In utero och ex vivo elektroporation för genuttryck i Mus Retinal ganglion celler

Summary

Här presenterar vi två tekniker för att manipulera genuttryck i murina retinal ganglion celler (RGC: er) med

Abstract

Näthinnan och dess enda utgång neuron, näthinnans gangliecell (RGC), utgör en utmärkt modell för att undersöka biologiska frågor som celldifferentiering, axonet vägledning, retinotopic organisation och synapserna bildas [1]. En nackdel är oförmågan att effektivt och tillförlitligt sätt manipulera genuttryck i RGC: er in vivo, särskilt i den annars är svårtillgängliga murina visuella vägar. Transgena möss kan användas för att manipulera genuttryck, men detta tillvägagångssätt är ofta dyrt, tidskrävande och kan ge oönskade biverkningar. I chick, är i ovo elektroporering används för att manipulera genuttryck i RGC: er för att undersöka näthinnan och RGC utveckling. Även om liknande elektroporering har utvecklats hos neonatala möss ungar [2], vuxna råttor [3], och embryonala murina retinae in vitro [4], ingen av dessa strategier tillåta fullständig karakterisering av RGC utveckling och prognoser axonet in vivo. För detta ändamål har vi utvecklat två tillämpningar av elektroporation, en i livmodern och den andra ex vivo, att särskilt inrikta embryonala murina RGC: er [5, 6].

Med i livmodern retinal elektroporering kan vi misexpress eller downregulate specifika gener i RGC: er och följa sina axon prognoser genom visuella vägar in vivo, vilket möjliggör granskning av vägledning beslut på delmål, exempelvis synnerven chiasm, eller på målområdena, som till exempel laterala geniculate kärna. Störande genuttryck i en delmängd av RGC: er i en annars vildtyp bakgrund underlättar förståelsen av geners funktion i hela näthinnan väg. Dessutom har vi utvecklat en följeslagare för att analysera RGC axonet tillväxt in vitro. Vi electroporate embryonala huvuden ex vivo, samla och inkubera hela näthinnan, sedan förbereda explants från dessa retinae flera dagar senare. Retinal explants kan användas i en mängd olika in vitro-tester för att undersöka ett svar från electroporated RGC axoner till vägledning cues eller andra faktorer. Sammanfattningsvis förstärker denna uppsättning tekniker vår förmåga att misexpress eller downregulate gener i RGC: er och bör till stor hjälp studier som undersökt RGC utveckling och prognoser Axon.

Protocol

Del 1: Ställa in i livmodern och ex vivo retinala electroporations

1. För både in utero och ex vivo retinala electroporations

• Använd en elektrod avdragare för att förbereda spetsig mikropipetter och bryta spetsen (eller avfasning spetsen) för att göra en vinklad punkt.
• Förbered DNA-lösningar till önskad koncentration och tillsätt en liten mängd Snabb Grön Dye (0,05%) för att visualisera injektioner. Jag rekommenderar 5 l DNA-lösning per mamma för i livmodern retinal electroporations och 1 l DNA-lösning per embryonala huvudet för ex vivo retinal electroporations. Inkludera en konstruktion GFP uttryck (eller andra fluorescerande protein) för att visualisera transfekterade nervceller.
• Sterilisera kirurgiska instrument via autoklav.
• Förbered ketamin-xylazin anestesi blanda med följande förhållande (vilket gör ~ 0,2 ml för varje gravid kvinna): en 1.0:0.2:4.6 volymetrisk förhållandet 100 mikrogram / ml ketamin: 100 mikrogram / ml xylazin: koksaltlösning. Andra anestetika kan användas.

2. För i livmodern näthinnan electroporations bara

• Slå på värmedyna och täck den med en blöja pad.
• Förbered antibiotika-antimykotika lösningen (1:100) i fosfatbuffert saltlösning (PBS) och värm på värmedyna. Förbered ~ 2 ml för varje dammen.
• Placera steril-filtreras PBS i varmt vattenbad.

