Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

В утробе матери и исключая виво Электропорация для экспрессии генов у мыши ганглиозных клеток сетчатки

doi: 10.3791/1333 Published: September 24, 2009

Summary

Здесь мы приведем два способа манипулирования экспрессии генов в мышиные клетки сетчатки ганглия (РГК) по

Abstract

Сетчатки и ее единственного нейрона выход, ганглиозных клеток сетчатки (РГК), составляют отличную модель, в которой для изучения биологических вопросов, таких как дифференцировка клеток, аксонов руководство, retinotopic организации и формирование синапса [1]. Одним из недостатков является неспособность эффективно и надежно управлять экспрессии генов в РГК в естественных условиях, особенно в противном случае доступны мышиной зрительных путей. Трансгенные мыши могут быть использованы для манипулирования экспрессии генов, однако этот подход часто является дорогостоящим, требует много времени, и может привести к нежелательным побочным эффектам. В куриных, в ово электропорации используется для манипулирования экспрессии генов в РГК для изучения сетчатки и РГК развития. Хотя подобные методы электропорации были разработаны в неонатальном щенков мыши [2], у взрослых крыс [3], и эмбриональных мышиных сетчатки в пробирке [4], ни одна из этих стратегий позволит полной характеристики РГК развития и аксонов прогнозы в естественных условиях. С этой целью мы разработали два приложения электропорации, один в утробе матери и других естественных отл, непосредственно для мышиных эмбриональных РГК [5, 6].

С внутриутробно сетчатки электропорации, мы можем misexpress или подавлять определенные гены в РГК и следовать их проекции аксонов через зрительные пути в естественных условиях, что позволяет рассмотрения руководством решений на промежуточные цели, например, зрительных нервов, или в целевых регионах, таких как латерального коленчатого тела. Пошевелив экспрессии генов в подмножество РГК в противном случае дикого типа фона облегчает понимание функции генов всей сетчатки пути. Кроме того, мы разработали спутник техники для анализа РГК рост аксонов в пробирке. Мы electroporate эмбриональных глав бывших естественных условиях, собирать и инкубировать целом сетчатке, а затем подготовить эксплантов из этих сетчатки через несколько дней. Сетчатки эксплантов может быть использован в разнообразных в пробирке тесты, чтобы выяснить реакцию электропорации РГК аксоны руководством сигналы или других факторов. В общем, это набор методов, усиливает нашу способность misexpress или подавлять гены в РГК и должны очень помочь результаты исследований РГК развития и аксонов прогнозы.

Protocol

Часть 1: Настройка для внутриутробно и бывших естественных сетчатки electroporations

1. Для обоих в утробе матери и исключая виво сетчатки electroporations

  • Использование электродов съемник подготовить с острым концом микропипетки и сломать наконечник (или конические наконечник), чтобы угловые точки.
  • Подготовка растворов ДНК с желаемой концентрации и добавляют небольшое количество Быстрый Зеленая краска (0,05%) для визуализации инъекций. Я рекомендую 5 мкл раствора ДНК на матери внутриутробно сетчатки electroporations и 1 мкл раствора ДНК на эмбриональной головы для бывших естественных сетчатки electroporations. Включите построить GFP выражение (или другой флуоресцентный белок) для визуализации трансфицированных нейронов.
  • Стерилизовать хирургических инструментов с помощью автоклавов.
  • Подготовка кетамин-ксилазина анестезии смесь при следующем соотношении (изготовление ~ 0,2 мл для каждой беременной женщины): 1.0:0.2:4.6 объемном соотношении 100 мкг / мл кетамина: 100 мкг / мл ксилазина: физиологический раствор. Другие анестетики могут быть использованы.

2. Для внутриутробно сетчатки electroporations только

  • Включите грелку и покрыть ее пеленки площадку.
  • Подготовка антибиотикам противогрибковым раствором (1:100) в фосфатном буфере физиологический раствор (PBS) и теплая на грелку. Подготовка ~ 2 мл для каждой плотины.
  • Место стерильной фильтрацией PBS в теплую ванну водой.

