Summary
Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть II: очищение и культуре человеческих островков) с помощью модифицированного метода автоматизированного.
Abstract
Управление диабетом 1 типа является обременительной, как для личности и общества, стоимостью более 100 миллиардов долларов в год. Несмотря на широкое использование мониторинга уровня глюкозы и новые формулировки инсулина, многие люди по-прежнему развиваться разрушительных вторичных осложнений. Трансплантация островков поджелудочной железы может восстановить около нормы контроля уровня глюкозы у больных сахарным диабетом
Protocol
1. Очистка островков
- Для запуска процедуры очистки островок, нагрузка COBE сумка, зажим все пробирки, кроме зеленой трубки и набор скорости до 1500 и супер из 0.
- В капотом создан насос и градиент стаканы и подключить трубку к коллекции зеленого трубки.
- Теперь загрузка Ficoll 1,100 можете начать: нажмите "спина", а затем добавить 110 мл Ficoll 1,100 на фронт стакан, и включите насос для загрузки COBE сумку. Как Ficoll загружен, нажмите супер вне, остановить насос, разжимать насоса и установить супер скорость на выходе до 100.
- Когда Ficoll достигает стакан и весь воздух выталкивается из трубки, повторно зажим насоса на голову. Установите скорость вращения до 3000, и супер скорость на выходе до 0.
- Сейчас готовятся к нагрузке градиентов при заливке тяжелых градиент в передней стакан. Слегка отпустите зажим между двумя стаканами, чтобы удалить воздух. Затем влить светлый градиент в спину стакан.
- Включите магнитной мешалкой, нажмите кнопку "спина" на COBE машины, удалите клеммы из трубки, соединяющей два стакана, и визуально убедиться, что тяжелые и легкие градиенты смешивания.
- Как только началась смешивания градиентов, включить центрифугу. Подождите одну минуту, а затем включить насос для загрузки смешивания градиентов.
- Чтобы загрузить ткани пусть градиент иссякнет в передней стакан, но не достаточно низко, чтобы позволить воздуху войти загрузки трубы, то reclamp трубка, соединяющая стаканы и нагрузки ткани.
- Продолжайте добавлять остальные ткани. Затем промыть трубы, которая состоялась ткани с 50 мл моющего раствора, и использовать его для мытья перед стакан.
- Как последний из ткани входит сумка, одновременно остановить насос, разжимать на головку насоса, и зажим трубки над сумкой. Продолжайте центрифуги в течение 5 минут.
- Хотя центрифугирование продолжается, приносят 12 пробирок коллекцию капот и ослабьте шапки. Прикрепить коллекции трубки к трубке желтый, и место стерильным наконечником коллекцию в конической трубе 1. Затем разжимать желтой трубкой и зажимом зеленые трубки.
- Когда спина концов, медленно поднимите Superout до 100. Сбор 150 мл в трубке 1. Затем собрать 30 мл в пробирки 2-12 (от 200-230 мл).
- Как только сбор завершится, нажмите кнопку "STOP" на COBE. Теперь, очистки закончилась, островки можно оценить и культурным.
2. Отбор проб и культуры
- После сбора очищенной островков фракций, удалить образцы из каждой из 12 пробирок сбора и пятно дитизона. Окрашивание покажет, какие слои содержат высокие островки чистоты против слоев с низким островки чистоты.
- Сбор высокого и низкого ткани чистоты и бассейн каждый вместе.
- Спин и мыть дважды. После второго мытья, довести объем каждой до 250 мл с финальным СМИ промыть.
- Для оценки объединенных фракций начнем с того, два 1 мл образцы с высоты объединенных фракций и один 1 мл образца от низкой. Передача каждого образца в 1 мл коническую трубку с 9 мл моющего раствора.
- Затем перенесите 1 мл из каждого 15 мл трубки подсчета блюдо. Изучить и посчитать клетки под микроскопом.
- После подсчета клетки рассчитать количество необходимых для колб культуры островков по следующей формуле: (всего EIN / чистоты островков в десятичной системе) / (30 000 EIN в колбу). Например, 100 тысяч островков с 90%-ной чистоты культивируются в 4 колб.
- Передача островки для T175 колб и культуры в 37 ˚ С и 5% СО 2 инкубатора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на значительные достижения в области техники человеческой изоляции островок, островок доходность остается очень изменчива и непредсказуема. Очистка переваривается ткани поджелудочной железы имеет решающее значение для восстановления достаточную массу остров после успешного ферментативного пищеварения для трансплантации. МСЖД метод очистки рекомендуется, потому что превосходное восстановление высокой чистоты человеческих островков было продемонстрировано с помощью этого метода. Более того, до 50 мл переваренной ткани могут быть загружены в одно Cobe запустить для очистки, таким образом минимизируя ишемии связанных травма человека островков за счет сокращения общего времени используется на изоляцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Поддерживаемые основав из университета Иллинойса в Чикаго, а также островковых клеток ресурсный центр NIH грант (RFA-RR 05-003), Кристофер Фонда Efroymson Фонда, а Фонд Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