3. För ex vivo retinala electroporations bara

• Förbered syresatt serum fritt medium (SFM) för näthinnan inkubation: Bubble 25 ml DMEM/F12 med 95% syrgas / 5% koldioxid i ≥ 2 timmar. Till 25 ml syresatt medium, lägger 0,25 g bovint serumalbumin (BSA), 250 l DESS komplettera och 50 l Penicillin-streptomycin lösning. Blanda för att lösa upp BSA, då sterila filtrera lösningen. Denna lösning bör göras nytt för varje elektroporation experiment.
• Förbered SFM + 0,4% metylcellulosa medium för retinal Explantation inkubation: Autoklav 0,20 g metylcellulosa i en 150 ml flaska med ett rör magnet. Förbered 50 ml av SFM (som ovan, utan bubblande) och lägga till autoklaveras metylcellulosa flaska. Blanda denna lösning vid 4 ° C över natten. Sterilfilter denna lösning följande dag och förvara vid 4 ° C, kan denna lösning förvaras i ~ 1 månad.
• På dagen av näthinnans Explantation skörd (del 5), förbereda rätter för retinal Explantation plätering: Coat glas rätter botten kultur med 250 l av poly-L-Ornithine i ≥ 2 timmar vid 37 ° C. (Alternativt kan rätterna vara belagd med poly-L-Ornithine föregående dag och inkuberas över natten vid 4 ° C.) diska flera gånger med PBS, då päls rätter med 200 l på 10 mikrogram / ml laminin i DMEM/F12 för ≥ 2 timmar vid 37 ° C. Diska flera gånger med PBS vid 37 ° C och låt på PBS tills explants är redo för plätering.
• För gränsöverskridande analyser, päls rätter med poly-ornitin som ovan, då päls hälften av skålen med protein av intresse tillsammans med en fluorescerande markör för att visualisera gränsen (exempelvis Alexa Fluor 555 konjugerat till BSA, 1:800) i 2 timmar vid 37 ° C. Tvätta med PBS och tillsätt sedan laminin som beskrivs ovan.

Del 2a: i livmodern retinala elektroporation Injicering och electroporating DNA i E14.5 murina retinae in vivo

1. Injicera 0,15 ml av bedövning mix intraperitoneal (ip) i ett E13.5-E14.5 skede dammen. Det bör ta 3-7 minuter tills mamma har nått en kirurgisk plan av anestesi. Ett fullt sövda mus bör inte svara nypa av hindpaw.
2. Under denna tid, skära en liten bit av parafilm och pipettera ~ 5 ul av DNA-lösning på parafilm. Böj en kolv (metalltråd) i 90 ° graders vinkel och sätt in det i en drog micropippette. Med hjälp av kolven, aspirera DNA lösningen i mikropipett (med hjälp av en dissekera mikroskop kan hjälpa den här processen).
3. När mamman har nått en kirurgisk plan av anestesi, använder en elektrisk rakapparat att raka en ~ 2 tum region i moderns mage, sedan placera henne ryggsidan ner på värmedyna. Prep det rakade området genom att torka av med en spritsudd följt av en jod pad minst två gånger. Placera en droppe oftalmologiska Vet salva på varje öga för att förhindra sår på hornhinnan i ögonen medan mamman är under narkos.
   
