергать эмбрионов. Поднимите эмбриональных цепь щипцами и прорезать соединительной ткани, чтобы полностью удалить весь эмбриональный цепочки от матери. Место эмбриональной цепи в чашки Петри с DMEM/F12 на льду. Эвтаназии матери через шейки дислокации.
2. Избавьтесь от всей стенки матки с microscissors. Затем с помощью щипцов для удаления каждого эмбриона из амниотической полости и отщипывать плаценты. Обезглавьте каждого эмбриона и собирать головы в другую чашку Петри с DMEM/F12 на льду.
3. Использование пипетки ртом или поршень пипетки, заполните микропипетки с желаемым количеством раствора ДНК (см. часть 1).
4. В этом протоколе, ДНК будет выведена на периферические спинной сетчатки. Можно целевой других регионах сетчатки, регулируя сайт ДНК впрыска и позиционирование электрода весла.
5. Передача одной головы на вскрытии блюдо с PBS и пин-код голову спинной стороной вверх. Используйте пинцет, чтобы удалить кожу над сетчатки.
6. Холдинг микропипетки ~ 10 ° от горизонтального положения (по существу, параллельно кривизна спины сетчатки), нажмите микропипетки через ПЭС так, чтобы кончик между ПЭС и внешний слой сетчатки. Выгнать ~ 0,1-0,4 мкл раствора ДНК в этом пространстве; зеленой жидкости должны быть видны заполнения всего пространства и утечки через отверстие в ППД. Повторите инъекций для контралатеральной сетчатки.
7. Аккуратно, но быстро удалите булавки и (держа голову погружен в PBS) место электрода весла вокруг головы, с положительным (+) веслом на брюшной стороне головы. Доставить 4 40-В, 50 мс импульсы с частотой 60 Гц, затем поместить голову в тарелку с DMEM/F12 на льду (рис. 2).
   
8. Повторите шаги 5-7 для всех руководителей и для всех растворов ДНК. После завершения electroporations, добавьте ~ 1,5 мл кислорода решение SFM для 4-а блюдо и держать на льду (одна скважина для каждого отдельного решения ДНК вводят).
9. Передача одной головы на вскрытии блюдо с DMEM/F12, с одной сетчатки вверх. На вентральной сетчатки (или стороне, противоположной области мишени), использование тонких щипцов ущипнутьи слезоточивый дыры в ППД. Вставьте один конец щипцами через это отверстие в кожуре НПП от сетчатки, особенно на объектив-сетчатки перехода. Ничего не вырезано или повреждение сетчатки глаза, потому что это приведет к краху сетчатки на себя во время инкубации. После удаления НПП, использование щипцов, чтобы вытолкнуть сетчатки, зажимая зрительного нерва в основании сетчатки (оставить нетронутыми линзы). Передача сетчатки кислородом для устойчивого управления лесами. Отразить над головой и повторите для контралатерального глаза.
10. Полный шаг 9 для всех электропорации головы. Инкубируйте сетчатки кислородом SFM при 37 ° С в течение 40-48 часов.

Часть 3б: Ex естественных сетчатки Сбор электропорации и обшивки GFP + сетчатки эксплантов (2 дня после электропорации)