3. Для бывших естественных сетчатки electroporations только

  • Подготовка кислородом бессывороточной среде (ССМ) для сетчатки инкубации: Bubble 25 мл DMEM/F12 с 95% кислорода / 5% углекислого газа в течение ≥ 2 часа. Для 25 мл кислородом среде, добавить 0,25 г бычьего сывороточного альбумина (БСА), 250 мкл ЕГО дополнять и 50 мкл пенициллин-стрептомицина решение. Смешайте решение о роспуске BSA, то стерильный фильтр решение. Это решение должно быть свежей для каждого электропорации эксперимента.
  • Подготовка УЛ + 0,4% метилцеллюлозы средой для сетчатки инкубации эксплантов: Автоклав 0,20 г метилцеллюлозы в 150 мл флакон с размешать магнита. Подготовка 50 мл SFM (как указано выше, без восходящей) и добавить в автоклаве бутылку метилцеллюлозы. Смешайте это решение при 4 ° С в течение ночи. Стерильный фильтр это решение на следующий день и хранить при 4 ° С, это решение может храниться в течение ~ 1 месяц.
  • В день уборки сетчатки эксплантов (часть 5), готовить блюда для сетчатки покрытие эксплантов: Пальто стеклянная посуда нижней культуры с 250 мкл поли-L-орнитина в течение ≥ 2 часа при температуре 37 ° C. (В качестве альтернативы, блюда могут быть покрыты с поли-L-орнитин предыдущего дня и инкубировали в течение ночи при 4 ° С), мыть посуду несколько раз PBS, затем слой блюда с 200 мкл 10 мкг / мл ламинин в DMEM/F12 в течение ≥ 2 часа при температуре 37 ° C. Мыть посуду несколько раз PBS при 37 ° С и оставляют на PBS до эксплантов готовы к обшивке.
  • За границу анализы, пальто блюда с поли-орнитин, что и выше, то пальто половине блюдо с белок вместе с флуоресцентного маркера для визуализации границы (например, Alexa Fluor 555 конъюгированных с BSA, 1:800) в течение 2 часов при 37 ° C. Промыть PBS, затем добавить ламинин как описано выше.

Части 2А: Внутриутробное сетчатки электропорации инъекционных и electroporating ДНК в мышиных E14.5 сетчатки в естественных условиях