4. Med pincett, ta tag i huden och använda sax för att göra ett vertikalt snitt längs mittlinjen (~ 1 cm lång) genom huden och musklerna i buken, utsätta bukhinnan. Lyft bukhinnan med pincett och gör en liknande vertikala snitt genom detta membran att exponera bukhålan (figur 1). Sedan drapera det kirurgiska fältet med gasbinda kuddar för att förhindra att buken innehållet från att kontakta och förorenas av håretav djuret.
5. Dra tillbaka huden och bukhinna med pincetten och använd dissekera spateln för att utvinna ett embryo genom snittet (välj de mest tillgängliga embryot). Placera spateln mellan två embryon och dra försiktigt embryonala kedjan ut ur bukhålan. Du kan dra ut embryonala kedjan med fingrarna.
   * Från denna punkt framåt, hålla embryon hydratiserade med steril PBS *
6. Håll mamman på värmedyna, placera henne under dissekera mikroskop och massage ett embryo så att näthinnan är vänd uppåt. Jag rekommenderar att börja med antingen den mest medial eller lateral embryo, vilket gör det lättare att hålla reda på vilka embryon har electroporated.
7. Ta mikropipett i din dominanta hand och stabilisera embryo med andra handen. Med mikropipett, hål i näthinnan genom livmoderväggen och fostersäcken. Beroende på skärpan i mikropipett kan det ta en hel del press att tränga in i livmoderväggen, men en gång igenom, kommer mikropipett in embryot och helst näthinnan. Det kan vara svårt att kontrollera och mäta djupet på mikropipett när den går in embryot. Minimera mängden mikropipett rörelse när den har hål i membranet för att förhindra att utvidga ingångshålet, vilket resulterar i läckage av fostervatten och embryo död. Undvik fartyg piercing blod i livmoderväggen, eftersom detta kommer att resultera i blödning och embryot död.
8. När du är säker på att mikropipett har gått in i näthinnan, är du redo att driva ut DNA-lösningen i näthinnan. Tryck långsamt in kolven och samtidigt dra tillbaka mikropipett och se till att DNA injiceras i hela sökvägen till mikropipett, eftersom mikropipett ofta tränger djupt på näthinnan. Om du är i näthinnan, fördriva 0,5 l (kan mätas med 1 l skalstrecken på mikropipett) i extraretinal utrymmet mellan det yttre retinal lagret och pigmentepitelet (RPE). Du bör observera grönt färgämne fylla näthinnan och läcker ut i fostervattnet (Figur 1).
9. Den elektroporation paddlar bör hållas i ett PBS-fyllt petriskål under operationen. Placera försiktigt paddlar på sidorna av embryot huvudet med den positiva (+) paddla på samma sida som injiceras ögat. Applicera en måttlig mängd tryck för att stabilisera huvudet, men tryck inte för hårt, eftersom detta kommer att smälla fostersäcken och resultera i embryo döden. När elektroderna är på plats, levererar fem 40-V, 50 ms torg pulser med en frekvens på 60 Hz. Det är inte ovanligt att mamman rycka på grund av nuvarande fly till huden och musklerna.
10. Upprepa steg 7-9 för varje embryo som ska injiceras och electroporated. Jag electroporate vanligtvis 4-8 embryon per mor, beroende på mängden DNA, antal embryon skick mor och den tid under narkos. Alternativt kan flera embryon injiceras och sedan electroporated, i motsats till injicering och electroporating varje embryo separat.
11. Efter electroporating embryona, använd pincett och spatel för att ersätta den embryonala kedjan tillbaka in i bukhålan. Häll ~ 2 ml av antibiotika-antimykotika lösning i bukhålan.
12. Använd hemostat och pincett för att sutur bukhinnan, till att börja med en dubbel knut på den främre delen av snittet och fortsätta med en enkel kontinuerlig sutur mönster till den bakre delen av snittet. Använd den sista slingan att knyta bort suturen och trimma överskott sutur.
13. Att häfta snittet stängt, lyft huden på främre delen av snittet med trubbig pincett, var noga med att separera huden från bukhinnan. Placera tänder häftapparat runt huden och tryck på häftapparat. Fortsätt häftning snittet stängda till den bakre änden, vilket vanligtvis tar 5-7 häftklamrar. Torka såret runt klammer med en spritsudd.
14. Låt mamman tillbaka på värmedyna (vanligtvis tar mellan 15-90 minuter för henne att vakna) och när hon börjar att rulla över, placera henne i en ny bur buken uppåt.
15. För att minimera smärta och obehag, mammor får buprenorfin (0,05 till 0,1 mg / kg sc) vid uppvaknande, och vid senare tidpunkter vid kvarstående besvär. För att förhindra uttorkning, injicera mamman med 1,0 ml koksaltlösning subkutant (sc) ~ 2-4 timmar efter operation, och igen om kvällen och följande dag om det behövs. 24 timmar efter operationen, ska modern återfå normala beteende och att man äter och dricker regelbundet.