1. Перенесите все сетчатки из одной ямы кислородом SFM в крышку чашки Петри с DMEM/F12. Выберите один сетчатки и использовать люминесцентные рассекает возможности для визуализации GFP + (зеленый) части сетчатки.
2. Использование microscalpel и щипцы, препарировать и выбросить не-GFP + часть сетчатки, так что только GFP + кусок сетчатки остается. Полезно постоянно переключаться между люминесцентными и регулярные свет по всему рассечение специально выбрать GFP + сетчатки. Передача GFP + сетчатки хорошо с DMEM/F12.
3. Повторите шаг 2 для всех сетчатки из одной ямы. Для каждого ДНК условие (каждого отдельного хорошо), использование новой чашки Петри и DMEM/F12 среды.
4. Эти GFP + сетчатки теперь должен быть разбит на более мелкие сетчатки эксплантов для металлизации. Под рассекает сферу, разрезать большой кусок сетчатки GFP + на более мелкие эксплантов с microscalpel. Эксплантов должна быть прямоугольной, ~ 200-300 мкм в длину и ширину. Соберите все эксплантов в хорошо DMEM/F12. Один GFP + кусок сетчатки должны производить ~ 4-10 GFP + сетчатки эксплантов в зависимости от ткани размером. Повторите этот шаг для всех GFP + сетчатки регионов, которые были собраны.
5. После подготовки всех GFP + сетчатки эксплантов, добавьте 250 мкл УЛ + 0,4% метилцеллюлозы (хранить при температуре 4 ° С) до ламинин покрытием блюда культуры (см. часть 1). Передача 4-8 GFP + эксплантов в культуру блюдо и использовать пинцет, чтобы аккуратно организовать эксплантов в многоугольник, с эксплантов находится на полпути между центром и краем блюда.
6. Определите, какая сторона является эксплантов РГК слоя. Иногда НПП кристаллы остаются прикрепленными к внешнему слою сетчатки, указывая, что противоположная сторона РГК слоя. Кроме того, RGC сторона обычно имеет некоторые продукты распада клеток, которые могут помочь в правильной ориентации эксплантов.
7. С РГК слой вниз, используйте пинцет, чтобы твердо угнетают центр эксплантов так, что она будет придерживаться стекло покровное. Углубление в эксплантов из щипцы могут быть видимыми, это нормально.
8. После покрытия всех эксплантатах по культуре блюдо, трансфер до 37 ° C инкубатора. Сетчатки аксоны первых наблюдается через 4-6 часов после покрытия и эксплантов оставаться здоровым в течение нескольких дней, но значительное разрастание может произойти после 24 часов. Эксплантов может быть использован для многочисленных в лабораторных анализах, фиксировали в 4% PFA в течение 30 минут и immunostained (рис. 2).

Пограничная Пробирной

8. Кроме того, передача 4 GFP + эксплантов на блюдо, которое было подготовлено для границы анализа (см. часть 1). Упорядочить эксплантов в вертикальной линии в центр блюда, аппроксимирующей расположение границы.
9. Под флуоресцентным микроскопом рассекает, плиты эксплантов так, чтобы они ~ 50-150 мм от флуоресцентных границы. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 24 часов, что позволяет достаточно времени для RGC аксонов достичь границы подложки. Эксплантов может быть зафиксирован в 4% PFA в течение 30 минут, после чего иммуноокрашивания (рис. 2).

Представитель результаты

Discussion

В этом видео, мы продемонстрировали электропорации методы, как в утробе матери и бывшего естественных условиях, для доставки генов в мышиные эмбриональные РГК. Внутриутробное сетчатки электропорации представляет собой механизм для манипулирования экспрессии генов в РГК и визуализировать их аксонов прогнозы в естественных условиях. Разрешение эмбрионов, чтобы выжить после рождения позволяет рассмотрение этих GFP + РГК проекции в своей цели, наружного коленчатого тела (ЛГН). Ex естественных сетчатки электропорации обеспечивает более контролируемой способность ориентироваться на конкретные сетчатки регионах для использования с в пробирке анализов. Сочетая в естественных условиях и в пробирке анализы, полученные из этих методов позволяет тщательной характеристике РГК развития и аксонов проекции в подмножество РГК в противном случае нормального фона. Хотя наши демонстрации сосредотачивается на руководство РСК аксонов в зрительных нервов, как в утробе матери и исключая виво сетчатки electroporations могли бы оказаться полезными для изучения того, как возмущения в экспрессии генов, эффект РГК дифференциации, дендритные морфологии, электрофизиологических свойств, формирование синапса и надлежащей ориентации в прекращении таких зон как LGN и верхний бугорок.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)	Harvard Apparatus	450052
Round tweezer electrodes	Nepa Gene	CUY650-5 or CUY650-7
Silk Sutures	Henry Schein	101-2636
Glass micropipettes with plungers	Drummond Scientific	5-000-1001-X10
Antibiototic-antimycotic	Invitrogen	15240096
DMEM/F12 medium	GIBCO, by Life Technologies	11330057
Albumin bovine serum	Sigma-Aldrich	A8806-5G
ITS supplement	Sigma-Aldrich	I-1884
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015