  1. Inject 0,15 мл внутрибрюшинно анестезии смеси (ф) в E13.5-E14.5 этапе плотины. Это должно занять 3-7 минуты, пока мать достигла хирургических плоскости анестезии. Полностью под наркозом мышь не должна реагировать на ущемление hindpaw.
  2. За это время, вырезать небольшой кусочек парафильмом и пипетки ~ 5 мкл раствора ДНК на парафильмом. Бенд поршень (металлический провод) на 90 ° градусов и вставить его в потянул micropippette. Использование поршень, аспирации раствора ДНК в микропипетки (с использованием рассекает микроскоп может помочь этому процессу).
  3. Как только мать достигла хирургической анестезии плоскости, используйте электрическую бритву, чтобы побрить ~ 2 дюйма области живота матери с, затем поместите ее спинной стороной вниз на грелку. Подготовка бритой области, протирая спиртом площадку затем йодом площадку как минимум в два раза. Место падения глазной мази Vet на каждый глаз, чтобы предотвратить изъязвление роговицы глаза, а мать находится под общим наркозом.
    Рисунок 1
  4. С щипцами возьмитесь за кожей и с помощью ножниц, чтобы сделать вертикальный разрез по средней линии (~ 1 мм в длину), через кожу и мышцы живота, обнажив брюшины. Поднимите брюшины с пинцетом и сделать аналогичный вертикальный разрез через эту мембрану, чтобы разоблачить брюшной полости (рис. 1). Потом портьера операционного поля с марлевой прокладки для предотвращения содержимого брюшной полости в контакт и быть загрязненные волосыживотного.
  5. Оттянуть кожу и брюшину с пинцетом и использовать рассекает шпателя извлечь эмбрион через разрез (выберите наиболее доступных эмбриона). Место шпателем от 2 эмбрионов и осторожно потяните эмбриональных цепь из брюшной полости. Вы можете вытащить эмбриональной цепи пальцами.
    * Начиная с этого момента, держать эмбрионов гидратированных стерильной PBS *
  6. Держите мать на грелку, положите ее под микроскопом и рассекает массаж эмбриона, так что сетчатка вверх. Я рекомендую начинать с любой самой медиальной или латеральной эмбриона, что делает его легче отслеживать, какие эмбрионы были электропорации.
  7. Возьмите микропипетки в вашей доминирующей руки и стабилизировать эмбриона другой рукой. С микропипетки, прокалывают сетчатки через стенку матки и околоплодных мешка. В зависимости от остроты микропипетки, это может занять изрядное количество давлением проникают в стенку матки, но как только на основе, микропипетки войдет эмбриона и, в идеале сетчатки. Это может быть трудно контролировать и оценить глубину микропипетки поскольку это входит в эмбрион. Минимизировать количество микропипетки движение, как только он пронзил мембрана, которая препятствует расширению входного отверстия, в результате утечки околоплодных вод и зародыш смерти. Избегайте пирсинг кровеносных сосудов в стенке матки, так как это может привести к кровотечению и смерти эмбриона.
  8. После того как вы уверены, что микропипетки вступил сетчатки, вы готовы изгнать раствора ДНК в сетчатке. Медленно нажмите поршень и одновременно снять микропипетки, гарантируя, что ДНК вводят по всему пути микропипетки, как микропипетки часто глубоко проникает к сетчатке. Если вы находитесь в сетчатке, изгнать 0,5 мкл (может быть измерен 1 мкл делений на микропипетки) в extraretinal пространство между внешней сетчатки слоя и пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). Вы должны наблюдать зеленого красителя заполнения сетчатки и просачивается в амниотической жидкости (рис. 1).
  9. Электропорации весла должны храниться в PBS заполненные чашке Петри во время операции. Аккуратно лопастями по бокам головы эмбриона с положительной (+) веслом на той же стороне, вводят глаз. Применяют умеренное количество давление для стабилизации головы, но не нажимайте слишком сильно, поскольку это будет поп амниотической полости и привести к смерти эмбриона. Когда электроды в месте, доставить пять 40-В, 50 мс прямоугольные импульсы с частотой 60 Гц. Это не является необычным для матери дергаться из-за тока бежать в коже и мышцах.
  10. Повторите шаги 7-9 для каждого эмбриона, который будет введен и электропорации. Я обычно electroporate 4-8 эмбрионов на одну женщину, в зависимости от количества ДНК, количество эмбрионов, состояние матери, и количество времени, под наркозом. Кроме того, несколько эмбрионов может быть введен, а затем электропорации, в отличие от инъекций и electroporating каждого эмбриона отдельно.
  11. После electroporating эмбрионы, использование щипцов и шпатель для замены эмбриональной цепи обратно в брюшную полость. Налейте ~ 2 мл антибиотикам противогрибковым раствора в брюшной полости.
  12. Использование кровоостанавливающего и щипцы для шва брюшины, начиная с двойным узлом на передней части разреза и приступить к простым непрерывным швом узор на задней части разреза. Используйте окончательного цикла галстук и аккуратный шов превышение шва.
  13. Для основной разрез закрыты, поднимите кожу в передней части разреза с тупым пинцетом, осторожно отделить кожу от брюшины. Место зубы степлер вокруг кожи и угнетают степлера. Продолжить сшивание разрез закрыт для заднему концу, который обычно требует 5-7 скрепок. Протрите намотанной скобы с алкоголем площадку.
  14. Позвольте матери восстановиться на грелку (как правило, занимает от 15-90 минут для нее, чтобы пробудить), и когда она начинает переворачиваться, место ее в новую клетку брюшной стороной вверх.
  15. Чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт, матери получают бупренорфин (0,05-0,1 мг / кг, подкожно) после пробуждения, и в более поздние моменты времени, если дискомфорт не проходит. Чтобы избежать обезвоживания, вводить мать с 1,0 мл физиологического раствора подкожно (п) ~ 2-4 часов после операции, и снова, если вечер и следующий день, если необходимо. 24 часов после операции, мама должна восстановить нормальное поведение и быть питья и еды на регулярной основе.