Del 2B: i livmodern retinala elektroporering Hämtning av electroporated näthinnan vid E18.5

1. Förbered 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, vilket gör ca 5 ml per embryo. Perfusion kan göras med en gravitation-baserat infusion system eller med sprutpump. (Alternativt kan E18.5 huvuden helt enkelt vara nedsänkta i 4% PFA över natten.)
2. Injicera mamma med0,2 ml av narkos mix IP och se till att hon är i full narkos. Använd en sax för att klippa i huden och bukhinna under häftklamrar att exponera bukhålan och livmoder horn.
3. Ta bort en electroporated embryo och stift den ventrala sidan upp. Skär genom bukhuden bukhinnan, diafragma och laterala delar av bröstkorgen att exponera hjärtat. Pierce vänster kammare med butterfly nål fäst vid perfusion setup, och skär i höger förmak med en microscissors. Starta perfusion och låt PFA flyta för ~ 60 sekunder, blod bör lämna höger förmak och embryot bör bli blek om perfusionen är framgångsrik. Halshugga embryot och samla huvudet i 4% PFA i 15-ml konisk flaska. Upprepa denna procedur för alla electroporated embryon. Håll huvudet i 4% PFA över natten vid 4 ° C, och sedan tvätta i PBS i flera dagar. Euthanize mamma via halsdislokation när alla embryon samlas in.

Ta bort näthinnan

1. Efter PBS tvättar, stift huvudet i en dissektion skålen med näthinnan uppåt och sänk ned i PBS. Ta bort skinn från hela näthinnan att avslöja RPE. Med hjälp av en 26G1 / 2 kanyl, punktera den ventrala näthinnan på linsen-RPE korsning. Sätt ett kanten av ett microscissors i detta hål och göra ett vertikalt snitt genom den ventrala näthinnan på synnerven skivan. Detta gör att du kan orientera näthinnan när du tar bort den.
2. Ta bort RPE med fin-punkt pincett. Ta RPE vid ventrala snitt med en pincett och använda andra pincett att skala RPE bort från näthinnan, speciellt på RPE-objektivet korsning där RPE sitter fast ordentligt. Efter att RPE, ta tag i linsen med fin pincett och dra uppåt och bort för att ta bort linsen. Ta bort näthinnan genom att placera pincett runt papillen och nyp av näthinnan. Överför näthinna till ett PBS-fylld väl, hålla reda på vilka retinae kom från vilket huvuden.
3. Upprepa steg 4-5 för den kontralaterala näthinnan, och för alla andra electroporated embryon. Den icke-injicerade näthinnan fungerar som en kontroll för immunfärgning.
4. Använd en fluorescerande dissekera mikroskop för att skanna alla retinae för GFP + celler (grön retinae). För alla GFP + retinae var elektroporation framgångsrik i detta embryo, och dessa retinae och motsvarande hjärna (med det visuella systemet intakt) kan bearbetas för vidare analys (dvs sektionering och immunfärgning) (Figur 1).

