Summary
Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d'îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.
Abstract
Gestion diabète de type 1 est lourde, tant pour l'individu et la société, ce qui coûte plus de 100 milliards de dollars annuellement. Malgré l'utilisation répandue de la surveillance du glucose et des préparations d'insuline nouvelles, de nombreuses personnes encore développer des complications secondaires dévastateurs. Transplantation d'îlots pancréatiques peut restaurer à proximité de contrôle de la glycémie normale chez les patients diabétiques
Protocol
1. Purification des îlots
- Pour lancer la procédure de purification d'îlots, de charger le sac de COBE, pince tous les tubes sauf le tube vert, et définir la vitesse de 1500 et le super à 0.
- Dans la hotte mis en place les gobelets de la pompe et du gradient et de connecter le tuyau de collecte sur le tube vert.
- Maintenant le chargement du ficoll 1,100 peut commencer: push "spin", puis ajouter 110 ml de Ficoll 1.100 dans le bécher avant, et démarrer la pompe, afin de charger le sac de COBE. Comme le Ficoll est chargé, appuyez sur Super, arrêter la pompe, desserrer la tête de pompe et régler la vitesse des super 100.
- Lorsque le ficoll atteint le bécher et tout l'air est expulsé de la tubulure, re-clamp à la tête de pompe. Réglez la vitesse d'essorage de 3000, et la vitesse des super-0.
- Maintenant se préparent à charger les dégradés en versant le gradient lourds dans le bécher avant. Légèrement libérer la pince entre les deux béchers pour enlever tout l'air. Puis versez le gradient de la lumière dans le bécher dos.
- Tournez sur l'agitateur magnétique, appuyez sur «spin» sur la machine COBE, enlever le collier du tube reliant les deux béchers, et vérifier visuellement que les gradients de lourdes et légères sont un mélange.
- Une fois les gradients commencé à mixer, mettez la centrifugeuse. Attendez une minute, puis rallumez la pompe à charger les gradients de mélange.
- Pour charger le tissu laisse le gradient s'épuiser dans le bécher avant, mais pas assez bas pour laisser l'air entrer dans le tube de chargement, puis reclamp le tube qui relie les béchers et charger les tissus.
- Continuez à ajouter le reste du tissu. Puis, lavez le tube qui a tenu le tissu avec 50 ml de solution de lavage, et l'utiliser pour laver le bécher avant.
- Comme le dernier des tissus entre dans le sac, en même temps arrêter la pompe, desserrez à la tête de pompe, tuyau et pince-dessus du sac. Continuer à centrifuger pendant 5 minutes.
- Alors que la centrifugation continue, mettre les 12 tubes de prélèvement sur le capot et desserrer les bouchons. Fixez le tube de collecte dans le tube jaune, et placez le bout de prélèvement stérile dans le tube conique 1. Puis desserrez le tube jaune, et serrer le tube vert.
- Lorsque la rotation se termine, soulevez lentement Superout à 100. Recueillir 150 ml dans le tube 1. Ramassez ensuite 30 ml dans des tubes de 2-12 (200 à 230 ml).
- Une fois la collecte terminée, appuyez sur "STOP" sur le satellite COBE. Maintenant que la purification est terminée, les îlots peuvent être évalués et mis en culture.
2. L'échantillonnage et la culture
- Après la collecte des fractions purifiées d'îlots, prélever un échantillon de chacun des 12 tubes de collecte et de tache avec dithizone. La coloration va montrer quelles sont les couches contiennent des îlots de grande pureté vs couches avec des îlots de faible pureté.
- Recueillir les tissus de haute pureté et faible et piscine chaque ensemble.
- Spin et laver deux fois. Après le second lavage, porter le volume de chaque à 250 ml avec les médias lavage final.
- Pour évaluer les fractions regroupées commencer par prendre deux échantillons de 1 ml de la haute de l'fractions regroupées et un échantillon de 1 ml à partir du bas. Transférer chaque échantillon de 1 ml dans un tube conique contenant 9 ml de solution de lavage.
- Puis transférer 1 ml de chaque tube 15 ml pour une boîte de comptage. Examiner et compter les cellules sous le microscope.
- Après avoir compté les cellules calculer le nombre de flacons nécessaires à la culture des îlots en utilisant la formule suivante: (EIN total / pureté des îlots en décimal) / (30000 EIN par flacon). Par exemple, 100 000 îlots de pureté de 90% sont cultivées dans 4 flacons.
- Transfert des îlots au T175 flacons et la culture dans un 37 ˚ C et 5% de CO 2 incubateur.
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Discussion
En dépit des progrès significatifs dans les techniques d'isolement d'îlots humains, le rendement des îlots restent très variable et imprévisible. Purification du tissu pancréatique digérée est crucial de récupérer une masse suffisante Isle après digestion enzymatique de succès pour la transplantation. Le procédé de purification UIC est recommandée, car une reprise supérieure de très grande pureté îlots humains a été démontré en utilisant cette méthode. Par ailleurs, jusqu'à 50 ml de tissu digéré peut être chargé dans une seule Cobe courir pour la purification, minimisant ainsi l'ischémie associée blessures des îlots humains en raccourcissant le temps total utilisé sur l'isolement.
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Acknowledgments
Soutenu par la fondation de l'Université de l'Illinois à Chicago ainsi que des cellules des îlots Resource Center subvention du NIH (RFA-05-003 RR), la Fondation Christopher, la Fondation Efroymson, et la Fondation Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt Ltd | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech, Inc. | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