Часть 2В: Внутриутробное сетчатки поиска электропорации электропорации сетчатки на E18.5

  1. Подготовка 4% параформальдегида (PFA) в PBS, что делает ~ 5 мл на эмбрион. Перфузии можно сделать с помощью гравитации система на основе инфузии или шприцевой насос. (В качестве альтернативы E18.5 головки могут быть просто погружен в 4% PFA в течение ночи.)
  2. Inject матери0,2 мл анестетика сочетание IP и убедитесь, что она полностью находится под наркозом. Используйте ножницы, чтобы вырезать кожу и брюшину под скобы подвергать брюшной полости и рогов матки.
  3. Удалить электропорации эмбриона и пин-код его вентральной стороной вверх. Избавьтесь от брюшной части кожи, брюшины, диафрагмы и боковой грудной клетки подвергать сердце. Пирс левого желудочка с бабочкой игла прилагается к перфузионной установке, а также сокращение правого предсердия с microscissors. Начало перфузии и позволяют PFA течь в течение ~ 60 секунд; кровь должна выйти правое предсердие и эмбрион должен стать бледным, если перфузия успешным. Обезглавьте эмбриона и собирать головы в 4% PFA в 15-мл конические пробирки. Повторите эту процедуру для всех электропорации эмбрионов. Держите голову в 4% PFA в течение ночи при 4 ° С, а затем промыть в PBS в течение нескольких дней. Эвтаназии матери через шейки дислокации, когда все эмбрионы были собраны.

Удаление сетчатки

  1. После мойки PBS, контактный голову рассечение блюдо с сетчатки вверх и опустите в PBS. Удалить кожу со всего сетчатку выявить ППД. Использование 26G1 / 2 иглы, прокол брюшной сетчатки в объектив-НПП перехода. Вставьте один край microscissors в это отверстие и сделать вертикальный разрез через брюшную сетчатки диска зрительного нерва. Это позволит вам сориентироваться сетчатки, когда вы удалите его.
  2. Удалить РПЭ с тонкой точке щипцами. Захватите НПП на вентральной разрез с одним пинцетом и использовать другие щипцы чистить НПП от сетчатки, особенно на РПЭ-объектив перекрестке, где НПП прочно держится в гнезде. После удаления НПП, держитесь объектив с прекрасной щипцы и тянуть вверх и в сторону, чтобы удалить линзы. Удалить сетчатки путем размещения щипцы вокруг зрительного нерва и сетчатки отщипывать. Передача сетчатки PBS заполненные хорошо, отслеживая которые пришли из сетчатки, который возглавляет.
  3. Повторите шаги 4-5 для контралатеральной сетчатки, и для всех других электропорации эмбрионов. Неинъекционные сетчатки служит для контроля иммунной окраски.
  4. Использование флуоресцентного микроскопа рассекает для сканирования всех сетчатки для GFP + клеток (зеленые сетчатки). Для всех GFP + сетчатки, электропорации был успешным в этом эмбрион, и эти сетчатки и соответствующие мозга (с визуальным систему без изменений) могут быть обработаны для дальнейшего анализа (например, секционирования и иммунной) (рис. 1).

Часть 3а: Ex естественных сетчатки электропорации инъекционных и electroporating ДНК в мышиных E14.5 сетчатки в пробирке