Del 3a: Ex vivo-retinal elektroporering Injicering och electroporating DNA i E14.5 murina retinae in vitro

1. Bedöva en E13.5-E14.5 scenen mor med 0,2 ml av narkos mix och se till att hon är i full narkos. Använd sax för att skära igenom huden och bukhåla att avslöja embryon. Lyft upp embryonala kedja med pincett och skär genom bindväv att helt ta bort hela embryonala kedjan från modern. Placera embryonala kedja i en petriskål med DMEM/F12 på is. Euthanize mamma via halsdislokation.
2. Skär genom hela livmoderväggen med microscissors. Använd sedan pincett för att ta bort varje embryo ur fostersäcken och nypa bort moderkakan. Halshugga varje embryo och samla in huvudet i en annan petriskål med DMEM/F12 på is.
3. Använda munnen Pipettera eller kolven pipett fyller mikropipett med önskad mängd av DNA-lösning (se del 1).
4. I detta protokoll kommer DNA injiceras i perifer rygg näthinnan. Man kan rikta andra näthinnans regioner genom att anpassa webbplatsen DNA injektionen och placering av elektroden paddlar.
5. Överför ett huvud till dissekera skålen med PBS och PIN-kod huvudet ryggsidan uppåt. Använd pincett för att ta bort hud över näthinnan.
6. Håll mikropipett ~ 10 ° från horisontellt läge (i huvudsak parallellt med krökning av rygg näthinnan), tryck mikropipett genom RPE så att spetsen är mellan RPE och yttre näthinnan skikt. Utvisa ~ 0,1-0,4 l DNA-lösning på detta utrymme, grön vätska bör observeras att fylla hela utrymmet och läcker ut genom hålet i RPE. Upprepa injektionen för kontralateral näthinnan.
7. Försiktigt men snabbt ta bort stiften och (hålla huvudet nedsänkt i PBS) plats paddlar elektroden runt huvudet, med den positiva (+) paddla på den ventrala sidan av huvudet. Leverera fyra 40-V, 50 ms pulser vid 60 Hz, placera sedan huvudet bakåt i en skål med DMEM/F12 på is (figur 2).
   
8. Upprepa steg 5-7 för alla huvuden och för alla DNA-lösningar. Efter avslutad electroporations, tillsätt ~ 1,5 ml av syresatt SFM lösning till en 4-väl rätt och hålla på is (en brunn för varje enskild injiceras DNA-lösning).
9. Överför ett huvud till ett dissekera skålen med DMEM/F12, med en näthinnan uppåt. På ventrala näthinnan (eller motsatt sida målregion), använd bra pincett för att knipaoch riva ett hål i RPE. Sätt i ena änden av pincetten genom detta hål att skala RPE bort från näthinnan, speciellt på linsen-näthinnan korsning. Skär inte eller skada på näthinnan eftersom detta kommer att orsaka näthinnan att kollapsa på sig själv under inkubationstiden. Efter att RPE Använd pincett för poppa ut näthinnan genom att nypa synnerven vid basen av näthinnan (lämna objektivet intakt). Överföring retinae till oxygenerade SFM. Vänd huvudet över och upprepa för kontralaterala ögat.
10. Komplett steg 9 för alla electroporated huvuden. Inkubera näthinnan i syresatt hållbart skogsbruk på 37 ° C i 40-48 timmar.

Del 3b: Ex vivo-retinal elektroporering Skörd och plätering av GFP + retinala explants (2 dagar efter elektroporation)

