Summary
השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון הלבלב האנושי (חלק II: טיהור והתרבות של איים אדם) באמצעות שיטה אוטומטית שונה.
Abstract
ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת
Protocol
1. טיהור איים
- כדי להתחיל בהליך טיהור איון, עומס את התיק COBE, מהדק את כל הצינורות מלבד צינור ירוק, ולהגדיר את המהירות ל 1500 ואת סופר יצא 0.
- בשכונה להגדיר את כוסות המשאבה ואת שיפוע ולחבר את צינורות אוסף הצינור הירוק.
- עכשיו הטעינה של ficoll 1.100 יכולים להתחיל: לדחוף "ספין" ואז מוסיפים 110 מ"ל של Ficoll 1.100 אל כוס הקדמי, ולהתחיל את המשאבה על מנת לטעון את התיק COBE. ככל Ficoll נטען, לחצו סופר החוצה, לעצור את המשאבה, unclamp ראש משאבה ולהגדיר את מהירות החוצה סופר 100.
- כאשר ficoll מגיע כוס וכל האוויר הוא גורש מן מהדק מחדש, צינורות בראש המשאבה. קבע את מהירות הסחיטה עד 3000, ואת המהירות החוצה סופר 0.
- עכשיו להתכונן לטעון את הדרגתיים ידי שפיכת שיפוע כבד לתוך כוס הקדמי. קצת לשחרר את מהדק בין שתי כוסות כדי להסיר כל האוויר. ואז לשפוך את צבע האור לתוך כוס האחורי.
- הפעל stirrer המגנטי, הקש "ספין" על מכונת COBE, להסיר את מהדק מהצינור המחבר בין שני כוסות, ו חזותית לוודא הדרגתיים כבד וקל הם ערבוב.
- לאחר הדרגתיים החל ערבוב, להפעיל צנטריפוגות. המתן דקה אחת ולאחר מכן להפעיל את המשאבה כדי לטעון את הדרגתיים ערבוב.
- כדי לטעון הרקמה לתת שיפוע לאזול בכוס הקדמי, אך לא נמוך מספיק כדי לאפשר לאוויר להיכנס שפופרת הטעינה, אז reclamp הצינור המחבר את כוסות לטעון את הרקמה.
- ממשיכים להוסיף את שאר הרקמות. ואז לשטוף את הצינור שהחזיק את הרקמה עם 50 מ"ל של תמיסת לשטוף, ולהשתמש בו כדי לשטוף את הגביע הראשון.
- כמו האחרון של רקמות נכנס את התיק, בו זמנית לעצור את המשאבה, unclamp בראש המשאבה, מהדק צינורות מעל התיק. המשך צנטריפוגות במשך 5 דקות.
- בעוד צנטריפוגה ממשיך להביא את 12 צינורות האוסף מכסה המנוע לשחרר את כובעיהם. חבר את צינורות אוסף צינור צהוב, מקום קצה אוסף סטרילי לתוך צינור חרוטי 1. ואז unclamp צינור צהוב, מהדק את הצינור הירוק.
- כאשר הסיבוב מסתיים, לאט להעלות Superout עד 100. איסוף 150 מ"ל בשפופרת 1. ואז לאסוף 30 מ"ל צינורות 2-12 (מ 200-230 מ"ל).
- לאחר איסוף תושלם, לדחוף "עצור" על COBE. עכשיו טיהור כי הסתיימה, איים ניתן להעריך ותרבותי.
2. דגימה ותרבות
- לאחר איסוף שברים מטוהרים איים, להסיר דגימה מכל אחד 12 צינורות איסוף כתם עם Dithizone. מכתים יציג שהם מכילים שכבות איים הטוהר גבוהה לעומת שכבות עם איונים טוהר נמוך.
- איסוף רקמת טוהר גבוה ונמוך ובריכת כל ביחד.
- ספין ולשטוף פעמיים. לאחר לשטוף את השני, להביא את עוצמת הקול של כל אחד 250 מ"ל עם התקשורת לשטוף הסופי.
- כדי להעריך את השברים ונקווה להתחיל על ידי לקיחת שני 1 מ"ל דגימות מן הגבוהים של שברים ונקווה ואחד מדגם 1 מ"ל מן נמוכה. העברת כל מדגם 1ml לתוך צינור חרוטי המכיל 9 מ"ל של תמיסת לשטוף.
- ואז להעביר 1 מ"ל מהצינור 15 מ"ל כל אחד לצלחת הספירה. לבחון לספור את התאים תחת מיקרוסקופ.
- לאחר ספירת התאים לחשב את מספר צלוחיות צורך בתרבות איים באמצעות הנוסחה הבאה: (EIN טוהר בסך הכל / של איונים ב העשרונית) / (30,000 עין לכל בקבוק). לדוגמה, 100,000 איים עם טוהר 90% הם בתרבית 4 צלוחיות.
- העברת איים על T175 צלוחיות והתרבות 37 ˚ C ו 5% CO 2 באינקובטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות התקדמות משמעותית בשיטות של בידוד איון אדם, תשואה איון להישאר משתנה מאוד ובלתי צפוי. טיהור של רקמת לבלב מתעכל הוא חיוני כדי להתאושש מסה האי מספיק לאחר עיכול אנזימטי מוצלח להשתלה. שיטת טיהור UIC מומלץ כי התאוששות מעולה של איים אדם טהור מאוד הודגם באמצעות שיטה זו. יתר על כן, עד 50 מ"ל של רקמת מעוכל יכול להיות טעון Cobe יחיד לרוץ לטיהור, ובכך לצמצם את איסכמיה הקשורים פציעה של איים אדם על ידי קיצור הזמן הכולל המשמש לבידוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
נתמך על ידי המייסדים מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