  1. Обезболить E13.5-E14.5 этапе мать с 0,2 мл смеси анестетика и убедитесь, что она полностью находится под наркозом. Используйте ножницы, чтобы вырезать через кожу и брюшной полости подвергать эмбрионов. Поднимите эмбриональных цепь щипцами и прорезать соединительной ткани, чтобы полностью удалить весь эмбриональный цепочки от матери. Место эмбриональной цепи в чашки Петри с DMEM/F12 на льду. Эвтаназии матери через шейки дислокации.
  2. Избавьтесь от всей стенки матки с microscissors. Затем с помощью щипцов для удаления каждого эмбриона из амниотической полости и отщипывать плаценты. Обезглавьте каждого эмбриона и собирать головы в другую чашку Петри с DMEM/F12 на льду.
  3. Использование пипетки ртом или поршень пипетки, заполните микропипетки с желаемым количеством раствора ДНК (см. часть 1).
  4. В этом протоколе, ДНК будет выведена на периферические спинной сетчатки. Можно целевой других регионах сетчатки, регулируя сайт ДНК впрыска и позиционирование электрода весла.
  5. Передача одной головы на вскрытии блюдо с PBS и пин-код голову спинной стороной вверх. Используйте пинцет, чтобы удалить кожу над сетчатки.
  6. Холдинг микропипетки ~ 10 ° от горизонтального положения (по существу, параллельно кривизна спины сетчатки), нажмите микропипетки через ПЭС так, чтобы кончик между ПЭС и внешний слой сетчатки. Выгнать ~ 0,1-0,4 мкл раствора ДНК в этом пространстве; зеленой жидкости должны быть видны заполнения всего пространства и утечки через отверстие в ППД. Повторите инъекций для контралатеральной сетчатки.
  7. Аккуратно, но быстро удалите булавки и (держа голову погружен в PBS) место электрода весла вокруг головы, с положительным (+) веслом на брюшной стороне головы. Доставить 4 40-В, 50 мс импульсы с частотой 60 Гц, затем поместить голову в тарелку с DMEM/F12 на льду (рис. 2).
    Рисунок 2
  8. Повторите шаги 5-7 для всех руководителей и для всех растворов ДНК. После завершения electroporations, добавьте ~ 1,5 мл кислорода решение SFM для 4-а блюдо и держать на льду (одна скважина для каждого отдельного решения ДНК вводят).
  9. Передача одной головы на вскрытии блюдо с DMEM/F12, с одной сетчатки вверх. На вентральной сетчатки (или стороне, противоположной области мишени), использование тонких щипцов ущипнутьи слезоточивый дыры в ППД. Вставьте один конец щипцами через это отверстие в кожуре НПП от сетчатки, особенно на объектив-сетчатки перехода. Ничего не вырезано или повреждение сетчатки глаза, потому что это приведет к краху сетчатки на себя во время инкубации. После удаления НПП, использование щипцов, чтобы вытолкнуть сетчатки, зажимая зрительного нерва в основании сетчатки (оставить нетронутыми линзы). Передача сетчатки кислородом для устойчивого управления лесами. Отразить над головой и повторите для контралатерального глаза.
  10. Полный шаг 9 для всех электропорации головы. Инкубируйте сетчатки кислородом SFM при 37 ° С в течение 40-48 часов.

Часть 3б: Ex естественных сетчатки Сбор электропорации и обшивки GFP + сетчатки эксплантов (2 дня после электропорации)

  1. Перенесите все сетчатки из одной ямы кислородом SFM в крышку чашки Петри с DMEM/F12. Выберите один сетчатки и использовать люминесцентные рассекает возможности для визуализации GFP + (зеленый) части сетчатки.
  2. Использование microscalpel и щипцы, препарировать и выбросить не-GFP + часть сетчатки, так что только GFP + кусок сетчатки остается. Полезно постоянно переключаться между люминесцентными и регулярные свет по всему рассечение специально выбрать GFP + сетчатки. Передача GFP + сетчатки хорошо с DMEM/F12.
  3. Повторите шаг 2 для всех сетчатки из одной ямы. Для каждого ДНК условие (каждого отдельного хорошо), использование новой чашки Петри и DMEM/F12 среды.
  4. Эти GFP + сетчатки теперь должен быть разбит на более мелкие сетчатки эксплантов для металлизации. Под рассекает сферу, разрезать большой кусок сетчатки GFP + на более мелкие эксплантов с microscalpel. Эксплантов должна быть прямоугольной, ~ 200-300 мкм в длину и ширину. Соберите все эксплантов в хорошо DMEM/F12. Один GFP + кусок сетчатки должны производить ~ 4-10 GFP + сетчатки эксплантов в зависимости от ткани размером. Повторите этот шаг для всех GFP + сетчатки регионов, которые были собраны.
  5. После подготовки всех GFP + сетчатки эксплантов, добавьте 250 мкл УЛ + 0,4% метилцеллюлозы (хранить при температуре 4 ° С) до ламинин покрытием блюда культуры (см. часть 1). Передача 4-8 GFP + эксплантов в культуру блюдо и использовать пинцет, чтобы аккуратно организовать эксплантов в многоугольник, с эксплантов находится на полпути между центром и краем блюда.
  6. Определите, какая сторона является эксплантов РГК слоя. Иногда НПП кристаллы остаются прикрепленными к внешнему слою сетчатки, указывая, что противоположная сторона РГК слоя. Кроме того, RGC сторона обычно имеет некоторые продукты распада клеток, которые могут помочь в правильной ориентации эксплантов.
  7. С РГК слой вниз, используйте пинцет, чтобы твердо угнетают центр эксплантов так, что она будет придерживаться стекло покровное. Углубление в эксплантов из щипцы могут быть видимыми, это нормально.
  8. После покрытия всех эксплантатах по культуре блюдо, трансфер до 37 ° C инкубатора. Сетчатки аксоны первых наблюдается через 4-6 часов после покрытия и эксплантов оставаться здоровым в течение нескольких дней, но значительное разрастание может произойти после 24 часов. Эксплантов может быть использован для многочисленных в лабораторных анализах, фиксировали в 4% PFA в течение 30 минут и immunostained (рис. 2).