1. Överför alla retinae från en brunn av syresatt SFM i en petriskål lock med DMEM/F12. Välj ett näthinnan och använda fluorescerande dissekera möjligheter att visualisera GFP + (grön) delen av näthinnan.
2. Med hjälp av en microscalpel och pincett, dissekera och kasta den icke-GFP + del av näthinnan så att endast en GFP + bit av näthinnan kvarstår. Det är bra att ständigt växla mellan lysrör och vanliga ljus i hela dissekering att specifikt välja GFP + näthinnan. Överför GFP + näthinnan till en brunn med DMEM/F12.
3. Upprepa steg 2 för alla näthinnan från en brunn. För varje DNA-tillstånd (varje olika bra), använd en ny petriskål och DMEM/F12 medium.
4. Dessa GFP + retinae måste nu dissekeras i mindre näthinnan explants för plätering. Enligt en dissekera omfattning, skär stor bit av GFP + näthinnan i mindre explants med microscalpel. Explants bör vara rektangulär, ~ 200-300 nm i längd och bredd. Samla alla explants i en brunn med DMEM/F12. Ett GFP + bit av näthinnan ska producera ~ 4-10 GFP + näthinnan explants beroende på vävnad storlek. Upprepa detta steg för alla GFP + näthinnans regioner som har skördats.
5. Efter att förbereda alla GFP + retinal explants, tillsätt 250 ìl av SFM + 0,4% metylcellulosa (förvaras vid 4 ° C) till laminin-belagd kultur rätter (se del 1). Överföring 4-8 GFP + explants till kulturen skålen och använda pincett för att försiktigt ordna explants i en polygon med explants ligger halvvägs mellan mitten och kanten av skålen.
6. Bestäm vilken sida av Explantation är RGC lagret. Ibland RPE kristaller kvar på den yttre näthinnans skikt, vilket indikerar att den motsatta sidan är RGC lagret. Dessutom har RGC sidan oftast någon cellulära skräp som kan hjälpa på rätt Explantation orientering.
7. Med RGC skikt ner, använd pincett för hårt tryck i mitten av Explantation så att den kommer att följa glaset täckglas. En fördjupning i Explantation från pincett kan vara synliga, detta är normalt.
8. Efter förkromning alla explants på en kultur fat, överföring till ett 37 ° C inkubator. Retinal axoner är först observeras 4-6 timmar efter bordläggning och explants förblir friska i flera dagar, men betydande igenväxning kan inträffa efter 24 timmar. Explants kan användas för ett flertal in vitro, fast med 4% PFA i 30 minuter och immunostained (figur 2).

Border-analys

8. Alternativt, för över 4 GFP + explants till en maträtt som har förberetts för gränsen analysen (se del 1). Ordna explants i en vertikal linje i mitten av skålen, närma var gränsen.
9. Enligt en fluorescerande dissekera mikroskop, platta de explants så att de är ~ 50-150 mm från fluorescerande gränsen. Inkubera rätter vid 37 ° C i 24 timmar, så gott om tid för RGC axoner att nå gränsen substrat. Explants kan fixeras i 4% PFA i 30 minuter, följt av immunfärgning (Figur 2).

Representativa resultat

Discussion

I den här filmen har vi visat elektroporation tekniker, både in utero och ex vivo, till genen leverans till embryonala murina RGC: er. I livmodern retinala elektroporation tillhandahåller en mekanism för att manipulera genuttryck i RGC: er och visualisera sina axonet prognoser in vivo. Att låta embryon att överleva efter födseln tillåter granskning av dessa GFP + RGC prognoser in i deras mål, i sidled geniculate kärnan (LGN). Ex vivo-retinal elektroporering ger en mer kontrollerad förmåga att rikta specifika näthinnans regioner för användning med in vitro. Kombinera in vivo och in vitro-analyser från dessa tekniker möjliggör noggrann karakterisering av RGC utveckling och prognoser axonet i en delmängd av RGC: er i en annars normal bakgrund. Medan vår demonstration fokuserar på RGC axon vägledning på synnerven chiasm, både in utero och ex vivo näthinnan electroporations skulle kunna vara till nytta för att studera hur störningar i genuttryck effekt RGC differentiering, dendritiska morfologi, elektrofysiologiska egenskaper, synaps bildning och rätt inriktning i uppsägning områden såsom som LGN och överlägsen colliculi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)	Harvard Apparatus	450052
Round tweezer electrodes	Nepa Gene	CUY650-5 or CUY650-7
Silk Sutures	Henry Schein	101-2636
Glass micropipettes with plungers	Drummond Scientific	5-000-1001-X10
Antibiototic-antimycotic	Invitrogen	15240096
DMEM/F12 medium	GIBCO, by Life Technologies	11330057
Albumin bovine serum	Sigma-Aldrich	A8806-5G
ITS supplement	Sigma-Aldrich	I-1884
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015