Пограничная Пробирной

  1. Кроме того, передача 4 GFP + эксплантов на блюдо, которое было подготовлено для границы анализа (см. часть 1). Упорядочить эксплантов в вертикальной линии в центр блюда, аппроксимирующей расположение границы.
  2. Под флуоресцентным микроскопом рассекает, плиты эксплантов так, чтобы они ~ 50-150 мм от флуоресцентных границы. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 24 часов, что позволяет достаточно времени для RGC аксонов достичь границы подложки. Эксплантов может быть зафиксирован в 4% PFA в течение 30 минут, после чего иммуноокрашивания (рис. 2).

Представитель результаты

Рисунок 3

Discussion

В этом видео, мы продемонстрировали электропорации методы, как в утробе матери и бывшего естественных условиях, для доставки генов в мышиные эмбриональные РГК. Внутриутробное сетчатки электропорации представляет собой механизм для манипулирования экспрессии генов в РГК и визуализировать их аксонов прогнозы в естественных условиях. Разрешение эмбрионов, чтобы выжить после рождения позволяет рассмотрение этих GFP + РГК проекции в своей цели, наружного коленчатого тела (ЛГН). Ex естественных сетчатки электропорации обеспечивает более контролируемой способность ориентироваться на конкретные сетчатки регионах для использования с в пробирке анализов. Сочетая в естественных условиях и в пробирке анализы, полученные из этих методов позволяет тщательной характеристике РГК развития и аксонов проекции в подмножество РГК в противном случае нормального фона. Хотя наши демонстрации сосредотачивается на руководство РСК аксонов в зрительных нервов, как в утробе матери и исключая виво сетчатки electroporations могли бы оказаться полезными для изучения того, как возмущения в экспрессии генов, эффект РГК дифференциации, дендритные морфологии, электрофизиологических свойств, формирование синапса и надлежащей ориентации в прекращении таких зон как LGN и верхний бугорок.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Ричард Валле и Brikha Шреста за помощь в утробе матери и исключая виво сетчатки методы электропорации, соответственно, и д-р Т. Сакураи для комментариев на этот протокол. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грантов F31 NS051008 (TJP), Фонд залить La Recherche Medicale и правам Программа научно-Пограничный (AR) и R01 EY12736 (СМ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle) Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes Nepa Gene CUY650-5 or CUY650-7
Silk Sutures Henry Schein 101-2636
Glass micropipettes with plungers Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Antibiototic-antimycotic Invitrogen 15240096
DMEM/F12 medium GIBCO, by Life Technologies 11330057
Albumin bovine serum Sigma-Aldrich A8806-5G
ITS supplement Sigma-Aldrich I-1884
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. Chalupa, L. M., Williams, R. W. MIT Press. Cambridge. (2008).
  2. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
  3. Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
  4. Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
  5. Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).
  6. Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection. J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).
<em>В утробе матери</em> и <em>исключая виво</em> Электропорация для экспрессии генов у мыши ганглиозных клеток сетчатки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333, doi:10.3791/1333 (2009).More

Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333, doi:10.3791/1333 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter